Name: 単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: 学ぶ単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法。二色蛍光アッセイを用いてヘミ融合と細孔形成の動態をリアルタイムで可視化し、ウイルス侵入メカニズムの理解を深める。

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作品は、NIHの助成金AI57159（SCH）およびAI72346（AMvOまで）によってサポートされていました。 SCHは、ハワードヒューズ医学研究所の研究者です。

ガラスカバースリップの機能化融合アッセイで使用される平面二重層は、デキストランの水和フィルムでサポートされています。デキストランは、平面二重層とガラス面との間のスペーサーとして機能します。これにより、ガラス表面に付着し、また、ウイルス粒子の内容が融合によって逃げることができるのでスペースを提供するになるから膜成分を防ぎます。ガラス製カバースリップは、ガラス（Elender、 ら、1996）に化学的に結合デキストランに私たちを可能にするシランエポキシ、治療によって官能化される。 <ol><li>セラミック染色ラック25mmのカバーグラスを配置し、jarファイルまたはビーカーにラックを配置。 </li><li>実験室グレードのガラス製品の洗浄剤の10％溶液と容器を埋める。 30分間超音波洗浄器に容器を置きます。 </li><li>脱イオン水と容器とカバーグラスのラックをすすぎ、および1M postassium水酸化補充。別の30分間入浴の超音波処理するコンテナを返します。 </li><li>アセトンとエタノールを使用してこの洗浄手順を繰り返します。 </li><li>水と乾燥でcoverlipsをすすぐ。 </li><li>最後に、3分間の酸素プラズマのストリッパーとカバーグラスを清掃してください。 </li><li>最後の洗浄ステップは、以下のシリル化のステップでガラスが均一に親水性と反応性作り、表面を酸化させる。 </li><li>イソプロパノールで3 -グリシドキシプロピルシランの0.2％溶液を調製します。 5分間この溶液中でカバーグラスを浸し。 </li><li>シラン液を捨て、イソプロパノールでカバーガラスを数回すすいでください。 </li><li>カバースリップは、現在シランの層でコーティングされていますが、ガラスへの共有結合にシランできるように硬化されている必要があります。 1時間80℃に設定したオーブン中でカバーグラスを置きます。 </li><li>カバーガラスが硬化している間、デキストラン500を計り、30％w / v溶液を準備。水を予熱すると溶解する際に役立ちます。我々は、カバースリップあたりこの溶液約1mlを使用します。デキストランが溶解した後、真空デシケーター内の溶液を泡を取り除く。 </li><li>シラン化カバースリップは、硬化が終了したら、セラミックラックから取り出して、プラスチック製の冷凍ボックスの内側に、それらは平らなアレンジ。デキストラン溶液の約1 mlを各カバーの上面をカバーするために1 mlのピ​​ペットを使用してください。フリーザーボックスを閉じ、24〜36時間のための静かな場所におきます。 </li><li>プラスチックピンセットでカバーグラスをつかんで、余分なデキストランを取り除き、セラミックラックにそれらを交換してください。水の中でカバーガラスを数回すすぎ、およびカバースリップは48時間水に浸漬することができます。瓶を静かにテーブルトップのローテーターで攪拌されることがあります。 </li><li> 80度摂氏と真空デシケーターのストアに設定したオーブン中でカバーグラスを乾燥させる。 </li></ol>リポソーム調製サポートされている脂質二重層は、デキストラン、官能カバースリップにリポソームを吸着することによって形成される。吸着リポソームは、表面上に平坦な膜が破裂し、スプレッドまで、お互いに融合する。 <ol><li>アッセイで使用される一般的なリポソーム製剤は、1,2 - 、ジオレオイル- sn -グリセロ-3 -ホスホコリン（DOPC）、1 -オレオイル-2 -パルミトイル- sn -グリセロ-3 -ホスホコリン（POPC）、コレステロール、ウシ脳から構成されています4:4:2:0.1:5 × 10 -5の比で1,2 - dihexadecanoyl - sn -グリセロ-3 -ホスホエタノールアミン- Disialoganglioside（GD 1A）、およびN -（（biotinoyl）アミノ）ヘキサノイル（6）。すべてのコンポーネントは、クロロホルムまたはクロロホルムとメタノールのソリューションに格納されています。 </li><li>ガラスの試験管に各成分の量を転送することにより、脂質二マイクロモルを含む液を調製する。アルゴンまたは窒素ガス気流下で溶媒を蒸発させる。 2時間真空デシケーター中で試験管を残すことによって、残りの溶剤を削除します。 </li><li> HNEのバッファ400マイクロリットル（5 mMのHEPES、145 mMのNaCl、0.1mMのEDTA）で乾燥脂質フィルムを再懸濁します。 </li><li>プラスチック製のマイクロ遠心チューブに懸濁液を移す。温水浴における液体窒素浴と融解の懸濁液を凍結する。この凍結/融解サイクルを4回繰り返します。 </li><li> 100nmのポリカーボネートメンブレンフィルターと脂質の押出機を組み立て、そして脂質の懸濁液を25回押し出します。サスペンションは、押出後さらに透明にする表示されます。 </li><li>リポソームは、彼らが準備されている日に使用する必要があります。使用されるまで、それらは室温で保存することができます。 </li></ol>マイクロ流体フローセルの準備シンプルなマイクロフローセルは、石英のスライドと、官能カバーガラスの間にダブルスティックテープを挟むことにより行われます。 <ol><li> 20x20x3ミリメートル石英スライドを入手。反対側にある2つ1ミリメートルの穴をドリルダイヤモンドバリを使用してください。 </li><li>ダブルスティックテープのシートから20mm角をカットし、カミソリの刃を使用して、中心から15 × 2 mmのセクションを切り取る。 </li><li>テープバッキングの片側をはがし、およびクォートするためにテープを付着zのスライド。官能化されたカバースリップに反対側に付着する。 </li><li>ポリエチレンチューブの2本の20 cmの長さをカットし、石英スライドの穴に挿入してください。 </li><li> 5分エポキシ接着剤でフローセルを密封する。 </li><li>バッファを持つ接着剤が硬化した、プライムフローセルとチューブ。 </li><li>サポートされている脂質二重層は、チャネルにリポソーム懸濁液の約80マイクロリットルを描画することで、この段階で形成することができる。 </li></ol>ウイルス粒子のラベリング<ol><li> H3N2インフルエンザAは、（X - 31）一般的に融合アッセイに使用されますが、他のインフルエンザ株と他のウイルスが正常に使用されている。 </li><li>ウイルスはhemifusionと細孔形成の検出を可能にするために二つの異なる蛍光色素にしてまでラベルが付いています。 </li><li> 20mMのソリューションを作成するHNEバッファにスルホローダミンB（SRB）を溶かす。ウイルス懸濁液10マイクロリットルで色素溶液の20マイクロリットルを組み合わせ、20時間室温でおきます。この期間中に、色素は徐々にウイルス粒子内に蓄積されます。 </li><li> PD - 10脱塩カラムを介してウイルス懸濁液を渡すことによって、余分な染料を外します。十分なウイルス材料が使用されている場合は、着色されたバンドは、列で見ることができます。このバンドは、ラベル付けされたウイルスが含まれており、それが溶出されるように収集することができる。 </li><li>ないバンドが表示されない場合は、200マイクロリットルのフラクションを収集し、分画は分光光度計で565 nmの吸収を測定することにより、ラベルの付いたウイルスが含まれているかを判定する。ウイルスは、約0.8 mlの全体積に溶出してください。 </li><li> SRBというラベルのウイルス懸濁液にオクタデシルローダミン110（Rh110C18）の2 mMのジメチルホルムアミド（DMF）溶液を13マイクロリットルを添加することによりウイルスのエンベロープにラベルを付けます。 </li><li>実験室のローテータにチューブを接続することによってサスペンションをかき混ぜると、3時間放置する。 </li><li>前に説明したように、PD - 10脱塩カラムを用いて過剰Rh110C18からウイルスを精製する。 </li></ol>顕微鏡の構成実験は、全内部反射蛍光顕微鏡に適した高NA油浸対物レンズを装備した蛍光顕微鏡上で実行されます。アルゴン/クリプトンガスレーザーから488と568 nmのラインはRh110C18とSRBというラベルの付いたウイルスを励起するために使用されます。各ラベルの同時イメージングは​​、分割するダイクロイックミラーと、緑色と赤色の蛍光発光することで実現し、独立して電子乗じてCCDカメラの別の半分に画像を注力しています。 アッセイを行う塗装、ラベルの付いたウイルス粒子のドッキング、フルオレセインとの表面、および低pH緩衝液（図1A）との反応の開始を平面脂質二重膜の組立：融合アッセイの実行は、フローセル内の生化学的成分の段階的な組み立てを含む。 <ol><li>顕微鏡のステージにフローセルをマウントし、毎分40マイクロリットルの速度で流れるように設定されたシリンジポンプにアウトレットチューブを取り付けます。 </li><li> HNEの300マイクロリットルで流すことにより過剰なリポソームの流路をクリアします。 </li><li>顕微鏡の焦点と488nmの光と568 nmの光の70 W / cm 2の350 W / cm 2の表面を照らすためにレーザーパワーを調整する。あなたが1.45 NA 60倍油浸対物レンズを使用している場合は、それぞれ、100マイクロワットと20マイクロワットにレーザー強度を設定します。 </li><li>フローセルに標識ウイルスを（1 / 100に希釈）ポンプ。ウイルスは、流路の底部表面に拡散するように、粒子が脂質二重層に組み込まれているガングリオシドに固執して開始されます。 </li><li>ドッキングウイルス粒子の適切な密度（最大視野あたり約1000粒子に）達成されたとき。ミリリットルフルオレセイン標識されたストレプトアビジン当たり2マイクログラムを含む溶液にインレットチューブを切り替えます。標識ストレプトアビジンは、二重層に結合脂質分子をビオチンには結合され、最終的に薄暗い緑の背景が表示されます。 </li><li> HNEの300マイクロリットルと流路を洗浄してください。 </li><li> 、撮像領域を選択し、顕微鏡を集中し、時間経過した画像取得用CCDカメラを準備。 100ミリ秒に露光時間を設定し、10 Hzのレートでフレームを収集する。 </li><li> 10mMのクエン酸ナトリウムと140mMのNaClを含有する酸性緩衝液中で流れることによって融合を開始。バッファーのpHは、アッセイされるウイルスの臨界pH以下になるように調整されるべきである。 X - 31のpHでヒューズは、5.5の下にあります。 </li></ol>代表的な結果図1Bは、融合の実行前と実行中二重層ドッキングビリオンのスナップショットを示しています。それぞれの回折限界のスポットは、個々のウイルス粒子を表しています。赤色と緑色の蛍光が別々にウイルスエンベロープとコンテンツラベルの同時観測が可能、CCDカメラの上半分と下半分上に結像されています。に比べて緑チャネルの2倍の多くのスポットが一般的にあります。赤、そしてこれは、封筒のラベルに比べてコンテンツの色素でラベリングの効率が低下を反映している。フルオレセインを結合した​​表面から放射される緑色のバックグラウンドの蛍光はクエン酸緩衝液の到着時に消滅し、核融合反応の開始時刻の決定を可能にする。 Hemifusionイベントはhemifusionの茎間のウイルスのエンベロープ拡散で急冷Rh110C18として緑色蛍光のバーストとして検出され、平面膜で希釈される。外に広げ蛍光雲が平面膜における脂肪酸-アシルリンクされている染料の自由拡散を示す、hemifused粒子の周りに見ることができます。細孔の形成は、ウイルス粒子の内部に閉じ込められたSRBからの赤色蛍光の減衰として観測される。融合細孔の開口部は色素が観察領域の平面脂質二重層と外下記の水性空間に脱出することができます。 各粒子の蛍光強度の軌跡は、hemifusionと細孔形成の収率と時間（図1C）の決定を容易に、個々の粒子の積分強度からプロット。 Hemifusionと孔形成イベントの時間は、Rh110C18蛍光バーストまたはSRBの信号の減衰の最大傾斜が発生する点として決定される。