ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

この手順は、高品質のRNAテンプレートから合成されたcDNAから開始します。まず、cDNAを蛍光色素Cy3で標識します。標識反応の完了後、標識されたcDNAを精製・単離し、標識反応の品質を評価します。

次に、ラベル化されたCDNAをマイクロアレイにハイブリダイズさせます。ハイブリダイゼーション後、アレイを解析してサンプル中の遺伝子発現の相対レベルを決定します。こんにちは、私はパデュー大学ヘルスサイエンススクールのJennifer Freeman博士の研究室のSam Petersonです。

以前に、ゼブラフィッシュ胚からRNAを抽出し、そのRNAをcDNAに変換する方法について説明しました。今回は、全遺伝子発現プロファイルを解析するために、そのcDNAをラベル化し、ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドマイクロアレイプラットフォームにハイブリダイズさせる手順を紹介します。通常、この手法は毒性物質への曝露に応じた遺伝子発現の変動を研究するために用いられます。

それでは開始しましょう。マイクロアレイ実験では、ラベル付けに使用する蛍光色素Cy3の光分解を防ぐため、低照度環境が必要です。まず、BioPrime Array CGH Genomic Labeling Systemの構成成分である2.5x random primer buffer、10X dCTP mix、およびnuclease-free waterを解凍します。さらに、1 mMのCy3標識dCTPストック溶液も解凍してください。解凍後、各試薬を軽く遠心分離し、0.6 mLの厚壁チューブに混合します。

500 nanogramsのCDNA 40 microliters、2.5 x random primer buffer、およびヌクレアーゼフリー水を加え、全量を86 microlitersにします。よく混ぜて軽く遠心分離した後、サーモサイクラーを用いて100 °Cで5分間インキュベートします。インキュベーション終了後、直ちに反応液を氷水スラリーに移し、10分間冷却します。

次に、exo DNA polymeraseをフリーザーから取り出し、氷上に置きます。その後、反応チューブに10 X-D-C-T-P Mixを10 µL、1 mM SI 3D CTPを2 µL、およびXO cleanout DNA polymeraseを2 µL加え、十分に混合して軽く遠心分離します。最後に、反応液をサーモサイクラーを用いて37 °Cで16時間インキュベートし、標識を完了させます。

標識したcDNAの精製および沈殿操作を行います。まず、標識したcDNAを精製するため、MicroConカラムを1.5 mLチューブに入れます。

カラムに0.1 XSSCを300 µL加え、続いてラベル化反応液を加えます。カラムを4 °Cで16,100 ×gにて10分間遠心分離します。通り抜けた液（フロースルー）が淡いピンク色になる場合があることに注意してください。

フロースルーを廃棄し、さらに 300 µL の 0.1 X SSC をカラムに加えます。その後、4 °C で 16,100 ×g、10 分間の遠心分離を繰り返します。再びフロースルーを廃棄し、さらに 300 µL の 0.1 X SSC をカラムに加え、この最後の洗浄後、4 °C で 16,100 ×g、12 分間の遠心分離を行います。

通りぬけ液は透明であり、カラム上にはピンク色のラベル付きCDNAが確認できるはずです。再度、この最終洗浄の通りぬけ液を廃棄し、ラベル付きCD NAを溶出させます。カラムに100 µLのヌクレアーゼフリー水を加えます。カラムをマイクロ遠心チューブから取り出し、新しいチューブに逆さに挿入します。

次に、逆向きにしたカラムを4°Cで2,300 G、2分間遠心分離します。ラベル付けされたCDNAは、チューブ底部の水に溶解しています。製造元の指示に従い、NanoDrop ND 1000分光光度計を用いて、得られたCDNAを確認してください。

付属の書面プロトコルに従って、DNA濃度を算出し、色素の取り込みを評価します。cDNAが十分に標識されている場合は、6 µgを新しいチューブに移し、0.1倍量の3 M 酢酸ナトリウム（pH 5.2）および1倍量のイソプロパノールを加え、室温の暗所で30分間インキュベートして標識cDNAミックスを沈殿させます。

ここまでのすべての工程を、最小限の光環境下で実施したことを確認してください。その後、サンプルを室温で16,100 Gにて20分間遠心分離します。遠心分離後、ピンク色のDNAペレットを乱さないように注意して上清を慎重に除去します。

最後に、500 µLの70% ethanolを加えて洗浄し、緩やかに転倒混和した後、16,100 Gで5分間遠心分離します。室温で上清を除去し、チューブを逆さに立ててペレットを5分間乾燥させます。これで、ラベル化されたCDNAがハイブリダイゼーションに使用可能になります。

ハイブリダイゼーションを開始する前に、NimbleGenハイブリダイゼーションシステムを起動し、42 °Cで平衡状態になるまで待ちます。まず、標識されたCD NAペレットを5 µLのヌクレアーゼフリー水に溶解させます。付属の書面プロトコルに記載されている通り、Roche NimbleGen Hybridization kitのハイブリダイゼーション成分（Hybridization buffer hybrid Aおよびアライメントオリゴ）を加え、全量を18 µLにします。

よく混ぜ、チューブを短時間遠心して内容物を底に集めます。次に、チューブを95 °Cで5分間加熱し、ラベル化されたCDNAを変性させます。その後、アレイの準備が整うまで、直ちにチューブをNimbleGenハイブリダイゼーションシステムに移します。

