Name: 変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素PAGE） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-29T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学ぶ変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で、単鎖DNAやRNAを分子量に基づいて分離する技術を習得できます。オリゴヌクレオチドの解析や分子生物学研究に有用です。

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この作品は、シンガポール学術研究評議会（ARC）[承認番号90/07]によってサポートされていました。我々は、サポートのための放射線抵抗性細菌に感謝。

この実験的な手順のための完全かつ詳細なテキストプロトコルは、分子生物学におけるカレントプロトコールで使用可能です。ゲルサンドイッチの組み立てのため、ゲルの装置のための詳細なステップバイステップの手順はBioRad社のウェブサイト3に見つけることができます。 必要な機器： ガラス板（内側と外側） 10cmのセル：10.1 × 7.3センチメートル（インナープレート）、10.1 × 8.2センチメートル（外板）、バイオラッド 20cmのセル：20 × 20センチ（内側のプレート）、20 × 22.3センチメートル（外側のプレート）、バイオラッド 0.5〜1.5ミリメートルゲルのコームとスペーサー ゲルキャスティングスタンド 蓋とケーブルを含むゲル装置 高電圧電源 ヒーティングブロックまたは水浴 血清学的ピペットとピペットエイド ピペットとピペットチップ ゲルの乾燥機やスキャナ試薬およびソリューション： 尿素（超高純度） 40％アクリルアミド溶液（29:1） 10 × TBE溶液（トリス - ホウ酸、EDTAバッファー） 脱イオン、蒸留水 TEMED 30％（w / v）の過硫酸アンモニウム溶液 0.5 × TBEのソリューション ホルムアミド EDTA キシレンシアノール ブロモフェノールブルー メタノール エタノール<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td>ボリューム</td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 50ミリリットル </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 60ミリリットル </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 10ミリリットル </td></tr><tr><td>アクリルアミド濃度</td><td> 10パーセント </td><td> 12.5パーセント </td><td> 15パーセント </td><td> 10パーセント </td><td> 12.5パーセント </td><td> 15パーセント </td><td> 10パーセント </td><td> 12.5パーセント </td><td> 15パーセント </td></tr><tr><td>グラム尿素</td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 28.8 </td><td> 28.8 </td><td> 28.8 </td><td> 4.8 </td><td> 4.8 </td><td> 4.8 </td></tr><tr><td>ミリリットル40パーセントアクリル（29:1） </td><td> 12.5 </td><td> 15.625 </td><td> 18.75 </td><td> 15 </td><td> 18.75 </td><td> 22.5 </td><td> 2.5 </td><td> 3.125 </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> UL 30％APS </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 199.2 </td><td> 199.2 </td><td> 199.2 </td><td> 33 </td><td> 33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> UL TEMED </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 10 × TBE </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="10">脱イオン、蒸留水でボリュームをいっぱいに</td></tr></tbody></table>表1：一本鎖オリゴヌクレオチドを​​解決するための様々なアクリルアミド濃度とボリュームに必要な試薬およびソリューションゲルサンドイッチアセンブリとゲルの準備<ol><li>メーカーの説明にしたがってゲルを組み立て、ゲルキャスティング室3にゲルを固定してください。 0.5〜1.5ミリメートル厚のスペーサーを使用してください。 </li><li>分子生物学における現在のプロトコールにしたがって適切なポリアクリルアミド溶液を調製するか、表1に示します。 20センチメートル× 22センチ× 1.5ミリメートル、ゲル溶液の60mlの変性アクリルアミドゲル用と10.1 × 8.2センチメートル× 1 mmのゲル5 mlのゲル溶液が十分であるために。大きなゲルは、予想される製品/バンドは数個の塩基の範囲内にある場合、その後長くゲルは、一塩基の違いでバンドを解決するために使用されます。期待されるバンドが10以上のヌクレオチドが異なる場合、小さいゲルは、フラグメントを解消するために適したものとなる。あなたの分離要件に合ったポリアクリルアミドの割合を選択して、より高いポリアクリルアミドの濃度は、低分子量のフラグメントを解決します。アクリルアミドの希望する量の超純尿素と混合して使用してください。 0.5〜1 × TBEの最終濃度を取得し、脱イオン、蒸留水でボリュームを埋めるためにゲルのミックスにTBEバッファーを追加します。電子レンジで20秒のためのソリューションを熱し、軽く混ぜる。ソリューションが手に暖機するまで大きいゲルのボリュームに対してこの手順を繰り返します。 </li><li>すぐに血清用ピペット及び2枚のガラス板との間の自動ピペットエイドを使用してゲルを注ぐ。気泡を導入することは避けてください。コー​​ムを挿入し、ゲルが30〜60分間重合させる。 </li></ol>電気泳動装置をセットアップし、ゲルをプレラン<ol><li>指示3を製造するためによると鋳造室や組立それからゲル装置にゲルをマウント解除します。 </li><li>ガラス板がサブになるとバッファ（0.5〜1 × TBE）を実行して下側のバッファ室のウィットを埋めるバッファを2〜3 cmを合併。バッファを実行するとゲルの上部に上部バッファー槽がいっぱいに。 </li><li>慎重にコームを抜き取るとヒントをロードするピペットとゲルを使用して、実行中のバッファをウェルの中にすすいでください。 </li><li>高電圧電源へのケーブルのゲルシステムとプラグの蓋を取り付けます。あなたのサンプルをロードする前に、ゲルを加熱するとゲルから、残りの尿素を除去するために少なくとも30分間ゲルをプレランする必要があります。最適温度は45から55の間でなければなりません℃の温度が60 ° Cのバンドがスメアまたはガラス板が割れることができる可能性があるため。を避けるプレラン（ゲルあたり15〜25 W）のための一定の電力を選択してください。 </li></ol>サンプルの準備<ol><li>その間にあなたのサンプルを準備する。したがって、あなたのサンプルに2 ×ゲルローディングミックスの適切な量を追加します。ローディングミックスは、通常、90％ホルムアミド、0.5％EDTA、0.1％キシレンシアノール、0.1％ブロモフェノールブルーが含まれています。 </li><li>サンプルがゲル上にロードする前に、サンプルが数分間70から90 ° Cの間で試料を加熱することによって熱が変性でなければなりません。 </li></ol>ゲルをロードして実行<ol><li>プレランが終了したら、蓋を取り外し、尿素が井戸に溶出したとして前に説明したように徹底的にポケットをすすいでください。 </li><li>ポケットの底部から注意深くサンプルを適用します。気泡を導入することは避けてください。ローディングバッファーには、実行中に同じ条件を維持するために空のポケットに適用する必要があります。 </li><li>蓋を組み立て、55のゲルの温度を維持するために一定の電力でゲルを実行° Cプレランに似て。色素フロントがゲルの下端に達するまでのマーカー色素の移行を観察。実行期間は、使用されるアクリルアミドの割合、バッファーとゲルの厚さのイオン強度に依存しています。ランは、2〜4時間の間に続くことができます。 ゲルの温度を確認してください。ゲルの温度計は、実行時に右の温度を監視することができます。 </li></ol>ゲルを処理<ol><li>色素フロントがゲルの終わりに達したときに下側のバッファ室からゲルを出す。チャンバーからゲルを外し、クランプを緩めます。スペーサーを離れて引いて、慎重にガラス板を解体。必要な場合は上限も含むゲル部分を切り取る。 </li><li>注意深くゲル固定液（TBEプラス5〜10％のメタノールとエタノールの同じ濃度）で皿にゲルを移す。 5〜10分間溶液中にゲルをそのままにしてバッファを二度変更。 </li><li>ゲルは真空ゲル乾燥機やゲルの直接スキャンを使用してさらに処理するための準備ができています。 </li></ol>

