Name: 最終分化を研究するための準備とラットの水晶体上皮外植片の培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: 学ぶラットの水晶体上皮外植片の培養法とFGF-2による最終分化の誘導。免疫蛍光顕微鏡で遺伝子発現とシグナル伝達を解析し、水晶体の発生と疾患の理解に貢献する研究手法を習得する。

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水晶体上皮片の調製は、ドクタージョンマカヴォイ9の実験室で生まれたの方法から適合されています。この作品は、国立眼研究所、学内研究プログラムZ01 - EY000238 - 22によって資金を供給される

パート1：レンズの取り外し材料と試薬： <ol><li>ミクロ解剖ハサミ、湾曲した、鈍のヒント、（そのようなas.RS - 5983、Roboz手術器械株式会社、株式会社、ゲイサーズバーグ、MD）、ミクロ解剖ピンセット、湾​​曲した先端（などRoboz＃RS5137など）。 </li><li>懸濁培地：培地199を含む0.1％ウシ血清アルブミン、100単位/ mlペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンは、2.5μg/ mlのアムホテリシンBの試薬は、Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州から入手できます。 </li></ol>手順： <ol><li>国立衛生研究所、ベセスダ、MDから提供されたガイドラインに準拠した新生児ラットを（2-4日齢）安楽死させる。 </li><li>手術用ハサミでまぶたを削除します。外側に膨らみに目を強制的に目のソケットの反対側に湾曲したピンセットで軽く押してください。はさみと眼の後部側に小さな切開を加えます。切開反対眼の側面にピンセットで押すことによって、レンズと付属の硝子体の少量は、レンズが曲がったピンセットで拾い上げできるように、破裂を通って強制することができます。ケアは、水晶体嚢を破壊しないように注意してください。 </li><li> 5ミリリットル暖かい、無菌懸濁培地を含む60ミリメートルプラスチック組織培養皿にレンズを転送するために湾曲したピンセットを使用してください。 </li></ol>第2部：片のマイクロダイセクション材料と試薬： <ol><li>ミクロ解剖ピンセット、0.1mmのヒント、（そのようなRoboz RS - 4976など）。我々は、理由の先端の柔軟性Dumostar合金を使用しますが、他の合金鋼で指定することもできます。彼らはこの手順の実行中に折ったり、曲げたりする傾向があるとして、0.1ミリメートルよりも薄いのヒントとピンセットは、推奨されていません。 </li><li>懸濁培地（パート1を参照） </li><li>ハムのF12培地または培地199（Invitrogen社、Carlsburg、CA）はUnsupplemented </li></ol>手順： <ol><li>次の手順は、滅菌解剖ツールと滅菌培地を使用してクリーンな、ドラフトのない環境で実施されるべきである。 </li><li>ステレオ解剖顕微鏡を用いて、0.1mmの先端のピンセットで任意の付着組織のレンズをきれいにし、5ミリリットル滅菌懸濁培地を（このステップは、汚染を減らすために役立ちます）含む第二の60ミリメートル培養皿に移す。ピンセットで、5ミリリットル滅菌、unsupplemented培地を含む35ミリメートル培養皿にレンズの希望数を転送する。 （下の染料の濃度が解離容易にするため私たちはしばしば、このステップのためにハムのF12（Invitrogen）を使用しますが、培地199にも受け入れられるない抗生物質または他の追加がこのステップで必要とされていない。。）12植を行うことができる限り多くの料理この大きさの中心部に位置します。少ない外植片は解剖用のツールが小さい皿の中で簡単に操作することができないため、行われる場合であってもしかし、35mmの皿を使用する必要があります。それらが必要になるまで37℃で組織培養インキュベーターに残っているレンズ° Cを含む料理を転送する。 </li><li>レンズの後側を識別する。これを認識する多くの方法があります：1）後部は若干フラット化されている前方、より丸みである、2）新生児ラットのレンズは、解剖時の室温に彼らは涼しいと寒い白内障を形成する。コー​​ルド白内障が完全にレンズをいっぱいにしていない場合、後側は不透明領域から最も遠い側です。不透明度が37に皿を温めて、レンズをいっぱいにしている場合° C数分間、それが逆になります。後側は、冷却時に白内障の改革として識別することができます。 3） 水晶体血管膜の痕跡は、後方側に見える場合があります。 4）後部縫合糸は、後方側に見える場合があります。これはカプセルが開かれる場所なので、正しく後側を特定することは、不可欠です。前方側にレンズを開くと、上皮を引き裂くだろう。 </li><li>後方側が識別されたら、上方向に回し、左ピンセット（右利きの労働者用）でレンズを把握する。その後、小さな倍を生成するために右ピンセットで後嚢をつまんで。 </li><li>右ピンセットで後嚢を押しながら、左ピンセットでカプセルの倍を把握し、カプセルに小さな裂傷を作るために反対方向にピンセットの2つのペアを引き出します。 </li><li>ピンセットで後退カプセルの端をつかんで、ピンセットで皿のプラスチックにそれを押すと、他のにして、片側で最初に、下方に引っ張る。カプセルがしっかりと多くの点でプレートに接続されるまで、すべてのレンズの赤道の周りに移動し、これを数回繰り返します。左ピンセットで固定カプセルを保持する、静かにレンズの赤道での繊維細胞と上皮細胞間の接続を中断する権利ピンセットで繊維の塊を揺らし。その後の底部に取り付けられたままカプセル/上皮を、それをロールオフ、離れて繊維の塊を押してください皿。ディッシュ内のすべてのレンズで、このプロセスを続けます。繊維の質量を（またはそれらが他の研究のためのレンズ蛋白質の源として凍結保存）を取り外して廃棄します。 </li></ol>パート3：中央の外植片のマイクロダイセクションと文化材料と試薬： <ol><li>滅菌使い捨てメス、＃15ブレード、（シンシナティ外科株式会社シンシナティ、オハイオ州） </li><li>滅菌リン酸塩はカルシウムとマグネシウム（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）と緩衝生理食塩水</li><li>培地：100ng/mlのFGF - 2（シグマ - アルドリッチ社セントルイス、MO）を含む懸濁培地。 </li></ol>手順： <ol><li>滅菌メスを使用して、のみ（CE）（図の中央の上皮細胞で構成され、側に中央広場では約2.0ミリメートル残して、差別化（図1A）の初期段階で細胞を含む末梢上皮（PE）を、切り落とす1B）。 </li><li>バイオセーフティキャビネットに中央の植片を含んでいる皿を転送する。新鮮な、平衡化（37℃、5％CO 2）懸濁培地を1mlで一度滅菌PBSを含むカルシウムとマグネシウムで3回洗浄し。これらは、汚染の可能性を大幅に削減洗う。 </li><li>分化1を誘導し、37℃加湿、組織培養インキュベーターで外植片を配置するために培養液の2mLの追加° C、5％CO 2を 。文化の期間は数時間な限り短くしたり、研究されているパラメータに応じて、限り2〜3週間として延長することができる。培地は2〜3日ごとに変更する必要があります。 </li></ol>パート4：分化に関連するイベントの分析のための植の収穫 1。タンパク質やRNAの解析のための収穫植材料： <ol><li> Microdissectingピンセット</li><li> SDS溶解バッファーまたはRNA -後</li></ol>手順： <ol><li>潜伏期間の終わりに、培養液を取り除く。 </li><li>ステレオ解剖顕微鏡を使って、静かにそれぞれ植の端を緩める。 </li><li>ピンセットで各植片を持ち上げて、100μlのSDS溶解緩衝液（タンパク質分析用）またはRNA -以降（RNA分析用）についての入ったチューブに移す。外植片はピンセットに固執しないことを保証するために溶液中でピンセットの先端に撹拌。 </li></ol> 2。免疫蛍光のための収穫植材料と試薬： <ol><li>リン酸塩はカルシウムとマグネシウム（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）と緩衝生理食塩水</li><li>リン酸（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）緩衝生理食塩水</li><li> 4％パラホルムアルデヒド（ボストンのバイオ製品、ウスター、MA） </li><li> Microdissectingピンセット</li><li>疎水性マーキングペン</li><li>顕微鏡用スライドガラス</li><li> 0.25パーセントリン酸塩のトリトンX - 100は、緩衝生理食塩水。 </li></ol>手順： <ol><li> PBSは、カルシウムとマグネシウムを含むで簡単に外植片を洗い流す。 </li><li>室温で30分間、4％パラホルムアルデヒドを添加することにより組織を固定してください。 </li><li>固定液を取り出して、リン酸緩衝生理食塩水と交換してください。固定片は、それらが免疫染色のために持ち上げてスライドガラスに転送できるように、多少堅くなる。 </li><li>ポジション組織を支援し、カーリングを防止するために、スライド上でPBSの小滴を（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）に置きます。 microdissectingピンセットを使用して、外植片を持ち上げ、スライド上のドロップに挿入します。外植片に触れることなく、慎重にガラス上に外植片を平らにし、3〜5分間、室温で空気中の組織を乾燥させるために紙の芯に液体を取り除く。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="図1" /> 図1 A.、末梢上皮には分化特異的タンパク質を発現する。示すように、外植片はすぐに顕微解剖の後、N -カドヘリンのために免疫染色した。式がこの地域で細胞が分化し始めていることを示し、末梢上皮の細胞のバンドに見られる。B.は末梢上皮が発現するN -カドヘリンと他の分化特異的タンパク質その細胞を除去するために離れてトリミングすることができます。小さな四角が灰色に記載されている間、赤い円環は、急行N -カドヘリンそのセルの位置を表しますパネル1Aに示すように上皮の象限を表しています。末梢上皮はまだ区別するために開始されていないセルだけが含まれている中央広場を残して、4つのメスをカットして除去することができます。

<ol><li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li>
<li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li>
<li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+major+intrinsic+protein+%28MIP%29%2Faquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li>
<li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+%28ERK1%2F2%29+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li>
<li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li>
<li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6%2C+c-Maf%2C+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li>
<li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li>
</ol>