マイクロアレイは、取り扱いおよび保管に細心の注意が必要であることに留意してください。Roche nimble gen アレイは、室温で乾燥剤とともに遮光して保管します。アレイをプレシジョンミキサーのアライメントツールにセットします。

PMA TにX oneミキサーをロードし、ピンセットで粘着ストリップを取り除きます。アレイとミキサーをロードしたら、PMA Tをしっかりと閉じます。次に、PMA Tの穴を通してミキサーに圧力をかけ、アレイとミキサーをPMA Tから切り離します。

最後に、ブライヤーを用いてミキサーの外周に圧力をかけ、アレイが密閉されていることを確認し、気泡を除去します。次に、アレイミキサー複合体をハイブリダイゼーションシステムに設置して加温し、cDNAサンプルをアレイにロードします。ディスプレイスメントピペットは、ゆっくりと一定の圧力をかけて使用してください。

ラベル付けしたサンプル15 µLをミキサー中央の充填ポートに加えます。ポート穴から溢れた余分なサンプルを拭き取り、粘着テープで密封します。その後、ラッチを閉じます。

NimbleGenハイブリダイゼーションシステムのプログラムBを用いて、ハイブリダイゼーション溶液の混合を開始します。マイクロアレイを16〜20時間ハイブリダイズさせます。ハイブリダイゼーションが終了に近づいた時点で、マイクロアレイの洗浄とスキャンを行います。GenePicks 4,000Bアレイスキャナーの電源を入れ、約15分間ウォームアップさせてスキャンの準備をしてください。

次に、付属の書面によるプロトコルに従って、洗浄バッファー1A、1B、2、および3を調製します。洗浄バッファー1Aは42 °Cに予熱し、その他のバッファーは室温のままにしておきます。洗浄バッファー1Aが温まったら、ディッシュに注ぎます。

スライドラックを洗浄バッファー1Bに浸します。次に、NimbleGenハイブリダイゼーションシステムからアレイミキサー複合体を取り外し、ジグにスライドさせます。予め温めておいた洗浄バッファー1Aにアセンブリを浸して洗浄を開始し、ミキサーをスライドから剥がすようにして慎重に取り除きます。その後、ジグからアレイを取り出し、洗浄バッファー1Aの中で15秒間攪拌します。アレイを洗浄バッファー1Bに浸したスライドラックへ速やかに移し、スライドラックを2分間激しく攪拌します。

次に、スライドラックを洗浄緩衝液2に移し、1分間攪拌します。最後に、スライドラックを洗浄緩衝液3に移し、15秒間攪拌します。アレイをスライド乾燥遠心機に移し、2分間遠心分離して洗浄工程を完了します。

Dは光およびオゾンに敏感であるため、直ちにアレイをスキャンしてください。アレイのバーコードを下にしてgene picks 4, 000 Bアレイスキャナーにロードし、スキャンを開始します。ハードウェア設定ダイアログボックスで、532 nanometerレーザーのPMT値を500に設定し、出力を100%、ピクセルサイズを5 microns、平均化ライン数を1、フォーカス位置を0 micronsに設定します。セットアップが完了したら、アレイをプレビューしてください。

スキャンする領域を選択し、スキャンを行います。スキャン完了後、画像のヒストグラムを確認してください。理想的には、1 E-5 の正規化カウントが 65,000 の飽和限界にあり、これは特徴量の約 1～2% が飽和していることを意味します。

正規化されたカウントが1 E-5未満の場合は、PMTゲインを上げてスライドを再スキャンしてください。正規化されたカウントが1 E-5より大きい場合は、PMTゲインを下げてスライドを再スキャンし、画像を保存して、データ解析プログラムを用いてデータの正規化および強度値の算出を行ってください。標識反応では、通常、少なくとも10 µgの標識cDNAが得られます。

色素の取り込み量は、ヌクレオチド対SI 3の比率がA 260対A 550の比率に23.15を乗じた値に等しいという、単純なベース色素比を用いて算出できます。良好な反応では、値が50から80の間になります。許容可能なハイブリダイゼーションでは、フィーチャーの1〜2%が飽和します。

65,000の飽和限界において、1 E-5の正規化カウントとなります。PMT値を約500に設定すると、マイクロアレイのスキャン画像を確認し、アライメントされたオリゴの強度をアレイ上の他のフィーチャーと比較することで、ハイブリダイゼーションの品質を定性的に評価することも可能です。また、スキャン画像を確認し、アレイ領域内に特異的なスポットやダストスポットがないかも評価する必要があります。

その後の解析では、散布図を用いて解析データを可視化し、サンプル間の遺伝子発現の相対的なレベルを決定したり、差発現遺伝子を特定したりすることができます。差発現している遺伝子は、近似線から大きく外れます。補完的な手順として、ゼブラフィッシュ胚からRNAを抽出し、cDNAを合成する方法を解説しました。ここでは、オリゴヌクレオチドマイクロアレイプラットフォームを用いてcDNAを標識し、ハイブリダイズさせることで、包括的な遺伝子発現プロファイルを解析する方法について説明しました。

この手順を行う際は、常に高品質なCD NAを使用し、3色蛍光染料が塗布された部位を直射光にさらさないように注意してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。