マイクロプリズムを使ってDeep皮質層のin vivoイメージング

マウスの新皮質に挿入直角microprismsは通常、スライスに見られる視点を持つ複数の皮質層の深いイメージングが可能になります。一ミリmicroprismsは、広い視野（〜900μm）と樹状突起棘を解決するために十分な空間解像度を提供します。我々はV層神経イメージングとmicroprismsを使用して新皮質の血管イメージングを示す。

蛍光顕微鏡法は、特に脳組織のような光散乱性の高い材料において、組織の深部構造を画像化する能力に限界があります。2光子顕微鏡の場合でも、新皮質表面から500ミクロンより深い神経構造の高品質なin vivo画像を作成することは非常に困難です。ここで、緑色の線は500ミクロンの深さを示しています。

一般に、新皮質層4、5、および6は、表面から500ミクロン以上離れています。新皮質に挿入された1ミリメートルのガラスマイクロプリズムが、表層と深部皮質層に光を中継する方法を示します。この手法をマウスで使用することで、1ミリメートルの視野を持ち、通常はスライスされた脳組織にしか見られないイメージングの視点で、6つの皮質層すべてを同時に視覚化することが可能になります。

マイクロプリズムは、長い頂端樹状突起を持つ第5層パラメタル細胞体と新皮質の複雑な血管網を可視化できる広い視野を提供し、樹状突起スパインと微小毛細血管を通る赤血球の流れを分解できる空間分解能を維持します。私の名前はトーマス・チアで、イェール大学の生物医学工学科のマイケル・レヴィン教授の研究室の大学院生です。このビデオで説明するプロトコルは、マウス新皮質で1ミリメートルの直角ガラスマイクロプリズムを使用して、1ミリメートルの深さの構造の蛍光画像を生成する方法です。

使用しているマイクロプリズムは、オプトシグマ社から購入したBKセブンガラスを使用した1ミリ直角プリズムです。マイクロプリズムは、可能な限り鉗子を使用して取り扱われます。マイクロプリズムの斜辺は、400〜2000ナノメートルで97%を超える反射率を提供するために、強化銀でコーティングされています。

これにより、レーザー励起光と許容される蛍光の両方の内部反射が得られます。私たちは、小動物のイメージングが可能なカスタムメイドの2光子顕微鏡を使用しています。定位装置に取り付けられた動物は、3軸の電動ステージ上に置かれます。

顕微鏡は、スキャン画像を実行しているWindowsPCに接続されています。Software scan Imageは、Polo GudoらによってMATLABで書かれた画像取得ソフトウェアです。マイクロプリズムイメージングでは、10 24 x 10 24またはfive 12 x five 12ピクセルの解像度で画像を収集します。

さらに、通常、ラインあたり2ミリ秒またはラインあたり4ミリ秒でスキャンします。このプロトコルの重要な側面は、マイクロプリズムと組み合わせて使用する顕微鏡対物レンズのタイプです。実験では、2種類の目的関数が使用されます。

左側の対物レンズは、広視野イメージング用の低開口数空気対物レンズで、この場合は4 x 0.28 NAのオリンパス対物レンズです。右側の対物レンズは、40 x 0.60 の高 NA 空気対物レンズで、ガラスの 0 から 2 mm のガラスによって誘発される球面収差を最小限に抑えることができるガラス補正環が付いています。マウスの手術とマイクロプリズムの挿入を準備するためには、最初のステップは、動物を外科的処置に適したレベルまで適切に麻酔することです。

まず、動物の体重は確立された投与量に基づいて記録されます。適量のケタミンとキシラジンのカクテルを注射器に引き込みます。麻酔薬は、28ゲージの針を使用してIP注射によって送達されます。

マウスが外科的処置に適した麻酔面に入ると、動物の頭の毛の大部分は、40番のブレードで振戦を使用して剃り落とされます。次に、頭の残りの毛にネアを塗布して、マイクロプリズムの邪魔になる可能性のある毛のない表面を作成します。イメージング中、5分後、NAを綿の先端綿棒を使用して洗浄し、麻酔をかけた動物をマウス定位装置に適切に配置する。

外科的処置とイメージングセッションの間、動物は摂氏36度に設定された水で満たされた加熱パッドの上に置かれます。動物の頭を所定の位置に適切に固定すると、頭蓋骨の内側線に1つのきれいな切開が行われます。皮膚を分離するために、少量の3%過酸化水素を綿棒に置き、頭蓋骨に塗布して、頭蓋骨と皮膚の間の膜を取り除きます。