<ol><li>Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+length+determination+of+small+double-+and+single-stranded+DNA+molecules+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlbright%2C+LM+%22Curr+Protoc+Nucleic+Acid+Chem%22">Curr Protoc Nucleic Acid Chem</a>. , (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PROTEAN+II+xi+Cell+and+PROTEAN+II+xi+2-D+Cell+Instruction+Manual%22">PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual</a>. , Biorad. (2001).</li>
</ol>

著者らに開示すべき利益相反はありません。

<ol><li>バンドの鋭さは、いくつかの要因によって異なります。シャープなバンドのためにロードされたサンプルの量は、すなわち理想的には1から5μlの間、可能な限り小さくする必要があります。しかし、最大15μlをまだ受諾可能な解像度を確実にするロードすることができます。シャープなバンドの少ないサンプル量の結果。 </li><li>バンドの質も、ゲルの厚さに依存しています。たとえば0.75 mmの薄いゲルは、厚さ1.5mmのゲルよりも良い結果を示す。 </li><li>サンプルがゲルのポケットに等しく適用されていない場合は、バンドの形状はまた、ゲルローディング中に影響を及ぼすことができる。ローディングバッファーで10％グリセロールを含むこともより容易にゲルローディングとサンプルのシンク時に役立ちます。 </li><li>予想される製品（s）がロードする染料のいずれかと同じレベルで実行される場合、サンプルローディングバッファーに接続されている別の潜在的な問題は、発生する可能性があります。さらに、蛍光標識が使用されている場合、一部の色素は同じような波長で蛍光シグナルを示す。このパラメータが1の場合染料またはすべての染料を除去する場合は、この問題を解決することができます。それは大きさの標準と...

