Name: 無傷の3 - D脳の回路のウイルス標的のためのスケーラブルな流体インジェクタの配列 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: 学ぶ 並列流体インジェクタアレイを用いた無傷の3D脳回路へのウイルス標的化法。光遺伝学的操作により神経回路の精密解析が可能となり、脳機能研究の効率化に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ESBは、NIHのディレクターの新イノベーター賞（OD002002 - 01 DP2）、NIHのチャレンジグラント1RC1MH088182 - 01、NIHグランド機会グラント1RC2DE020919 - 01、NIH 1R01NS067199 - 01、NSF（0835878と0848804）、マクガバン研究所Neurotechnologyアワードプログラムによって資金を認め、防衛、NARSAD、アルフレッドP.スローン財団、ジェリーとマージバーネット、神経科学、MITメディアラボ、ベネッセ財団、ウォレス時間コールター財団におけるイノベーションのためのSFN研究賞の部。

1。定位クランプの構築<ol><li>定位クランプは、インジェクターが定位固定アームと平行になるように、stereotaxにインジェクタのアレイを取り付けるために使用されます。 </li><li>それは複数の手術を同時に行なうことができることが予想されていない限り、各研究室では、唯一のクランプが必要です。このケースでは、同時手術の予想最大数と同じ数を作る。また、最初の損傷の場合には、余分を加えようとするのはお勧めかもしれません。 </li><li>定位クランプを行うには、まず、1.5ミリメートル外径（OD）鋼カニューレは、長さ2インチにカットされ、一端は平らになるまでダウンDremeledている。 </li><li>次に、小片（約0.5 × 0.5 cm）をスペーサーとして使用されるように、PCBプロトタイプボードから切り出しています。 </li><li>行われたカットは、材料の表面に対して垂直になるようにレーザーカッターを使用して、二つの同一の長方形（1 / 2&quot;× 3 / 8&quot;）1 / 8&quot;アクリルシート、の二つの円形孔を有する各四角形からカットされています長方形の対角線。最初の穴は直径1.5mmを持ち、しっかりと金属製のカニューレを保持するのに十分な大きさであり、2番目の穴は直径1 / 16&quot;（ 図1C）を持っている。 </li><li>金属カニューレは、2番目の1.5mmの穴から、つの四角形の1.5 mmの穴に挿入されます。カニューレの下端は、ホッケースティックの形状を形成し、底面の長方形の底面に揃えて配置されます。 </li><li>しっかりつの矩形間で開催されたスペーサを保ちながら、この構造体は接着の長方形にスペーサーを避けるために注意しながら、カニューレと1.5ミリメートルの穴の周りにホットグルーを使用して一緒にセメントされています。粘土は、このプロセス中に物事を一緒に保持するために役立つことがあります。 </li><li>接着剤が乾燥した後、1〜72ネジは長方形の上辺から16分の1穴に挿入されます。その後、1〜72六角ナットは1から72スクリューの端にねじ、と締め付けられる。ネジとナットが一緒にクランプを保持するために役立つ。 </li><li>底部の四角形の底面に六角ナットを添付するには、5分エポキシ少量のエポキシ樹脂は、六角ナットやネジのスレッドに取得できるようにすることなく、六角ナットのエッジの周りにドロップされます。どんな粘土が削除され、そしてそれは、スペーサーはネジを締めて、しっかりと所定の位置に保持できることが確認された。 </li></ol> 2。ハミルトンポンプとstereotax：カスタマイズされたインジェクタの配列のためにシステムの準備<ol><li>インジェクタアレイシステムは、脳内の座標のほぼすべてのセットにカスタマイズすることができます。 </li><li>ユーザーが最初に設置したstereotaxで使用される適切な座標に変換する、マウス（または他の種）の脳アトラスの目的の注射部位の座標（ここで、X -、Y、およびZ座標）。注射部位の数（ 図1Aおよび1Bの3つ） 以下、K呼び出されます。 </li><li> 10μlのハミルトンシリンジのkの数は、ハーバード大学の装置からこのような注入/撤退シリンジポンプに配置されます。 </li><li>ポリエチレンチューブの次、3フィートの長い作品はしっかりとそれぞれのハミルトンシリンジの針に取り付けられている。 </li><li>ポリエチレンチューブの部分ごとに、アップチャーチ科学からF - 252チューブスリーブは開放端にスライドさせると付属のナットを使用してP - 627チューブアダプターに接続し、アップチャーチ科学からも、フェルール。 </li></ol> 3。カスタマイズされたインジェクタの配列を構築する<ol><li>各インジェクタの配列は、ユーザーが選択する座標のセットにカスタマイズされています。しかし、翻訳および/または回転によってのみ異なる座標のセットのために、同じインジェクタの配列を使用することができます。 </li><li>唯一の相対的なXおよび注射部位のY座標を考慮すると、k個の穴が&quot;同じ相対的な間隔で、これらの穴がModelaミニ工場と0.011を使用して掘削している&quot;厚さ1 / 32のPCBのプロトタイプボードに掘削されていますマクマスター - カーから直径のドリルビット。ドリルビットを壊したり、消耗を避けるために掘削の遅い速度（Z -スピード）を使用してください。工場からボードを取り外す前に、長方形小さいものを着用を避けるために、直径1 / 32&quot;の大きなドリルビットを使用して、小さな穴の周りに掘られているミニミルのためのコードが簡単にMATLABを使用して生成することができます。。