成功した実験では、Rh110C18降伏dequenching信号、およびSRBというラベルの粒子の30％で標識された粒子の約50％が使用可能なシグナルを与える。両方の色素で標識された粒子のうち、約10％は両方の脂質混合し、孔形成のシグナルを示しています。 図。 2A - Cは、典型的な実験からhemifusionと孔形成の遅れ時間の分布を示しています。 Fig.2D - Fは、同じ条件で5つの実験から結合イベントのイベントの分布を示しています。観測の控えめな数があっても、ヒストグラムの形状は明らかである。各実験はpHの低下の時間を検出することによって同期されるため、複数の実験を組み合わせることができ、中間のステップをレート制限に関する詳細な情報を得ることができます。 <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="図1"> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="図1"> 図1実験デザイン。 A）ウイルス粒子がhemifusionと融合孔形成の動態を監視するには、2つの蛍光色素で標識されています。蛍光は高NA顕微鏡対物によって収集され、CCD上に結像される。前（左）と中B）蛍光画像（右）個々のウイルス粒子の融合。各画像の上部と下半分は、サポートされている二重層の同約50 x 100 mmの2領域の、それぞれ、赤色と緑色蛍光に対応しています。 C）赤SRBバイラルコンテンツのトレーサーの蛍光強度（上側のトレース）、緑Rh110C18膜色素（真ん中のトレース）、およびフルオレセインのpHセンサは、（下のトレース）pHの低下、hemifusion、そして融合の間に経過した正確な時間を提供しています。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。 <img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="図2"> 図2。蛍光標識ウイルスの融合動力学。 pHの低下とhemifusion（A、D）と細孔形成（B、E）の間の経過時間の分布。ディストリビューションの立ち上がりと減衰では、複数の中間ステップの存在を示している。 hemifusionと個々の粒子の融合細孔の開口部間の遷移は、指数関数的に単一の律速段階を示唆し、配布されています。パネルA〜Cは、単一の実験の結果を示す。パネルのDFは、同じ条件で実行5つの別々の実験からコンパイルされます。してください<a href="/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg1484">ここをクリックして</a>図2の拡大バージョンを参照すること。

<ol><li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalisation+of+Si%2FSiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li>
<li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li>
</ol>

流体と連続的なサポートされている脂質二分子膜の調製が困難な場合があります。材料や表面欠陥を汚染の微量の脂質二重層の拡散防止します。デキストランの均一な層を慎重に洗浄し、堆積が不可欠です。 ウイルス粒子の長時間のイメージングは​​、漂白剤蛍光ラベルをまたはそれらを不活化になることがあります。この種の光損傷はよくバイオイメージングおよび単一分子の分野で知られており、一般的に励起蛍光による活性酸素種の生成に由来すると考えられている。写真の損傷を最小限に抑えるために、我々は一般的に励起レーザパワーを最小化し、実験を開始する前に長期の暴露を避ける。報告されたいくつかの酸素掃気システムのいずれかのバッファからの酸素の枯渇が有用であろう。 一時的な中間状態に関する情報を取得する機能は、核融合反応を正確に同期されている必要があります。使用される流量と入口配管とフローセルのチャンネルのデッドボリュームは同期を制限することができる要因である。融合は、酸性pHの緩衝のための中立的な交換によって開始されます。酸性緩衝がフローセルにインレットチューブを...