変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素page）

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

尿素PAGEまたは変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動では、二次的DNAまたはRNAの構造を変性し、分子量に基づいて、ポリアクリルアミドゲルマトリックス中のそれらの分離に使用される6月8日Mの尿素を、採用しています。 2から500塩基間のフラグメントは、単一のヌクレオチドのような小さな長さの違いが、この方法1を用いて分離することができます。サンプルの移行は、選択されたアクリルアミドの濃度に依存する。ポリアクリルアミドの割合は低分子量のフラグメントを解消します。ゲルの実行中に尿素や45〜55 ° Cの温度の組み合わせは、非構造化DNAまたはRNA分子を分離することができます。 一般的にはこの方法は、一本鎖DNAまたはRNAの断片を、酵素的切断反応から次のような合成または標識オリゴヌクレオチドまたは製品を分析したり、精製するために必要です。 このビデオの記事では、変性尿素ポリアクリルアミドゲルを準備して実行する方法を示します。技術的なヒントは、元のプロトコルの1,2に加えて、含まれています。

変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、一本鎖DNAを分離または500ヌクレオチドの上限に達した時点でRNAに使用されます。熱変性サンプルと非構造化一本鎖との組み合わせで尿素は、その分子量に応じてゲルマトリックス内に移行する。

変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素PAGE）

尿素PAGEまたは変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動では6〜8 Mの尿素を用います。これによりDNAまたはRNAの二次構造が変性するため、これらの...