サンプルコー​​ドは以下のファイルで提供されています。 <ol class="lroman"><li> generate.m - 目的の座標からModelaコードを生成するためのMATLABコード</li><li> holes_ex.rml - プロトボードに呼び出し音のパターン（8つの穴）をあけるためのModelaコード</li><li> outline_ex.rml - 穴の周り掘削四角形のModelaコード</li></ol></li><li> 245μmのOD/100μmの内径（ID）フューズドシリカキャピラリーチューブ、ポリマイクロTechnologiesから入手は、3インチの部分のk個の数にカットされます。これらは、個々のインジェクタを備える。キャピラリーチューブの使い捨て部分は通過突かれる穴の各々は、実際のインジェクターを詰まらせることなくゴミを一掃するために。インジェクターは、それらがお互いにしっかりと平行に保持されるように、途中でそれぞれの穴に挿入されます。インジェクターは、インジェクターの配列の構造を形成し、基板にepoxiedされています。残っているのは、正しい長さにインジェクターをトリミングすることです。 </li><li>インジェクタの配列は、アクリルの長方形の間に、して定位クランプのネジを締めて、プロトボードのいずれかの隅を配置することにより、定位固定クランプに取り付けられています。次に、クランプの金属カニューレはstereotaxの付着メカニズムを使用して、stereotaxに添付されます。 </li><li>以下のすべては、顕微鏡下で行われます。外側のインジェクター（つまり、他のインジェクターのいずれかに衝突することなく、ストレートエッジと側面からアプローチをすることができるもの）のいずれかの、プロトボードの底部を越えて伸びる先端をハサミでカットされます。皮質注射の場合、それはインジェクタがproto -ボードの表面を越えて約5ミリメートル延長したことは適切である。深く注射の場合、この数値は、深さの増加に対応増加させることができる。先端は、ドレメルツールを使用して平坦化される。深さの精度がそれほど重要ではない場合、インジェクタの先端にはまた、目詰まりに対して余分な予防措置としての角度で地面にすることができます。 </li><li>次に、安定した基準点は、定位固定アームの範囲内で選択され、インジェクタの配列は、外側のインジェクタの扁平な先端が、この基準点になるように移動されます。 </li><li>第二インジェクタは、対応する座標と一緒に、選択されます。第一および第二のインジェクタの座標間の高さの相対的な違いは、（z方向）であると考えられ。インジェクタの配列は、この相対距離によってZ軸方向に移動されます。第二インジェクタ第二インジェクターの先端が、現在フラットであり、基準点の高さになるよう、トリミングして、正しい長さにDremeledている。インジェクタの配列は、基準点とインジェクタの先端の比較を容易にするためにX方向とY方向に移動することができます。 </li><li>トリミングのこのプロセスは、残りのインジェクターのために繰り返されます。 </li></ol> 4。システム全体の組み立て<ol><li>定位クランプおよびカスタマイズされたインジェクタの配列は、両方とも既に構築された、この部分のために必要とされています。 </li><li>各インジェクタのバックエンドは（トリミングされていないエンド）、P - 235ナットとアップチャーチ科学からP - 200フェラルを使用して、F - 240チューブスリーブ青と挿入され、すでに接続されているネジアダプターに接続されているポリエチレンチューブによるハミルトンのポンプに。メーカーの指示は、詳細を相談することができます。 </li><li> 27ゲージ針を用いて、シリコーンオイルは、システム全体がまったく空気の泡で、インジェクタの先端にハミルトンシリンジから充填されるようにハミルトンシリンジの後ろに注入されます。 </li><li>ハミルトンシリンジがハミルトンのポンプで再配置されるように、シリコーンオイルの最大限の量は、シリンジ内に保持されます。 </li><li>実験は、ポンプよりも多くのシリンジが（この場合は2）のために設計されている必要がある場合は、注射器は互いにそれらを平行に保つために、そしてすべての作品があることを確認するためにプラスチック製の小さな断片（例えば、針のキャップ）を配置できますと同程度に、ポンプでプッシュ。または、マルチラックのアップグレードキットは、一度に10注射器まで保持するためにハーバード大学の装置から購入することができます。 </li></ol> 5。注射/手術<ol><li>並列インジェクターで注入するプロセスは、単一のピペットで注入すると非常によく似ています。 </li><li>高速ポンプが大型と小型のチューブとの間の関節に負荷をかける可能性があるので、ゆっくりとリフィルを使用する/このプロセスを通じて金利を注入することが不可欠です。推奨最大速度：ウイルスをロードするための2μlの/ minとし、ウイルスを注入するために0.1μL/分。 </li><li>麻酔マウスはstereotaxに配置し、実験全体を通して麻酔のままです。 </li><li>必要に応じてマウスを準備します。例えば、メスで、シングルカットは、目の間から耳の間に、皮膚の正中線を下に行われます。皮膚は、頭蓋骨を露出するために引き戻され、そして筋膜はオフに洗浄される。プルガラスピペットはstereotaxに添付されます。耳のバーの位置ブレグマとラムダまで調整されていますが、同じ高さに揃え、そしてそれらを結ぶ線はstereotaxのY -軸に平行であるようにされています。 stereotaxの軸は、注入の座標が計算される座標系に基づいて提供いたしております。定位はブレグマのガラスピペットの先端を持つゼロ化され、その後チップはX -及び注射部位の一つのY座標でわずかに頭蓋骨の上に配置されている。 </li><li>骨の極めて薄い層が残るまで、歯科用ドリルを使用して、先端下に頭蓋骨は慎重に離れて比べています。ガラスピペットが低くなる可能性が掘削中の穴が正しい位置を中心とされていることを確認するためにedと引き上げた。 30ゲージ針を用いて、層の小片を優しく正しいX -とY -座標、で、オフピックアップされるので、硬膜が露出されていること。この穴は、インジェクター（0.25ミリメートルワイド）のどれにも適合するのに十分な大きさにする必要があります。 図については、 図1Dを参照してください。このように、小さい、0.25ミリメートル幅の穴がで、頭蓋骨で作られていますX -及び各注射部位に対応するY -座標。 </li><li>ガラスピペットは、鋭利物容器に廃棄され、そしてカスタマイズされたインジェクタの配列は、定位クランプを使用してstereotaxに添付されます。 </li><li>正しくインジェクタの配列の角度を設定するために、二つの外側インジェクターは、以下のように、所定の基準点に校正するように選択される。インジェクタのいずれかが基準点と一致した後で、相対的なX -とこのインジェクタからの相対注射部位の間にY -の距離とその他のいずれかを考慮してください。 stereotaxの軸は、全体のインジェクタの配列は、これらの相対的な距離によってX -とY -方向に移動されるように調整されます。第二インジェクタが現在の参照ポイントに合っていない場合、金属製のカニューレを緩めて回転される。インジェクタの配列が正しく角度れるまで、このプロセスは反復的に繰り返されます。 </li><li>注射器は、2μlのポイント（またはそれ以上）になるまでウイルスにインジェクターを充填する前に、インジェクターは、シリコーンオイルが充填されています。これは、先端に詰まり、気泡や、簡単に、以前に記述し、注射器の後ろからシリコーンオイルで補充して、システム全体をしなくても、ハミルトンポンプを使用して前方にオイルを押すことによって削除できるように、緩衝地帯を提供します。 </li><li>パラフィルムの滅菌ピースは頭蓋骨に配置され、インジェクターを穏やかにパラフィルムの上に低下する。大幅に変化する深さ、カスタム粉砕した部分（例えば、階段状のオブジェクト）で座標を読み込む促進することができます。 </li><li>以下のパーツは、ウイルスの1μLが（少量が必要な場合次の量を縮小する必要がある）各サイトでロードすることを前提としています。ウイルスの&gt; 1μlを各サイトで注入されることを保証するためには、ウイルスの1.5μlを各インジェクタの先端にパラフィルムや階段の上にピペッティングします。 </li><li>ハミルトンのポンプの補充率は1μL/分に設定すると、ウイルスの1.2μlを各インジェクターに補充される。 </li><li>最長インジェクタの先端はブレグマに0で埋められ、その後、インジェクタの配列は、そのインジェクタのX -とY -座標にシフトされます。ウイルスがすべてのインジェクタの先端から出てきた見ることができるようになるまでにも脳に注入器の先端を挿入する前に、それは、ポンプの注入を開始するために時々お勧めです：目詰まりが問題になる場合は多くの深いターゲットが関与している場合、と言う。これは、インジェクタ先端に気泡を除去し、さらには目詰まりがないことを保証します。目詰まりの場合には、ハミルトンのポンプは静かに目詰まりをクリアするために、2μlの/分の高速で短いパルスを注入するために設定されています。 </li><li>インジェクタの配列は、正しいZ深度に、30ゲージの針で作った小さな穴から、低下する。 </li><li>ウイルスの1μlを0.1μL/分で、それぞれのインジェクタを介して注入される。 </li><li>注射は、30分間放置されています。 </li><li>インジェクタの配列が徐々に脳から抽出された後、ハミルトンのポンプは、各インジェクタの詰まりをチェックするためには、0.1μL/分の同速度で注入するために設定されています。 </li><li>その後インジェクターを2μL/ minでエタノールを1.5μlを補充して注入することによって洗浄されます。 </li><li>最後に、インジェクターは各ハミルトンシリンジに2μlのバッファーゾーンを維持するためにシリコーンオイルを再充填されています。 </li><li>すべての機器は、所属機関のバイオセーフティおよび動物使用のプロトコールにしたがって、処理の開始前および終了後に滅菌されるべきである。 </li></ol> 6。代表的な結果個々の時間は施術者のスキルに依存するが、並列インジェクタの配列は、セットアップと回復時間をカウントしない、インジェクターの数に等しい係数で大体手術をスピードアップします。 1マイクロリットルの注入のために、我々は通常、約直径1ミリメートル（ 図1E）の球で、レンチウイルスの発現を見た。注入の精度は、先端の位置の変動は、臨床試験から臨床試験に、約45ミクロン（先端の位置から目的の先端位置までの距離の標準偏差）となるようだ。 <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。設計、実装、およびパラレルウイルスインジェクタの配列の使用。、並列インジェクタアレイシステムの概略、3つの同時注射のために、トリプルインジェクタの構成を示す。B、に図示したようにトリプルパラレルインジェクタの配列の写真。 <st栄&gt; C、 定位クランプ、トップからアウトラインに示すようにD、効率的で、被害最小化のための手法の実例、脳内に注入器の挿入のために頭蓋骨に穴を開ける。。歯科用ドリルで、〜50ミクロンの厚さにダウン頭蓋骨薄く、その後使用してください小開頭を開くには鋭い針の先端。E、channelrhodopsin - 2を示す蛍光画像（ChR2）としてBに示すように、トリプルインジェクタの配列の標的に、3つのマウス皮質領域での細胞- GFP標識

