エレクトロスプレーイオン化質量分析法を用いて酵母Lipidomeの定量評価

このプロトコルにより、酵母脂質の主要成分を迅速に分析することができます。それは、酵母細胞を収穫して洗浄することから始まります。洗浄した細胞を1〜2個のクロロホルム、メタノール混合物に入れ、ガラスビーズで溶解します。

クロロホルムと水を加えると、2つの相が分離されます。有機相を回収し、乾燥させ、脂質膜をクロロホルムに溶解して保存し、質量分析に先立って保存します。抽出した脂質をクロロホルムとメタノールで水酸化アンモニウムで希釈し、内部標準物質の混合物を添加します。

これで、脂質溶液を質量分析計に直接注入できます。こんにちは、コンコルディア大学生物学部のウラジミール・テコ研究室のサイモン・ボークです。今日は、質量分析法を使用して酵母脂質を定量する方法を紹介します。

私たちの研究室では、この手順を使用して、さまざまな成長条件下での酵母脂質の変化を研究しています。それでは始めましょう。この手順を開始するには、以前に調製した凍結酵母ペレットを1.6ミリリットルの氷、冷たい蒸留水に懸濁し、1.6ミリリットルの細胞懸濁液を高速ガラス遠心分離管に移します。

この手順全体を通して、抽出された脂質によるすべての操作は、ガラスピペットまたはシリンジを使用して行われることに注意してください。プラスチックは大きなバックグラウンドシグナルを生成するため、クロロホルムと接触した場合は、6ミリリットルのクロロホルムメタノール混合物を1対2の比率で加え、0.8ミリリットルのガラスビーズをアイノアチューブで測定して細胞懸濁液に追加して脂質抽出を開始します。クロロホルム、メタノール、および水中に懸濁した酵母の1対2対0.8の比率が維持されている限り、正確な量は重要ではありません。渦動。

細胞懸濁液とガラスビーズを1分間ずつ2回混合し、さらに2ミリリットルのクロロホルムを加えて穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートし、時々混合します。5分間のインキュベーション後、2ミリリットルの蒸留水を加え、穏やかに混ぜます。その後、室温で5分間インキュベートし、時々混合します。

ここでも、特定の体積よりも、クロロホルム、メタノール、および水の2対2対1.8の比率を維持することがより重要です。2回目のインキュベーションが完了したとき。室温で3000Gsで5分間遠心分離し、この最初の抽出からすべての上清を新しい高速ガラス遠心チューブに収集し、残りの細胞ペレットに3.2ミリリットルのクロロホルムを添加して、第2の脂質抽出を行う。

細胞ペレットを添加したクロロホルムを1回ずつ2回、1分間ボルテックスします。次に、室温で3000Gで5分間遠心分離し、この2回目の抽出からの上清を最初の抽出後に収集した上清に加えます。次に、収集した上清を5分間遠心分離します。

室温で3000Gsの場合、抽出された脂質は下部有機相に溶解します。上部水相を廃棄し、下部相を新しい高速ガラス遠心分離管に移します。質量分析計の遠心分離機でよりクリーンなスペクトルを生成するには、室温で3000Gsで5分間有機相を行い、上清全体をガラスバイアルに移します。

溶解した脂質を窒素下で乾燥させ、乾燥した脂質フィルムを500マイクロリットルのクロロホルムに溶解し、質量分析でサンプルを分析する準備ができるまで摂氏マイナス20度で保存します。まず、添付の書面によるプロトコルに記載されている表1に記載されているように、クロロホルム中の脂質の標準混合物を調製します。各脂質は異なるクラスを表します。

この溶液は、抽出した脂質を質量分析計に注入する前に、後で使用するために摂氏マイナス20度で保存することができます。サンプルの10マイクロリットルを脂質の標準混合物の10マイクロリットルと組み合わせた。標準とサンプルの比率は必要に応じて変更できることに注意してください。

サンプルと標準脂質の混合物を、1分間に1マイクロリットルの流量で動作するナノエレクトロスプレーソースを備えたマイクロマスQからF 2質量分析計を使用して分離します。設定の詳細については、付属の書面によるプロトコルの表 2 を参照してください。Q to F質量分析計の高分解能を使用することは有利ですが、必須の要件ではありません。

正確な装置パラメータは、質量分析計によって異なります。データ取得後、マススペクトルが平滑化され、バックグラウンドが減算され、ピークが中央に配置されます。最後に、ピークリストをExcelにエクスポートします。

次に、各脂質ガラスのピークを内部標準に正規化します。アプリケーションによっては、脱同位体やデコンボリューションなどの後処理をさらに行う必要がある場合があります。この方法により、酵母脂質の主要成分を迅速かつ詳細に測定できます。

ここでは、de 同位体 de 畳み込まれ、その内部標準に正規化された1つの脂質を強調しました。ここでは、酵母脂質を単離する方法と、エレクトロディスプレイイオン化質量分析法を使用して酵母脂質を測定する方法を示しました。この手順を実行するときは、プラスチックの使用を避け、サンプルを線形濃度の範囲に保つことを覚えておくことが重要です。

この方法は非常に柔軟性があり、多くのボリュームで必要に応じて変更できます。この抽出プロトコルは、薄層クロマトグラフィーや多次元質量分析法など、脂質分析の他の方法にも適しています。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。