ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

この手順は、高品質のRNAのテンプレートから合成されたCDNAから始まります。CDNAは、最初に蛍光色素SI3で標識されます。標識反応が完了すると、標識されたCDNAが精製され、単離され、標識反応の品質が評価されます。

次に、標識されたCDNAをマイクロアレイにハイブリダイズします。ハイブリダイゼーション後、アレイを解析して、サンプル中の遺伝子発現の相対レベルを決定します。こんにちは、私の名前はパデュー大学健康科学部のジェニファー・フリーマン博士の研究室のサム・ピーターソンです。

以前、ゼブラフィッシュの胚からRNAを抽出し、そのRNAをCDNAに変換する方法を紹介しました。本日は、そのCDNAをゼブラフィッシュ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイプラットフォームに標識してハイブリダイズし、グローバルな遺伝子発現プロファイルを研究する手順をご紹介します。通常、この手順を使用して、毒素への曝露に応答する遺伝子発現の違いを研究します。

それでは始めましょう。マイクロアレイ実験では、バイオプライムアレイCGHゲノムラベリングシステムの次のコンポーネント、2.5 xランダムプライマーバッファー、10 X-D-C-T-Pミックス、およびヌクレアーゼフリーウォーターでCD NAのラベリングを開始するために、ラベリングに使用される蛍光色素SI 3の光分解を防ぐために最小限の光環境が必要です。また、解読後にDCTPと標識したSI3の1ミリモルストックを解凍し、厚さ0.6ミリリットルのチューブを合わせて短時間遠心または試薬を

500ナノグラムのCDNA 40マイクロリットル、2.5 xランダムプライマーバッファー、およびヌクレアーゼフリー水を使用して、総容量86マイクロリットルを達成します。よく混合して短時間遠心分離し、サーモサイクラーで摂氏100度で反応を5分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、直ちに反応を氷浴スラリーに10分間移します。

次に、exo DNAポリメラーゼを冷凍庫から取り出し、氷の上に置きます。次に、10マイクロリットルの10マイクロリットルのX-D-C-T-Pを混合し、2マイクロリットルの1ミリモルSI 3D CTPと2マイクロリットルのXOクリーンアウトDNAポリメラーゼをよく混合し、短時間遠心分離します。最後に、反応を摂氏37度で16時間インキュベートし、標識が終了したらサーモサイクラーでインキュベートします。

ラベル付けされたCDNAのクリーンアップと沈殿に進みます。ラベル付きCDNAのクリーニングを開始します。MicroConカラムを1.5ミリリットルのチューブに入れます。

カラムに0.1 XSSC以上の300マイクロリットルを加え、標識反応を加えます。カラムを 16, 100 G で 4 °C SIU で 10 分間遠心分離します。フロースルーが薄いピンク色になる場合があることに注意してください。

流入を破棄し、さらに 300 マイクロリットルの 0.1 XSSE をカラムに加えます。次に、16,100Gで4°Cで10分間遠心分離を繰り返します。再度、流れを捨て、カラムにさらに300マイクロリットルT 0.1 XSSCを追加し、この最後の洗浄後、16、100 Gで摂氏4度で12分間遠心分離します。

フロースルーは明確で、ピンク色のラベル付きCDNAがカラムに見える必要があります。再度、この最終洗浄からのフロースルーを廃棄して、ラベル付きのCDNAを回避します。100マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をカラムに加えます。カラムをマイクロ遠心分離管から取り出し、逆さまにして新しいチューブに入れます。

次に、逆カラムを2,300Gで摂氏4度で2分間遠心分離します。標識されたCDNAは、チューブの底の水に溶解します。製造元の指示に従って、NanoDrop ND 1000分光光度計を使用して、前述のCDNAを確認します。

DNA濃度を計算し、添付の書面によるプロトコルに記載されているように色素の取り込みを評価します。CDNAが十分に標識されている場合は、新しいチューブに6マイクログラムを入れて、標識したCD NA混合物をpH 5.2および1 x容量の3モル酢酸ナトリウムのnaut 0.1容量に沈殿させます。イソプロパノールを室温で30分間暗所でインキュベートします。

この時点までのすべての手順は、最小限の光環境で実行されていることを念頭に置いてください。次に、サンプルを16,100Gで室温で20分間遠心分離します。遠心分離後、ピンク色のDNAペレットを乱さずにSUPナタントを慎重に廃棄してください。

最後に500マイクロリットル、70%エタノールを加えて洗浄し、16,100Gで5分間穏やかな反転遠心分離機で混合します。室温で、仰臥位を取り出し、チューブを反転させ、ペレットを5分間乾燥させます。標識されたCDNAはハイブリダイゼーションの準備ができています。

ハイブリダイゼーションを開始する前に、機敏なジェネレーションハイブリダイゼーションシステムをオンにし、摂氏42度まで平衡化させます。まず、標識したCD NAペレットを5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に溶解し、溶解したペレットに溶解します。Roche Nimble Gen HybridizationキットのハイブリダイゼーションコンポーネントであるハイブリダイゼーションバッファーハイブリッドAおよびアライメントオリゴを、添付の書面によるプロトコルに概説されているように、総容量18マイクロリットルまで追加します。

よく混ぜ、チューブを短く回転させて内容物を底に集めます。次に、チューブを摂氏95度で5分間置くことにより、標識されたCDNAを変性させます。アレイの準備ができるまで、チューブをすぐに機敏なゲンハイブリダイゼーションシステムに移します。