<ol><li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing. Frontiers in Systems Neuroscience. 2009 Feburary 26, Slat Lake City, Utah, , Computational and systems neuroscience. (2009).</li>
<li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li>
<li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-color+optical+activation%2C+silencing%2C+and+desynchronization+of+neural+activity%2C+with+single-spike+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li>
<li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li>
<li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li>
<li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li>
</ol>

すべての手順は、実験動物のためのNIHのガイドにしたがっていたし、MITの動物実験とバイオセーフティ委員会により承認。

近年では、遺伝的に符号化された光学増感剤の数は、光の短いパルス（例えば、1,4,5,6,7,8に対応して、時間的に正確な方法で生体内で活性化し、沈黙するニューロンを有効にしている、11）。神経細胞が哺乳類の脳で明らかに感作されているとの主要なメソッドは、で、マウスからサルに至るまで、動物の脳にオプシンをコードする遺伝子を提供できるようなレンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）などのウイルスを介してです。安全で永続的なファッション（例えば、2,9,10）。ウイルスは、特に、ラットやサルなどの遺伝的モデル生物ではない生物に対して、遺伝子組換えを行うよりも高速TATを可能にし、オプシンのためにトランスジェニックのシナリオでは可能ではないかもしれない高い発現レベルを有効にすることができます。ここでは、全体の3次元の脳の構造がウイルス単一の外科のステップで、遺伝子を標的とすることを可能にする迅速なタイムスケール、&quot;回路レベルのトランスジェニック、&quot;で、作成することができる並列インジェクタの配列を示しています。インジェクタの配列は、各ドライブの高圧耐性のコネクタを介して、キャピラリー/フューズドシリカがポリイミド中に供給するそれぞれの注射器のセット、1つ以上の容積式ポンプで構成されています。毛細血管が割り当てられており、その後このように、ウイルスやその他の試薬は、脳領域の所望の設定に配信できるように、カスタム製粉定位位置決めボードで指定された所望の位置に、挿入。デバイスを使用するには、外科医は、まず、油を完全に流体サブシステムを埋めますウイルスに毛細血管をバックフィル、挿入する脳内のデバイス、および（&lt;0.1μL/ min）をゆっくりと試薬を注ぎこむ。 この技術は、（などのような動作時に正確なタイミングで複雑形状の構造のミリ秒スケールのシャットダウン（例えば海馬など）、冗長的に作用してもよい二国間の構造の時間的に正確な不活化などの実験の新しい種類、多種多様を有効にします左と右扁桃体）、および複数の離散的な脳領域の摂動（例えば、の部分集合をサイレンシングしながら、クロス領域の同期が地域に各地域内の活動に依存する、または刺激的な入力方法を学ぶために位相が接続された2つの領域を駆逐ターゲット）これらの入力の効果を仲介するための重要ないくつかのターゲットのかを理解するため。霊長類のもののような大きな脳の場合は、これで我々は最近、光細胞型に特異的神経活性化3、行動に関連した領域で活動を摂動すると、大きな、複雑な構造のウイルスのラベリングを必要とする可能性を実証している。薬物、神経修飾物質、神経伝達物質、あるいは細胞 - - 脳の複雑な3次元パターンで、時間的に正確な方法で我々は並列インジェクタの配列は、ほぼすべてのペイロードを注入するために使用されるかもしれないことに注意してください。最後に、翻訳の観点から、それは急速に、患者のカスタマイズ、遺伝子治療や薬物送達デバイスが急速になっている可能性があります特注設計の潜在的を使用して、病理学の様々な新しい治療法をサポートする、個々の脳の形状を一致させる作製光制御分子。 インジェクタの配列は、両方の空間的および容積、正確であるように設計されています。 X -とY -方向で、これは安価なミニミルを使用して非常に正確に配置された穴をあけることによって達成され、インジェクターに合わせて十分な大きさの穴と、インジェクターが互いに平行に保持されるように、そして正確に場所。 Z -方​​向で、インジェクターは定位手術そのものと同等の精度のレベルをできるように、定位固定装置を使用してトリミングされます。体積の精度は、ハミルトンのポンプの精度だけでなく、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）フィールドから適応がほぼゼロデッドボリュームコネクターから生じる。インジェクターは強いし、それがそのような鋼のカニューレなどの代替の大きな壁の厚させずに、圧力下で正確な形状と間隔を維持している十分な剛性がフューズドシリカキャピラリーチューブから作られています。小さな変更は、容易に実験の様々な並列インジェクタの配列を適合させることができます。例えば、ウイルスやより細かい間隔の小さいボリュームが必要な場合は、小さなキャピラリーチューブは、対応する小さなドリルビットと一緒に用いることができる。将来のデバイスは、サイズを（おそらく自由に動く動物の頭の上にマウントされるようなデバイスを可能にする）最小限に抑えるために、並列インジェクターの数を増やすために、マイクロ流体チャネルとポンプを利用してもよい。

