単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法

このアッセイで使用したカバースリップは、デキストリンで官能基化され、マイクロ流体フローセルに組み込まれます。次に、各フローセルをリポソームの懸濁液とインキュベートし、リポソームが融合して水和デキストリンの上に脂質二重層を形成します。蛍光顕微鏡下で、フルオロ4標識ウイルスおよびフルオレセイン標識ストレプトアビジンを添加し、ウイルスを二重層にドッキングさせる。

酸性緩衝液の流入により、二重層とのウイルス融合が開始され、デジタルカメラがアッセイ全体の蛍光の変化を記録します。こんにちは、私はダニエル・フロイドで、ハーバード大学の生物化学・分子薬理学部のアナイン・バニアン研究室にいます。今日は、ウイルスの核融合動態を単一粒子レベルで視覚化する方法を紹介します。

この手順を研究室で使用して、ウイルスが宿主細胞に到達する方法を研究しています。それでは始めましょう。このプロトコルは、デキストリン官能化カバースリップを準備することから始めます。

最初のステップは、10%洗剤、1モルの水酸化カリウムアセトン、および100%エタノールの溶液でカバースリップを1溶液あたり30分間超音波処理することです。そして、イオンの合間に脱イオン水ですすいでください。最後の超音波処理の後、カバースリップを水ですすぎ、次に摂氏80度のインキュベーターでそれらを乾燥させます。

次に、カバースリップを酸素プラズマストリッパーに3分間入れます。このステップにより、スライドの表面が酸化され、ガラスが均一に親水性になり、次のサイロ化ステップで反応性になります。次に、カバースリップを0.2%glyオキシプロピルトリメスオキシプロトリムメトキシイソプロパノール中の新しい溶液に浸し、5分間インキュベートします。

次に、カバースリップをイソプロパノールで数回すすぎます。Slanコーティングされたカバースリップを摂氏80度で1時間置きます。このステップを硬化させることで、スランがガラスに共有結合することができます。

硬化後、プラスチック製の冷凍ボックスの内側にカバースリップを平らに置きます。各カバースリップの上面を約1ミリリットルのデキストリン溶液で覆います。水中の体積あたりの重量は30%です。

冷凍ボックスを閉じ、カバースリップを静かな場所に24〜36時間放置します。翌日、余分なデキストリンを注ぎ落とし、プラスチック製の鉗子でカバースリップをつかみ、セラミックラックに戻します。それらを水で数回すすぎ、48時間水に浸します。

容器は、卓上回転子で静かに攪拌し、カバーを80°Cに設定されたオーブンで乾燥させ、次のステップの準備ができるまで真空乾燥で保管することができます。カバースリップをリポソームの混合物でコーティングして、プレーナー二重層を形成します。次のステップは、フード内で脂質二重層を形成するためにリポソームを準備し、クロロホルムに溶解したすべての脂質をガラス試験管に組み合わせることです。

リポソーム製剤には、ウイルス粒子に結合するジア神経節側と、ストレプトアビジン結合pH指示薬フルオレセインに結合するビオチン化脂質が含まれます。次に、アルゴンまたは窒素ガスの流れの下で溶媒を蒸発させます。そして、試験管を真空乾燥させて2時間放置して、残りの溶媒を取り除きます。

乾燥した脂質フィルムを400マイクロリットルのHNE緩衝液に再懸濁します。次に、懸濁液をプラスチック製のマイクロ遠心分離チューブに移します。懸濁液を液体窒素浴で凍結し、温水浴で解凍します。

凍結融解サイクルの後に、この凍結融解サイクルを4回繰り返します。100ナノメートルのメンブレンフィルターを取り付けた脂質押出機を使用して、脂質懸濁液を押し出します。押し出し後25回で、懸濁液はより透明に見えるはずです。

リポソームを室温で保存し、準備の日を使用してください。脂質の準備ができたので、マイクロ流体フローセルを準備します。まず、20 x 20 x 3 mmのクォーツスライドを取り、ダイヤモンドバリを使用して反対側に2つの1mmの穴を開けます。

両面テープのシートから20ミリメートル四方を切り取り、カミソリの刃を使用します。中心から15×2mmの断面を切り取ります。テープの裏地の片面をはがし、テープをコートスライドに接着します。

もう片面を20cmの長さにカットされた機能性カバースリップに接着し、クォーツスライドの穴に挿入します。最後に、フローセルを5分間のエポキシ接着剤でシールします。クォーツスライドの側面に接着剤を広げて、カバースリップに接着します。

さらに2滴の接着剤を使用して、チューブとクォーツスライドの間の接続をシールします。接着剤が硬化したら、フローセルとチューブをHNEバッファーでプライミングします。次に、支持脂質二重層を作成するために、押し出したリポソーム懸濁液を取り、融合実験の前日に約80マイクロリットルをチャネルに引き込みます。