マイクロアレイは慎重に取り扱い、保管する必要があることに注意してください。Rocheの機敏なゲンアレイは、室温で乾燥剤を使用して暗所で保管されます。アレイをプレシジョンミキサーアライメントツールにロードします。

PMA Tは、X one mixerをPMA Tにロードし、鉗子で接着剤ストリップを取り外します。アレイとミキサーをロードした状態で、PMATをしっかりと閉じます。次に、PMA tの穴からミキサーに圧力を加えて、アレイとミキサーをPMA Tから切り離します。

最後に、ブレイヤーを使用してミキサーの外側に圧力をかけ、アレイが密閉されていることを確認し、気泡を取り除きます。次に、アレイミキサー複合体をハイブリダイゼーションシステム上に置き、温め、CDNAサンプルをアレイにロードします。変位パーペットをゆっくりと、安定した圧力で使用します。

ラベル付けされたサンプルの15マイクロリットルをミキサーの中央にある充填ポートに追加します。ポートホールから余分なサンプルを拭き取り、粘着ストリップで密封します。次に、ラッチを閉じます。

次に、機敏な遺伝子ハイブリダイゼーションシステムのプログラムBを使用してハイブリダイゼーション溶液の混合を開始します。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションが完了に近づくと、マイクロアレイを洗浄し、スキャンする。遺伝子ピック4、000 Bアレイスキャナーをオンにしてスキャンの準備をし、約15分間ウォームアップします。

次に、添付の書面によるプロトコルに概説されているように、洗浄バッファー1 A、1 B、2、および3を調製します。戦前の洗浄バッファーは1つのAから摂氏42度ですが、他のバッファーは室温のままにします。ウォッシュバッファー1Aが温まったら、皿に注ぎます。

スライドラックをウォッシュバッファー1に沈めます B.次に、アレイミキサーコンプレックスを機敏なジェネレーションハイブリダイゼーションシステムから取り外し、ジグにスライドさせます。アセンブリを予温洗浄バッファー1Aに沈めて洗浄を開始し、スライドから剥がしてミキサーを慎重に取り外します。次に、アレイを治具から取り外し、ウォッシュバッファー1Aで15秒間撹拌します。ウォッシュバッファ1Bに沈めたスライドラックにアレイをすばやく移し、スライドラックを2分間激しく攪拌します。

次に、スライドラックを洗浄バッファー2に移し、1分間撹拌します。最後に、スライドラックを洗浄バッファー3に移し、15秒間撹拌します。アレイをスライド乾燥遠心分離機に移し、遠心分離後2分間回転させてワッシャーを仕上げます。

Dが光とオゾンに敏感であるため、アレイをすぐにスキャンし、アレイバーコードを遺伝子ピック4、000 Bアレイスキャナーにロードしてスキャンを開始します。ハードウェア設定ダイアログボックスセットでは、532ナノメートルレーザーのPMT値は500に設定され、パワーは100%ピクセルサイズを5ミクロンに設定し、ラインは平均を1に、フォーカス位置はゼロミクロンに設定されています。設定が完了したら、アレイをプレビューします。

スキャンする領域を選択してスキャンします。スキャンが完了したら、画像のヒストグラムを確認します。理想的には、1つのEから5つの正規化されたカウントを引いたものは、65, 000の飽和限界にあるべきであり、これは特徴の約1〜2%が飽和していることを意味します。

正規化されたカウントが 1 E から 5 を引いた値より小さい場合は、PMT ゲインを増やしてスライドを再スキャンします。正規化されたカウントが 1 から 5 を引いた値より大きい場合は、PMT ゲインを下げてスライドを再スキャンし、画像を保存し、データ分析プログラムを使用してデータの正規化と強度値の計算を行います。標識反応では、少なくとも10マイクログラムの標識CDNAが定期的に生成されます。

色素の取り込みは、ヌクレオチドとSIの3つの比率がA、2、60、5、50の比率に23ポイント15を掛けたものに等しい単純なベース色素の比率を使用して計算できます。良い反応は、50から80の間の値になります。許容可能なハイブリダイゼーションは、飽和収率の1〜2%の特徴を有するであろう。

1 つの E から 5 を引いた正規化されたカウントは、65, 000 の飽和制限でカウントされます。PMT値を設定すると、マイクロアレイのスキャン画像を表示し、アレイ上の他の特徴に対する整列したオリゴの強度を評価することにより、500に近いハイブリダイゼーションの品質を定性的に評価することもできます。スキャンされた画像は、アレイ領域内の特定のスポットやほこりのスポットについても評価する必要があります。

その後の解析では、散布図を使用して解析データを画像化し、サンプル中の遺伝子発現の相対レベルを決定し、発現差のある遺伝子を同定することができます。差次的に発現する遺伝子は、補完的な手順でベストフィットラインから大幅に逸脱します。ゼブラフィッシュの胚からRNAを抽出して、c CD NAを合成する方法を紹介しました。ここでは、CD NAを標識してオリゴヌクレオチドマイクロレイプラットフォーム上にハイブリダイズし、全体的な遺伝子発現プロファイルを研究する方法を紹介しました。

この手順を行うときは、常に高品質のCD NAを使用し、サイト3染料を直接照明にさらさないようにすることを忘れないでください。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。