<table><tbody><tr><td>Corningカバーガラス正方形、25 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS286525</td><td></td></tr><tr><td>合成石英スライド</td><td>Technical Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>染色ラック</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>(3-グリシドキシプロピル)トリメトキシシラン</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIG5840.1</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン T-500</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 4006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosph&amp;#8211;thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td><td>Invitrogen</td><td>B1616</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン、フルオレセイン共役体</td><td>Invitrogen</td><td>S-869</td><td></td></tr><tr><td>ウシ脳由来ジシアログングリオシド GD&lt;sub&gt;1a&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2392</td><td></td></tr><tr><td>ミニエクストルーダー</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>0.1 micron ポリカーボネート膜フィルター</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>10 mm ドレインディスク（メンブレンサポート）</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>230300</td><td></td></tr><tr><td>スルフォロダミンBナトリウム塩</td><td></td><td>S1402</td><td></td></tr><tr><td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;参照&lt;/em&gt; Floyd &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2008 合成プロトコル</td></tr><tr><td>PD-10 脱塩カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Nikon蛍光顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA 対物レンズ</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 70C Spectrum Ar/Krレーザー</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702213</td><td></td></tr></tbody></table>

単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

膜融合は、細胞内へのエンベロープウイルスの入力時に必須の工程である。従来の核融合アッセイは、通常、それは難しい関係する分子の手順のシーケンスを定量的に分析すること、核融合の多数のイベントを報告する。我々は本質的に流体のサポート上のターゲットの二重層を持つ単一のウイルス粒子の融着の速度を監視するためin vitroで、2色の蛍光アッセイを開発した。 インフルエンザウイルス粒子が細胞膜とウイルスの内部を染色する赤親水性の蛍光物質を染色する緑色の脂溶性蛍光体とインキュベートされています。我々は、フローセルのデキストラン- functionilizedガラスの表面にガングリオシドを含む脂質二重膜を堆積、CCD上の粒子の数百を含む、平面二重層と画像100 × 100μmの2領域の蛍光でウイルス粒子をインキュベートカメラ。イメージングの両方赤と緑の蛍光によって、我々は、同時に膜の色素（緑）と粒子の水性内容（赤）の動作を監視することができます。 融合のpH下の値にpHを下げる際に、粒子は、膜と融合するだろう。 Hemifusionは、標的膜の外葉とウイルス膜の外葉の融合、粒子の緑色蛍光の急激な変化として表示されます。残り2つの遠位リーフレットのその後の融合時に細孔が形成され、ウイルス粒子の赤色発光蛍光体は、標的膜の下にリリースされる予定です。このイベントは、個々の粒子の赤色蛍光の減少を生じさせるだろう。最後に、標的膜に埋め込まれているpH感受性蛍光体からの統合された蛍光はpHの低下の正確な時間を報告します。 three蛍光時のトレースから、すべての重要なイベント（pHの低下、孔形成時に混合hemifusion、コンテンツに応じて混合脂質）は、現在直接的な方法で、個々にすべての粒子について、抽出することができます。ヒストグラムの多くの個々の粒子のための様々な遷移のために経過時間を収集することにより、我々は、対応する中間体の寿命を決定することができます。直接蛍光観察を持っていなくても隠された中間体は、これらのヒストグラムから直接可視化することができます。