<table><tbody><tr><td>ドレメルツール</td><td>ツール</td><td>ドレメル</td><td>3956-02</td><td></td></tr><tr><td>レーザーカッター</td><td>ツール</td><td>Universal Laser Systems</td><td>VLS2.30</td><td></td></tr><tr><td>ホットグルーガン</td><td>ツール</td><td>Stanley Bostitch</td><td>GR20</td><td></td></tr><tr><td>注入・吸引用シリンジポンプ（Hamiltonポンプ）</td><td>ツール</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;Hamiltonシリンジ</td><td>ツール</td><td>Hamilton社</td><td>701N</td><td>注射部位ごとに1つ必要です</td></tr><tr><td>マウス立体定位固定装置</td><td>ツール</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725D</td><td></td></tr><tr><td>Modela ミニミル</td><td>ツール</td><td>ローランド</td><td>MDX-15</td><td></td></tr><tr><td>0.011&quot; ミニミル用ドリルビット径</td><td>ツール</td><td>McMaster-Carr</td><td>8915A12</td><td></td></tr><tr><td>1/32&quot; ミニミル用ドリルビット径</td><td>ツール</td><td>McMaster-Carr</td><td>8848A35</td><td></td></tr><tr><td>高速歯科用ドリル</td><td>ツール</td><td>リンクス</td><td>333</td><td></td></tr><tr><td>歯科用ドリルのアクセサリー</td><td>ツール</td><td>ピアソン・アセスメント</td><td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td><td></td></tr><tr><td> </td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>外径（OD）1.5mmのステンレス製カニューレ</td><td>材料</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-15R</td><td></td></tr><tr><td>1-72 バインディング用スロット付き機械ねじ</td><td>材料</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>MX-0172B</td><td></td></tr><tr><td>1-72 六角ナット</td><td>材料</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HNX-0172</td><td></td></tr><tr><td>PCBユニバーサル基板, 1/32&quot; 厚い</td><td>材料</td><td>Digi-Key</td><td>PC57-T-ND</td><td></td></tr><tr><td>アクリル板、1/8インチ&quot; 厚い</td><td>材料</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K239</td><td></td></tr><tr><td>HPLCコネクター</td><td>材料</td><td>Upchurch Scientific</td><td>F-252、P-627、P-200、P-235、F-240（これらの一部は10個パックで購入可能です。単に次を追加してください。 &amp;#8216;x&amp;rsquo; （部品番号の末尾まで）</td><td>注入部位ごとに1回につき1本必要である。ただし、F-252、P-627、およびP-235は再利用可能である。</td></tr><tr><td>溶融石英キャピラリチューブ、外径：245 &amp;mu;m, ID: 100 &amp;mu;m</td><td>材料</td><td>Polymicro Technologies</td><td>2000022-10M</td><td></td></tr><tr><td>5分速硬化汎用エポキシ樹脂</td><td>材料</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td>5分硬化汎用エポキシ樹脂</td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ .066 x .095 インチ</td><td>材料</td><td>VWR international</td><td>63018-827</td><td></td></tr></tbody></table>

無傷の3 - d脳の回路のウイルス標的のためのスケーラブルな流体インジェクタの配列

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

神経回路の我々の理解 - 大幅に急速に複雑な3遺伝子を標的とするための技術によって促進される - 彼らが補助する感覚、思考、感情、そして行動、およびそれらがどのように神経や精神疾患で破損しているが、こと計算を仲介する方法 - の迅速な作成を可能次元神経回路、&quot;回路レベルのトランスジェニックを。&quot;我々は最近、光感受性タンパク質のウイルスのエンコーディングは、ミリ秒のタイムスケールの活性化に特定の種類の細胞を感作し、無傷の脳内で黙らせることのできる方法を開発した。ここでは、脳の3次元構造内で定義される点の数十にウイルス（または他の液体）を供給可能なインジェクタの配列の設計と実装を示す（<strong&gt;図。 1A、1B</strong&gt;）。インジェクタの配列は、各ドライブの高圧耐性のコネクタを介して、キャピラリー/フューズドシリカがポリイミド中に供給するそれぞれの注射器のセット、1つ以上の容積式ポンプで構成されています。毛細血管が割り当てられており、その後このように、ウイルスやその他の試薬は、脳領域の所望の設定に配信できるように、カスタム製粉定位位置決めボードで指定された所望の位置に、挿入。デバイスを使用するには、外科医は、まず、油を完全に流体サブシステムを埋めますウイルスに毛細血管をバックフィル、挿入する脳内のデバイス、および（&lt;0.1マイクロリットル/分）をゆっくりと試薬を注ぎこむ。インジェクタの配列の並列性は、光活性化と定義されている脳の回路のサイレンシングを有効にするような光学増感剤などのウイルスのペイロードを持つ全体の神経回路の迅速、正確、そして堅牢なラベリングを容易にします。このような脳領域の所望のセットへの光配信用光ファイバアレイなどの他の技術と共に、我々は、無傷の脳の因果神経機能のプロービングの体系を可能にするツールボックスを作成したいと考えています。この技術は、哺乳類において回路に焦点を当てた神経科学へのそのような体系的なアプローチを開いて、そしてそのようなヒト以外の霊長類などの大型動物での脳領域の標識促進するだけでなく、細胞特異的光制御の補綴の臨床トランスレーショナルのパスを開くことができない場合があります、その精度は、難治性の脳疾患の治療の改善を有効にすることができます。最後に、ここで説明するようなデバイスは、容易にユーザーによるカスタマイズが可能な方法で、3次元構造に、そのような幹細胞と薬理学的作用物質のような他のペイロードの正確なタイミングによる流体の配信を、容易にすることができる。

神経回路の制御と解析<em&gt; in vivoで</em&gt;脳領域の所望の3次元セットにウイルスや他の試薬の配信のための技術によって促進される。我々は複雑な脳の回路の光学的操作を可能にする、カスタマイズされた流体インジェクタの配列の製作、およびウイルスによりエンコードされた光学増感剤の配信を実証する。

無傷の3 - D脳の回路のウイルス標的のためのスケーラブルな流体インジェクタの配列

神経回路が、感覚、思考、感情、および行動を支える計算をどのように媒介し、またそれらがどのように損なわれるかという点についての我々の理解は、...