ウイルス粒子のラベル付けを開始して、ウイルスの内部を赤くラベル付けします。新たに調製した20マイクロリットルの硫黄反芻またはSRB溶液を10マイクロリットルのウイルス懸濁液と組み合わせ、室温で20時間放置します。翌日、ウイルス懸濁液をPD 10脱塩カラムに通し、800マイクロリットルのHNEバッファーで希釈して、余分な色素を除去します。

列には、ラベル付けされたウイルスを含む明らかな色付きのバンドが必要です。次に、ellucianステップ中にこの画分を収集し、13マイクロリットルのOctaデカール、RUMINE one 10またはRH one 10 C 18をSRB標識ウイルス懸濁液に追加してウイルスエンベロープを緑色にラベル付けします。チューブを実験室の回転子に取り付けて懸濁液を攪拌し、3時間放置します。

次に、PD 10脱塩カラムを使用して、余分なRH one 10 C 18を除去します。以前と同様に、ウイルスは融合アッセイの準備ができています。高開口油浸対物レンズを装備した蛍光顕微鏡を使用して、融合動力学アッセイを実施します。

アルゴンヌクリプトンレーザーは、ウイルス膜と内部のフルオロフォーを励起します。次に、ダイクロイックミラーが赤と緑の蛍光放射を分割し、電子増倍CCDまたは電荷結合デバイスカメラの別々の半分に画像を独立して焦点を合わせます。カバースリップを顕微鏡ステージに取り付け、アウトレットチューブを毎分100マイクロリットルで流れるように設定されたシリンジポンプに取り付けます。

300マイクロリットルのHNEを流すことにより、過剰なリポソームの流路を清算します。顕微鏡の焦点を合わせ、レーザー出力を調整して、赤い植物相を励起するために488ナノメートルの光の350ワット/センチメートルの2乗で表面を照らし、緑の植物相を励起するために568ナノメートルの光の4および70ワット/センチメートルの2乗で表面を照らします。4。顕微鏡の準備ができたので、ラベル付けされたウイルスを1〜100に希釈したポンプでフローセルに入れます。

ウイルスが流路の底面に拡散すると、粒子がドッキングし始めます。DIA神経節側に張り付き、カバースリップに組み込まれた、平面二重膜。ドッキングされた粒子の密度が視野あたり約数百個の粒子に達すると、ミリリットルあたり2マイクログラムの溶液中を流れ始めます。

フルオレセイン標識ストレプトアビジンは、標識されたストレプトアビジンが二重層のビオチン共役脂質分子に結合するため、pH感受性フルオロフォアです。薄暗い緑色の背景が再び現れ、300マイクロリットルのHNEで流路を洗います。ウイルスがドッキングし、二重層の表面がフルオレセインでコーティングされたので、アッセイを開始します。

イメージングエリアを選択し、顕微鏡の焦点を合わせ、CCDカメラをタイムラプス画像取得に備えます。露光時間を 100 ミリ秒に設定し、10 ヘルツの速度でフレームを収集します。酸性クエン酸ナトリウムバッファーを流すことにより、ウイルス膜融合を開始します。

pHが下がると、フルオレセインの蛍光が暗くなり、酸性化の時期が特定されます。CCDカメラは、アッセイ全体を通してデータを記録し、CCDカメラによって文書化されたヘミ融合と形成不良の時間を決定するために使用できます。pHが下がった後、ウイルス膜とプレーナー膜が融合し、脂質が混ざり合い、ウイルスエンベロープ内の緑色色素が平面膜で希釈されると、緑色の蛍光がバーストします。

対照的に、pH低下後、ウイルス膜と脂質膜が細孔を形成し、ウイルス内部からの赤色色素が平面二重膜の下の水性空間に逃げ込み、視界から消えるにつれて、赤色蛍光が減衰します。これらの傾向は、融合前および融合中の蛍光スナップショットによっても視覚化できます。また、この例に示すように、各粒子の蛍光強度の軌跡をグラフ化すると、Hemi fusion は、緑色の蛍光強度の傾きが最も急な細孔形成になる点を、赤色の蛍光減衰が発生する点として定義します。複数の実験からのデータを組み合わせて、ここに示すように、pH低下の時間tがゼロに等しいときに使用して、異なる実験のデータを同期し、半融合と細孔形成の遅延時間のヒストグラムを生成します。

私はちょうどあなたにウイルスの融合動態を単一の粒子レベルで測定する方法を示しました。この手順を実行する場合。均質で流動的な二重層を持つように、清潔なカバースリップを使用してください。

また、蛍光イメージング中に使用する光の量は最小限にして、写真の損傷を最小限に抑えるようにしてください。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に幸運を祈ります。