我々は存在する<em&gt; in vitroで、</em&gt; 2つの色の液体ターゲットの二重層を持つ単一のウイルス粒子の融合を可視化する蛍光アッセイ。差ウイルス膜とその内部を染色する蛍光団でウイルス粒子を標識することにより、我々はhemifusionと細孔形成の動態を監視することができます。

膜融合は、エンベロープウイルスが細胞内に侵入する際の不可欠なステップである。従来の融合アッセイでは、通常、多数の融合事象について報告されるが……

本アッセイで使用するカバーガラスは、デキストリンで機能化された後、マイクロ流体フローセルに組み込まれます。次に、各フローセルをリポソーム懸濁液とともにインキュベートし、水和したデキストリンの上に脂質二重層を形成させます。蛍光顕微鏡下で、Fluoro 4で標識したウイルスとフルオレセインで標識したストレプトアビジンを添加し、ウイルスを二重層にドッキングさせます。酸性緩衝液の流入によりウイルスと脂質二層膜の融合が開始され、アッセイ中の蛍光変化をデジタルカメラで記録します。こんにちは、私はダニエル・フロイドです。ハーバード大学生物化学・分子薬理学部のアニネ・ヴァニアン研究室に所属しています。本日は、単一粒子レベルでウイルスの融合キネティクスを可視化する方法をご紹介します。当研究室では、ウイルスが宿主細胞に到達する経路を研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。まず、デキストリン修飾カバーガラスを準備することからこのプロトコルを開始します。最初のステップは、カバーガラスを10%洗剤溶液、1 M水酸化カリウムアセトン溶液、および100%エタノールの順に、各溶液で30分間超音波洗浄することです。各工程の間には脱イオン水で洗浄してください。最後の超音波洗浄の後、カバーガラスを水で洗い流し、80 °Cのインキュベーターで乾燥させます。次に、カバーガラスを酸素プラズマクリーナーに入れ、3分間処理します。この工程によりスライドの表面が酸化され、ガラスが均一に親水性となり、後のシラン化工程において反応性が高まります。続いて、カバーガラスを0.2% gly oxy propyl trimeth oxypro trim methoxyの新鮮なイソプロパノール溶液に浸し、5分間インキュベートします。次に、カバーガラスをイソプロパノールで数回洗浄します。Slanコーティングしたカバーガラスを80 °Cで1時間保持します。このキュアリングステップにより、Slanがガラスに共有結合します。硬化後、カバーガラスをプラスチック製フリーザーボックスの内側に平らに並べます。各カバーガラスの上面を、水で30% w/vに調製したデキストリン溶液約1 mLで覆います。フリーザーボックスを閉じ、カバーガラスを静かな場所に24～36時間置いておきます。翌日、プラスチックピンセットでカバーガラスを保持しながら過剰なデキストリンを捨て、セラミックラックに戻します。水で数回すすぎ、48時間水に浸しておきます。容器を卓上ローテーターで穏やかに撹拌させます。カバーガラスを80 °Cに設定したオーブンで乾燥させ、次のステップまで真空デシケーター内で保存します。リポソームの混合液でカバーガラスをコーティングし、平面脂質二重層を形成させます。次のステップは、脂質二重層を形成するためのリポソームを調製することです。クリーンベンチ内で、クロロホルムに溶解させたすべての脂質をガラス試験管に合わせます。リポソーム処方には、ウイルス粒子と結合するdia ganglia側と、ストレプトアビジン結合pH指示薬フルオレセインと結合するビオチン化脂質が含まれています。次に、アルゴンまたは窒素ガスの気流下で溶媒を蒸発させます。そして、試験管を真空デシケーター内に2時間放置し、残存する溶媒を除去します。乾燥させた脂質フィルムを400 µLのHNE緩衝液で再懸濁させます。その後、懸濁液をプラスチック製マイクロ遠心チューブに移します。液体窒素浴中で懸濁液を凍結させ、温水浴中で融解させます。凍結融解サイクルをさらに4回繰り返します。100 nanometerのメンブレンフィルターを装着したリピッドエクストルーダーを使用して、脂質懸濁液をエクストルージョンします。25回エクストルージョンした後、懸濁液はより透明になります。リポソームは室温で保存し、調製当日に使用します。脂質の準備が整ったので、マイクロ流体フローセルを準備します。まず、20 × 20 × 3 mmの石英スライドを用意し、ダイヤモンドバーを用いて、反対側に1 mmの穴を2つ開けます。カッターナイフを使用して、両面テープから20 mm四方の正方形を切り出します。その中心から15×2 mmの領域を切り抜きます。テープの片面の剥離紙をはがし、カバーガラスに貼り付けます。