一般的に、この種のゲルは、合成または標識されたオリゴヌクレオチドや酵素切断反応の産物などの、単鎖DNAまたはRNA断片を分離するために必要です。分離範囲はポリアミド濃度に依存し、尿素と加熱変性によりサンプルが単鎖分子となり、その分子量に応じてゲルマトリックス内を移動します。このビデオでは、代表的なゲルの作製、電気泳動、および処理について説明します。こんにちは、Hakiです。南洋理工大学（Nanyang Technological University）に所属しています。このデモンストレーションでは、変性ポリゲレクトロフォレーシスの実施方法について説明します。清潔なガラスプレートを使用し、製造元の説明に従ってゲルサンドイッチを組み立てます。ゲルをゲルキャスティング標準チャンバーに固定します。ゲルがガラスプレートに付着しやすい場合は、大型ゲルのガラスプレートを処理してください。分離要件に応じてゲルのサイズと厚さを選択します。分子生物学の現行のプロトコルに従い、ゲル溶液を調製します。分離要件に適したポリアミドの濃度を選択してください。アクリルアミドの割合が高いほど、低分子量のフラグメントをより良好に分離できます。Alta pure UIAを使用し、ビーカーまたはボトル内で目的量のポリアクリルアミドと混合してください。溶液に10 XTBEバッファーを加え、水を加えて規定量までメスアップします。電子レンジで20秒間加熱し、すべてのUIAが溶解するまで穏やかに混ぜ合わせます。より大量のゲル量が必要な場合は、必要に応じて溶液を保存してください。溶液が手で触れて温かいと感じるまで、マイクロ波照射の手順を繰り返します。溶液を加熱しすぎないように注意してください。60°Cを超えるとureaが分解し始めるため、過剰な加熱は避けてください。アンモニアの臭いで室温であることを確認できます。溶液が透明になり、室温付近まで冷却されたら、PSとtamidをゲル溶液に加え、静かに混合します。ゲル溶液の温度が高すぎると、ピペット内でゲルが重合してしまいます。セロロジカルピペットとピペットエイドを使用して、2枚のガラスプレートの間にゲルを注ぎます。気泡が入らないように注意してください。その後、テコムを慎重に挿入します。気泡が入らないように注意し、30分から60分間かけてゲルの重合を待ちます。キャスティングスタンドからゲルを取り外し、上部バッファーチャンバーに取り付けます。メーカーのプロトコルに従い、ゲルを下部バッファーチャンバーに設置し、下部リザーバーをゲル電気泳動用バッファー（通常は0.5から1 XTBE）で満たします。ゲルに使用したものと同じ濃度のゲル走行バッファーを、ガラスプレートの端まで上部バッファーチャンバーに満たします。サンプルをロードする前に、ゲルを加熱し、ゲル内に残っている尿素を除去するため、少なくとも30分間プレランを行う必要があります。最適温度は、実際のゲル走行時と同様に45〜55°Cであるべきです。バンドのスメアやガラスプレートの破損を防ぐため、60°C以上の温度にならないように注意してください。端を乱さないように慎重にコームを取り外し、ウェル内に漏れ出した尿素を除去するためにウェル内を洗浄してください。ゲルロード用チップを使用し、ピペッティングを数回繰り返してください。それぞれ、ゲルシステムの蓋をしっかりと閉め、ケーブルを高電圧電源装置に接続します。プレランには定電力（Constant Watts）を選択し、ゲル1枚あたり約15〜20 Wに設定します。電源を入れた際、気泡が発生していれば導電性は良好です。その間にサンプルの調製を行い、サンプルに対して適切な量の2×ゲルロード用バッファーを加えます。プリランが完了したら、蓋を取り外し、前述の手順に従ってポケット内を十分に洗浄します。尿素が密な層を形成してサンプルのゲルへの進入を妨げるため、ゲルポケットを慎重にすすぐことが非常に重要です。サンプルの熱変性をさせるため、70 °C 以上で数分間インキュベートします。ポケットの底から慎重にサンプルを添加してください。一部のアプリケーションでは、色素がサンプルに干渉してバンドの拡散を招いたり、色素自体が蛍光信号を示したりすることがあります。そのような場合は、一方の色素またはすべての色素を除去し、標準的な色素含有バッファーをロードすることが有用です。空のウェルにサイズ標準をロードしてください。シャープなバンドを得るためにロードすべきサンプルの量は、理想的には1〜5 µLの間ですが、最大15 µLまでの大容量をロードすることも可能です。サンプル量を少なめにすると、より鮮明なバンドが得られます。気泡が入らないように注意し、サンプルがゆっくりとウェルに沈み込み、均一な層が形成されるようにしてください。蛍光標識を使用する場合は、サンプルの光退色を防ぐため、ゲルシステム全体をアルミホイルで包んで遮光してください。蓋を閉め、電源を入れます。DIAフロントがゲルの下端に到達するまで電気泳動を行います。泳動時間はアクリルアミドの濃度によって異なります。バッファーのイオン強度、ゲルの厚さと長さを決定します。泳動時間は1時間から数時間までかかります。マーカーの移動を観察し、電気泳動時間を決定してください。一定のワット数を使用し、ゲルの温度を確認します。ゲル温度計を使用すれば、電気泳動中の適切な温度をモニターでき、また、泳動が終了した際にゲル装置のマニュアルで確認することも可能です。電源を切り、ゲル装置の蓋を取り除きます。次に、下部緩衝液槽からゲルサンドイッチを取り出します。上部緩衝液槽の緩衝液を捨てます。シャーレにゲル固定液を満たします。この溶液は、TBと同じ濃度であり、5〜10%のメタノールおよび酢酸を含んでいる必要があります。装置からゲルサンドイッチを取り出し、クランプを緩めます。スペーサーを引き離し、スパチュラを用いてガラスプレートを慎重に分解します。必要に応じて、ゲルが入っているウェル部分または下の空のゲル部分を切り出し、染料を含むレーンなどの不要なゲル片は廃棄してください。蛍光サンプルの場合、ガラスプレートからゲルを慎重に剥がし、ゲル固定液を満たしたディッシュに移します。ゲルを溶液中に5〜10分間放置し、バッファーを2回交換します。用途に応じて、ディッシュを穏やかに揺らしてゲルから尿素を洗い流すか、またはゲルを染色液に入れます。ゲルの品質はゲルの厚さにも依存します。0.75 millimeterのような薄いゲルは、1.5 millimeter厚のゲルよりも良好な結果を示しますが、取り扱いはより困難になります。バンドの鮮明度は、いくつかの要因に依存します。ランの開始時に低電圧をかけることで、サンプルがゲル前面にスムーズに進入し、よりきれいなバンドを得ることができます。また、これにより高電圧によるゲルのポケットの崩落を防ぐことができます。短く低濃度のポリアクリルアミド積層ゲルを使用することでも同様のバンドシャープニング効果が得られ、10% Glycerolを添加することも、ゲルへのロード時にサンプルをウェルに沈降させるのに役立ちます。また、空のポケットにローディングバッファーを適用することで、ラン中の条件を均一に保つことが容易になります。ゲルを固定液に浸した後、さらなるイメージングのために真空ゲル乾燥機を用いて乾燥させるか、使用しているラベルや染料に応じて直接ゲルをスキャンします。このページは、単鎖DNAまたはRNAサンプルの解析や単離に有用です。ゲルは室温で保存可能です。そのため、ゲルをペーパータオルで包み、水またはランニングバッファーで浸します。包んで湿らせたゲルを密閉可能なプラスチック袋に入れ、48時間以内に使用してください。よく見られる問題として、ゲルのスマイリング現象があります。これは、ゲル内での熱分布が不均一であるためです。ゲルがバッファーに浸かっていない場合、金属プレートを装着することでゲルの品質を向上させることができます。こんにちは、Hi Kasamです。私は南洋理工大学に所属しています。今回は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の実施方法について解説しました。それでは、また次回にお会いしましょう。

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Biology

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