2枚の長方形のアクリル板をレーザーカットし、それらを組み立てて定位固定クランプを作成します。これにより、インジェクターアレイを定位座標に対して強固に固定することができます。シリンジポンプに、目的の脳回路用のポリエチレンチューブが接続されたシリンジを装着します。フライス盤を用いて穴をあけ、そこに溶融石英チューブを挿入することで、インジェクターを形成します。インジェクターをクランプに可逆的に取り付け、目的の脳回路を標的にするようにトリミングします。各インジェクターは、単一のポリエチレンチャンネルに接続されています。システムの使用準備として、シリンジを用いてシステム内にシリコンオイルを満たし、その後、インジェクターに流体試薬を充填します。次に、パラレルインジェクターを脳の標的部位に挿入し、試薬を注入します。こんにちは。MIT合成ニューロバイオロジーグループのステファニー・チャンです。これまで、空間的に複雑な脳回路で遺伝子を発現させるには、時間と費用がかかるトランスジェニック動物の作製か、あるいは片側ずつ行う必要がある手間のかかるウイルス注入プロセスのいずれかが必要でした。本日は、脳内の複雑な三次元パターンに液体を注入できるパラレルインジェクターアレイの構築方法とその活用法について解説します。このアレイを用いることで、一連のインジェクターを通じてウイルスを並行して注入し、すべての標的部位に同時に到達させることができ、回路特異的なトランスジェニックマウスを迅速に作製することが可能です。このインジェクターは、脳内の複雑な分布部位に任意の液体試薬を注入するために使用できます。本日の目的は、光感受性タンパク質をコードするウイルスを導入し、特定の回路内の特定の細胞タイプを時間的に精密な方法でオン・オフにすることです。当研究室では、この技術を、回路特異的に光を照射する光ファイバーアレイと組み合わせて使用しています。それでは、始めていきましょう。まず、インジェクターアレイを保持し、ステレオタキシスに装着可能なステレオタキシスクランプを作製します。クランプの作製には以下のアイテムが必要です。一方端を平らにした外径（OD）1.5 mm、長さ2インチのスチール製カニューレ、約0.5 by 0.5 cmの小さなPCBプロトボード、および2つの同一サイズの長方形の部品です。2枚のアクリル製長方形は、1/8インチ厚のアクリル板から1/2 × 3/8インチのサイズに切り出します。対角にある2つの角に円形の穴を開けます。1つ目の穴の直径は1.5 mmとし、金属製カニューレをしっかりと固定できる最小限の大きさにしてください。2つ目の穴の直径は1/16インチにする必要があります。1つの長方形の1.5 mmの穴に金属製カニューレを挿入し、次に2つ目の長方形の1.5 mmの穴に通します。カニューレの下端を下の長方形の底面に合わせ、ホッケースティックのような形状にし、2つの長方形の間にスペーサーを配置します。この工程では、スペーサーを2つの長方形の間にしっかりと保持したまま、造形用粘土を使用して固定すると便利です。カニューレ周囲と1.5 millimeterの穴の周りにホットグルーを使用して、この構造を固定します。グルーが乾燥して固まるまで、スペーサーが長方形部分に接着されないように注意してください。1/16インチの穴に1-72六角ナットを掛け、長方形の反対側から1-72ネジをねじ込みます。ナットの周囲に5分速乾エポキシ樹脂を少量滴下し、長方形のパーツに固定します。この際、ナットのネジ山やネジにエポキシ樹脂が入らないように注意してください。エポキシ樹脂が硬化した後、長方形の上側にある1/16インチの穴に1-72ネジを挿入し、ナットにねじ込みます。モデリングクレイを取り除き、ネジを締めることでスペーサーをしっかりと固定できることを確認します。インジェクターアレイシステムは、脳内のほぼあらゆる座標に合わせてカスタマイズ可能です。まず、対象種の脳アトラスで目的の注入部位の座標を特定し、ステレオタキシスで使用する適切な座標に変換します。このデモンストレーションでは、マウスを使用し、注射部位を3か所とするため、注入用のチューブを3本用意します。X、Y、Z座標は、マウス脳アトラスの正中外側、前方、後方、および腹側の座標に対応します。次に、Harvard Apparatus社製のような注射・吸引シリンジポンプに、10 µLのHamiltonシリンジを3本セットします。各Hamiltonシリンジの針に、長さ3フィートのポリエチレンチューブをそれぞれしっかりと取り付けます。F 2 52チューブスリーブを開口端にスライドさせ、P 2 35ナットとP 200 falを用いてP 6 27チューブアダプターに取り付けます。カスタマイズされたインジェクターアレイを作製するには、modelaミニミルと直径0.011 inchのドリルビットを使用し、厚さ1/32 inchのPCBプロトボードのスペースに3つの穴をあけます。注入部位の相対的なXおよびY座標に従って3つの穴をあけ、ボードをミルから取り出す前に、直径1/32 inchのドリルビットを用いて小さな穴の周囲に矩形を切り出します。次に、個々のインジェクターを各穴の中ほどまで挿入し、互いに平行にしっかりと固定します。エポキシ樹脂でボードに固定し、インジェクターアレイを形成します。その後、インジェクターアレイを脳定位固定装置のクランプに取り付けます。プロトボードの一角をアクリル製の長方形の間に配置し、ステレオタキシスクランプのネジを締めます。その後、ステレオタキシスの取り付け機構を使用して、クランプの金属カニューレをステレオタキシスに取り付けます。以下の手順は顕微鏡下で行い、他のインジェクターにぶつかることなく直線的なエッジで側面からアプローチできる外側のインジェクターのいずれかに対して実施します。プロトボードの底面からはみ出している先端部分をカットします。ドレメルツールを使用して先端を平らにします。次に、脳定位固定装置のアームの可動範囲内で安定した基準点を決め、外側のインジェクターの平らな先端がこの基準点に来るようにインジェクターアレイを移動させます。2つ目のインジェクターと、それに対応する座標を選択します。1つ目と2つ目のインジェクター座標の高さ（Z方向）の相対的な差分に合わせて、インジェクターアレイをZ軸方向に移動させます。この2つ目のインジェクターをトリミングし、チップが基準点の高さになるように調整した後、ドレメルツールで平坦にします。