過酸化水素はまた、開頭術を行い、マイクロプリズムを挿入する場所を知る上で主要なランドマークであるBMAを明らかにするのにも役立ちます。開頭術を開始する前に、イヤーバーとバイトバーを適切に調整して、露出した頭蓋骨が基本的にテーブルと同じ高さになるように傾けます。これにより、開頭術のためのより良いプラットフォームが提供されます。

小さな歯科用バリは、開頭術用のドレメルツールに接続されています。速度を約 7 、 000 から 10 、 000 RPM に設定しました。歯のバリは、骨に四角い溝が確立されるまで、頭蓋骨に沿ってすくい取られます。

正方形の辺の長さは約2〜3ミリメートルで、中央に配置されています。1.5ミリメートルのコドルと1ミリメートルの横レマが骨を薄くし続け、頭蓋骨に小さな開口部が作られます。一対の鉗子で骨のフラップを持ち上げることができます。

マイクロプリズムを皮質に挿入する前に、硬膜を取り外す必要があります。出血は、血液が表面で数分間凝固するようにすることで最もよく制御されます。その後、凝固した血液を外科用スポンジを使用して除去し、プリズムと皮質の位置合わせを支援します。

マイクロプリズムの垂直面は、鉗子のハンドルと平行に並んでいます。プリズムを適切に保持した状態で、マイクロプリズム全体がプリズムの上部が新皮質表面と同じ高さになるまで挿入されます。ここでは、プリズムが新皮質に静止しているのを見ることができます。

正しく挿入されると、マイクロプリズムは適切な位置に留まるはずです。結果として生じる出血は最小限で、小さな外科用スポンジで吸収できます。プリズムが所定の位置に配置されると、動物は動物と一緒にイメージングする準備が整います。

低倍率の対物レンズの下では、脳の表面にあるマイクロプリズム上をレーザーラスターがスキャンしているのを見ることができます。ここでは、黄色の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスから採取した画像の代表的な例をいくつか紹介します。マイクロプリズムを使用した第5層皮質ニューロンでは、皮質表面の約1ミリメートル下にある第5層に大きなパラメタル細胞体の集まりを見ることができます。

また、ガラス補正環を備えた高開口数対物レンズを使用して房状に分岐する前に、すべての表層を貫通する頂端樹状突起も見られ、この場合、樹状突起棘を解決することが可能です。第5層パラメタルニューロンの頂端樹状突起では、樹状突起スパインはサブミクロン構造であり、黄色の矢印を使用して画像内でいくつかが識別されています。また、確立された尾静脈注射技術を使用して、フルオレセインデキストランなどの蛍光染料で皮質血管を標識することもできます。

この技術を使用すると、PIAに向かって伸びる深い層から大口径の血管が伸び、分岐してマイクロキャピラリーのネットワークを形成しているのを見ることができます。新皮質のこの微細な毛細血管のネットワークは、高開口数対物レンズを使用して最もよく評価されます。また、ラインスキャンにより深部新皮質毛細血管からの赤血球の速度とフラックスを測定することが可能です。

赤い線は、マイクロプリズムを通した毛細管像上のラインスキャンパターンを示しています。赤血球は蛍光色素を吸収しないため、暗い縞として現れます。下部の画像は、一方の AE に空間次元、もう一方に時間次元を持つライン スキャンの結果です。

これからのAEは、毛細血管を通る赤血球のフラックスと速度を計算できます。マイクロプリズムを動物に使用した後は、数回再利用できます。ただし、残っている生物学的物質を取り除くには、適切に洗浄する必要があります。

これは、プリズムを少量の塩酸に浸し、続いてメタノールに浸すことで達成できます。その後、清潔なマイクロプリズムは、機能が使用されるまでレンズペーパーで包むことができます。これで、マウスのin vivo皮質イメージングにマイクロプリズムを使用するプロトコルは終了です。

イメージング実験でマイクロプリズムを使用することは比較的簡単で、新皮質のin vivo研究に関して多くの利点があります。これが興味深い手法であり、将来あなたの研究室で使用できるものであることがわかったことを願っています。ご覧いただきありがとうございます、そして幸運を祈ります。