もう一方の面を、20 centimeterの長さに切断したポリエチレンチューブで機能化されたカバーガラスに接着し、それらを石英スライドの穴に挿入します。最後に、5分硬化型エポキシ接着剤でフローセルを密封します。石英スライドの側面に接着剤を塗布し、カバーガラスに接合させます。接着剤をさらに2滴使用し、チューブと石英スライドの接続部を密封します。接着剤が硬化した後、フローセルとチューブにHNEバッファーを流してプライミングします。次に、支持脂質二重層を作成するため、融合実験の前日に、エクストルードさせたリポソーム懸濁液をチャネル内に約80 microliters吸引します。ウイルスの内部を赤色に標識するため、ウイルス粒子の標識を開始します。調製したばかりのsulforhodamine B（SRB）溶液20 µLに、ウイルス懸濁液10 µLを加え、室温で20時間放置します。翌日、ウイルス懸濁液をPD 10脱塩カラムに通し、800 µLのHNEバッファーで希釈して過剰な色素を除去します。カラムには、標識されたウイルスを含む明らかな色帯が見られるはずです。次に、溶出ステップでこの分画を回収し、SRB標識ウイルス懸濁液にOctadecyl, RUMINE one 10またはRH one 10 C 18を13 µL添加して、ウイルスエンベロープを緑色に標識します。チューブをラボラトリーローテーターに取り付けて懸濁液を撹拌し、3時間放置します。次に、PD 10脱塩カラムを用いて過剰なRH one 10 C 18を除去します。これまでと同様に、これでウイルスが融合アッセイに使用可能な状態になります。高開口数油浸対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を用いて、融合速度論アッセイを実施します。Argonneクリプトンレーザーを用いて、ウイルス膜および内部のフルオロフォアを励起させます。その後、ダイクロイックミラーで赤色および緑色の蛍光放出を分離し、それぞれの画像を電子増倍CCD（電荷結合素子）カメラの別々の半分に独立して集光させます。カバーガラスを顕微鏡ステージに取り付け、流速を100 µL/minに設定したシリンジポンプに流出チューブを接続します。300 µLのHNEを流し、フローチャネル内の過剰なリポソームを除去します。顕微鏡のピントを合わせ、レーザー出力を調整して、赤色蛍光色素を励起させるために488 nmの光を350 W/cm²、緑色蛍光色素を励起させるために568 nmの光を70 W/cm²で表面に照射します。顕微鏡の準備が整ったら、1/100に希釈した標識ウイルスをフローセルにポンプで注入します。ウイルスが流路の底面へと拡散すると、粒子のドッキングが始まります。これらはカバースリップに組み込まれた平面脂質二重層のDIA神経節側に付着します。ドッキングした粒子の密度が1視野あたり数百個程度に達したら、2 µg/mLの溶液の注入を開始してください。フルオレセイン標識ストレプトアビジンを用います。標識ストレプトアビジンが脂質二重層内のビオチン結合脂質分子に結合すると、pH感受性フルオロフォアとして機能します。薄い緑色の背景が再び現れたら、300 µLのHNEでフローチャネルを洗浄します。これでウイルスのドッキングが完了し、二重層表面がフルオレセインでコーティングされたため、アッセイを開始します。イメージング領域を選択し、顕微鏡のピントを合わせ、タイムラプス画像取得に向けてCCDカメラを準備します。露光時間を100 millisecondsに設定し、10 hertzの速度でフレームを収集します。酸性のクエン酸ナトリウム緩衝液を流し込み、ウイルス膜融合を開始させます。pHが低下するとフルオレセインの蛍光が減衰し、酸性化が起こった時間を特定できます。CCDカメラはアッセイ全期間にわたってデータを記録しており、これを用いてCCDカメラに記録されたヘミフュージョンおよびポア形成の時間を決定できます。pH低下後、ウイルス膜と平面膜が融合し、脂質が混合してウイルスエンベロープ内の緑色色素が平面膜に拡散すると、緑色の蛍光バーストが観察されます。対照的に、pH低下後には赤色蛍光の減衰が見られます。これは、ウイルス膜と脂質膜にポアが形成され、ウイルス内部の赤色色素が平面脂質二層膜下の水相へと流出し、視野外に出るためです。これらの傾向は、融合前後の蛍光スナップショットによっても視覚化できます。また、この例に示すように、各粒子の蛍光強度軌跡をグラフ化します。ヘミ融合は、緑色蛍光強度の勾配が最大となる点として定義され、ポア形成は赤色蛍光の減衰が起こる点として定義されます。ここで示すように、pH低下の時間を t = 0 として異なる実験データを同期させ、複数の実験から得られたデータを統合して、ヘミ融合およびポア形成までのラグタイムのヒストグラムを作成します。以上で、単一粒子レベルでウイルスの融合速度論を測定する方法について説明しました。この手順を行う際は、均質で流動的な脂質二重層を形成させるため、必ず清潔なカバーガラスを使用してください。また、光損傷を最小限に抑えるため、蛍光イメージング中に使用する光量を最小限にするようにしてください。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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