インジェクターアレイをX方向およびY方向に移動させることで、インジェクターの先端と基準点との比較を容易にすることができます。残りのインジェクターに対してもこのトリミング工程を繰り返した後、インジェクターアレイをシステム全体に組み込む準備が整います。システム全体の組み立てには、事前に作製した定位固定クランプとカスタマイズしたインジェクターアレイが必要です。インジェクターアレイを滅菌した後、各インジェクターの背面（トリミングされていない端）を青色のF240チューブスリーブに挿入します。P235ナットとP200フェルールを使用して、インジェクターの背面を、ポリエチレンチューブでハミルトンポンプに接続済みのネジ付きアダプターに取り付けます。27ゲージの針を用いて、ハミルトンシリンジの背面から滅菌済みシリコンオイルを注入し、ハミルトンシリンジからインジェクターの先端までシステム全体を満たします。気泡が混入しないよう細心の注意を払ってください。気泡が入ると、ウイルス注入量が不正確になったり、ウイルスが全く注入されなかったりすることがあります。ハミルトンポンプにハミルトンシリンジを装着する際は、シリンジ内に可能な限り多くのシリコンオイルを保持させてください。本実験のように2本以上のシリンジが必要な場合は、ハミルトンポンプにスペーサーを配置することができます。あるいは、一度に最大10本のシリンジを保持できるマルチラックアップグレードキットをHarvard Apparatusから購入することも可能です。マウスの脳にウイルスを注入するには、まず動物実験プロトコルに従って適切な鎮痛剤を投与します。麻酔をかけたマウスを脳立体定位固定装置にセットし、足指へのピンチテストによって動物が十分に麻酔されていることを確認してください。次に、両眼の間から両耳の間まで、皮膚の中央線に沿って1本の切開を加えます。皮膚を剥がして頭蓋骨を露出し、筋膜をきれいに取り除きます。ステレオタキシス装置にガラス製ピペットを取り付けます。bgmaとlambdaが同じ高さに揃い、それらを結ぶ線がステレオタキシス装置のY軸と平行になるまで、耳状固定バーの位置を調整します。ガラスピペットの先端をbgmaに合わせてステレオタキシス装置をゼロ点に設定し、その後、注射部位の一方のxおよびY座標において、先端を頭蓋骨のわずかに上に配置します。歯科用ドリルを用いて、骨が極めて薄い層だけが残るまで、先端の下の頭蓋骨を慎重に削ります。30ゲージの針を用いて、正しいxおよびy座標にあるその薄い層をわずかに取り除き、硬膜を露出させます。この穴は、インジェクター1本がこのようにちょうど収まる程度の大きさにします。各注入部位に対応するxおよびy座標に、幅0.25 millimeterの小さな穴を頭蓋骨に開けます。ドリリングの完了後、ガラス製アライメントピペットを取り外し、ステレオタキシスクランプを用いてカスタマイズしたインジェクターアレイをステレオタキシスに装着します。インジェクターアレイの角度を正しく設定するために、特定の基準点に合わせて校正する2つの外側インジェクターを選択します。一方のインジェクターを基準点に合わせた後、このインジェクターともう一方のインジェクターの注入部位との間の相対的なX方向およびY方向の距離を確認します。この相対距離に基づいて、インジェクターアレイをx方向およびy方向に移動させます。2つ目のインジェクターが基準点に揃っていない場合は、金属製カニューレを緩めて回転させます。インジェクターアレイが正しく角度付けられるまで、このプロセスを繰り返し行います。Hamiltonポンプの補充速度を1 µL/minに設定し、シリンジが2 µL以上の位置になるまでシリコンオイルを注入して補充します。これにより、オイルのバッファー量が確保されるため、チップ内で気泡が生じたり詰まりが発生したりしても、前述のようにシリンジ後方からシステム全体にシリコンオイルを補充し直すことなく、Hamiltonポンプを用いてオイルを前方に押し出すことで簡単に除去できます。清潔なパラフィルムを頭蓋骨上に置き、インジェクターをパラフィルム上までゆっくりと降ろします。各部位に1 µLのウイルスを注入する場合、1 µL/minの同一の補充速度で、各部位につき1.5 µLのウイルスをパラフィルム上にピペッティングします。各インジェクターに1.2 µLのウイルスを補充します。最も長いインジェクターの先端をbgmaでゼロ点合わせし、その後、インジェクターアレイをそのインジェクターのxおよびY座標まで移動させます。30ゲージ針で作製した小さな穴を通してインジェクターアレイを下げ、Z方向の深さを調整します。各インジェクターから、0.1 µL/min以下の速度で1 µLのウイルスを注入します。注入液が拡散するまで、30分間そのままにします。30分後、インジェクターアレイを脳からゆっくりと抽出します。その後、各インジェクターの詰まりを確認するため、Hamiltonポンプを同じ0.1 microliters per minuteの速度で注入するように設定します。その後、2 µLのエタノールを2 µL/minの速度で充填および注入し、インジェクターを洗浄します。最後に、各ハミルトンシリンジ内に2 µLのバッファーゾーンを維持するため、インジェクターにシリコンオイルを再充填します。この図は、マウス脳の分散した部位にウイルス試薬を投与するために、先ほど示した3本のカニューレを含むインジェクターアレイを使用した結果を示しています。このケースでは、ウイルスの遺伝的ペイロードに蛍光分子GFPが含まれているため、1段階の手順で3つの蛍光領域に標識された細胞が得られます。原理的には、任意の数のカニューレを使用してウイルス注入器アレイを構築することが可能です。ここでは例として、海馬のCA1領域を両側性に標的とする、16個の注入器を備えた注入器アレイを示します。本日ご紹介したプロトコルを用いることで、脳内に3次元的なパターンでウイルスを導入し、回路レベルのトランスジェニックを効果的に作成することが可能になります。さらに、この並列インジェクターアレイは、あらゆる液性試薬を脳内に導入するためにも使用でき、例えば、頭部固定して行動させる動物の特定の神経回路に、ドパミン作動性アゴニストをパターン状に導入することなどが可能になると考えられます。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

scalable-fluidic-injector-arrays-for-viral-targeting-intact-3-d-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

この記事では、50μmのルーメンでガラスキャピラリー針を作成する方法を示しています。この手法は、大幅に、脳の損傷を軽減薬の受動拡散を最小限に抑え、齧歯類の脳に正確なターゲティングが可能になります。...

薬の配達のためのMicroinjections、ウイルスベクター、または細胞移植で脳深部構造のターゲティング

ここでは、視覚野の神経細胞とグリア細胞の蛍光標識用AAVベクターの頭蓋内注射を提示する。...

アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

出典: Pereira, M. et al., In Vivo Direct Reprogramming of Resident Gial Cells into Interneurons by Intentrebral Injection of Viral Vectors.J. Vis.

マウスモデルにおけるグリア細胞リプログラミングのためのウイルスベクターの定位注射

ここでは、新生児マウスの脳へのアデノ随伴ウイルスの脳室内注射による広範なニューロン伝達の技術を示しています。...

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

脳はよくインビトロまたは異所性の分析によって示されていない資質を持つユニークなサイトです。再現性のある場所および成長特性を有する同所性マウスモデルを確実に定位固定装置及び低圧シリンジポンプを用いて頭蓋内の注射を使用して作成することができる。...

解剖学的に正確な作成と人間の脳の腫瘍の再現性頭蓋内異種移植片

CRISPR / Cas9システムは、科学界にターゲットを絞ったゲノム編集がアクセス可能で、手頃な価格にする可能性を提供しています。このプロトコルは、CRISPR / Cas9システムを使用して、目的の遺伝子をノックアウトしてから、成体マウスの脳に定位的にそれらを注入するウイルスを作成する方法を実証することを意図しています。...

デザイン、パッケージング、および定位注射を介して高力価CRISPRレトロウイルスおよびレンチウイルスの配信

ここでは、マカク脳の大きな皮質領域にわたって光遺伝学的発現を達成するための効率的かつ簡素化されたアプローチとして、皮質へのウイルスベクターの磁気共鳴(MR)誘導対流増強送達(CED)を示す。...

オンラインMRI画像のガイダンスの下でレソスマカクの皮質への光遺伝学アデノ関連ウイルスベクターの対流強化された配信

ここでは、角度付きコロナアプローチを使用して(空間的な制限のために)困難で到達しにくい脳領域を標的にすることができる定位的手順を説明します。このプロトコルは、マウスおよびラットモデルの両方に適応可能であり、カニューレ移植およびウイルス構築物のマイクロインジェクションを含む多様な神経科学的用途に適用することができる。...

多目的神経科学技術のための適応可能な角度付き定位アプローチ

このプロトコルは、脳スライス中の単一の神経幹細胞およびニューロンへのマイクロインジェクションのためのロボットプラットフォームの使用を実証する。この技術は多目的であり、高い空間分解能を持つ組織の細胞を追跡する方法を提供する。...

ロボットマイクロインジェクションを用いた脳スライスにおける単一神経幹細胞とニューロンの操作

現在実施されているように、非ヒト霊長類のオプトジェネティクスは、脳へのウイルスベクターの注射を必要とします。最適な注入方法は、信頼性が高く、多くのアプリケーションにとって、死後の組織学で容易かつ明確に特定される任意の深さの個々の部位を標的にできる必要があります。これらの特性を有する注入方法が提示される。...

非ヒト霊長類脳における麻酔および覚醒行動のための光遺伝学のためのAAVベクターの注射

インビボカルシウムイメージングのミニスコープは、自由に行動するマウスのニューロンダイナミクスとマイクロサーキットを研究するための強力な技術です。このプロトコルは、ミニスコープを使用して良好なin...

生体 内 カルシウムイメージングのための定位ウイルス注入および勾配指数レンズ移植

学ぶ 並列流体インジェクタアレイを用いた無傷の3D脳回路へのウイルス標的化法。光遺伝学的操作により神経回路の精密解析が可能となり、脳機能研究の効率化に貢献します。

無傷の3 - D脳の回路のウイルス標的のためのスケーラブルな流体インジェクタの配列

さらに動画を探す