ラットのレンズの外植片のシステムが正常水晶体線維21,3,4,5に水晶体上皮細胞の分化を研究する研究室の数によって使用されています。 100ng/mlの時にFGF - 2にさらされると外植片は、形態と遺伝子発現の変化は数日間にわたって順次3,4,5を表示されると、分6内シグナル伝達に変更を表示するために開始されます。注意が汚染を防止するために取られれば文化は2-3週間生き抜く。 FGF - 2の前に分化マーカーを発現あらゆる細胞は1,5を追加された場合、彼らはいくつか含まれているので、このプロトコルで説明されている中央の外植片は、分化に関連するイベントのシーケンスを研究するために特に便利です。細胞は、それが可能な分化に関連するシグナル伝達および転写イベントの時間的経過を追跡すること、コホートとして、同期的に分化する。時間の長さが異なるため、培養の外植片は、このようにシーケンスのイベントについての正確な時間情報を提供します。特異的阻害剤は、関連するシグナル伝達経路を特定するために、培養培地に添加してもよい。外植片をSDSゲル電気泳動とイムノブロッティングによるタンパク質の発現を分析したり、RT - PCRによる特定のmRNAの発現を分析するために使用されることがあります。培養期間の長さに応じて、600 ngの/植 - 20から50μgの/植とRNAの収量からのタンパク質収量の範囲は約200です。我々は一般的に皿あたり5から6の外植片は、いくつかのアッセイに十分なタンパク質やRNAを提供することを見つける。外植片からのRNAは、分化に重要である可能性新規遺伝子を識別することができるマイクロアレイ解析により遺伝子発現を評価するためのcDNAを調製するために使用することができます。外植片は、トランスフェクトすることができる。トランスフェクション効率は一般的に低いですが、それは、レポーター遺伝子4をアッセイするための十分です、7、8。外植片の免疫蛍光顕微鏡は、目的のタンパク質の細胞内局在を決定することにより、生化学的方法に有用な補助を提供します。従って、ラットのレンズの外植片の準備と文化は、このようなトランスジェニックやノックアウトマウスの作製など、生体のテクニックで補完することができる哺乳類で、端末のレンズの分化を研究するための強力なシステムを、提供します。

最終分化を研究するための準備とラットの水晶体上皮外植片の培養

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

接眼レンズの前面は、毛様体の根底にある環状のゾーンで増殖する上皮細胞の単層によって覆われている。網膜からの拡散FGFは、それらがレンズの大部分を構成する細長い水晶体繊維細胞、の後の配列への分化を誘導する場所分裂に続いて、これらの細胞は、後方に移動する。水晶体線維に水晶体上皮細胞の分化はFGF - 2の存在下で前方上皮の中心領域の培養片でin vitroで誘導することができる。外植片は、目からレンズを取り外すと解剖ピンセットで後部側のレンズカプセルを把握し、新生児ラットのレンズから調製されています。後嚢をそっと開いて引き裂かれ、組織培養皿のプラスチック製の底に押されている。外植片の周辺領域は、メスで除去され、中央のエリアは、検討すべきパラメータに応じて、限り2〜3週間などのため100ng/mlのFGF - 2の存在下で培養される。培養片の上皮細胞は数日から数週間の期間にわたって近似同期して区別するので、シグナル伝達および遺伝子発現のタイムコースは、分子生化学、薬理学的手法を用いて決定することができる。それは興味の蛋白質の細胞内局在を証明し、シグナル伝達経路の実験操作の生理的影響を明らかにすることができるように免疫蛍光顕微鏡観察は、これらのメソッドへの強力な補助です。

FGF - 2の存在下で培養するとラットレンズ上皮の中心領域の外植片は、同期的に分化する。そのような文化の免疫蛍光顕微鏡は、遺伝子発現と分化に関連付けられているシグナリングイベントに関する新たな情報を提供することができます。

眼水晶体の前表面は単層の上皮細胞で覆われており、これらの細胞は毛様体直下の環状領域で増殖している。

この手順では、まず生後2〜4日のラットから水晶体を摘出し、付着している組織を洗浄します。水晶体の後側を特定し、水晶体嚢に小さな切り込みを入れます。その後、水晶体嚢を下方向に剥離し、ディッシュの底に押し付けます。この工程をレンズ全体で繰り返します。レンズ繊維塊を横に揺らして除去します。周辺上皮を切り出し、それらを培養します。最後に、生化学的解析のために試験管へ、または顕微鏡観察のためにガラススライドへ移します。こんにちは、私はNIH国立眼科研究所の分子・発生生物学研究室のPeggy Lankaです。こんにちは、私も国立眼科研究所の分子・発生生物学研究室のAl Tuです。NEIの同じ研究室のChung Gaです。本日は、新生ラットから水晶体上皮細胞を摘出し、培養する手順をご紹介します。分化の初期段階にある細胞が含まれる上皮の周辺領域を除去する方法について解説します。次に、FGFにさらすことで、残りの中心水晶体上皮細胞を分化させ、水晶体線維を形成させる方法を説明します。当研究室では、この手順を用いて、最終分化に関与するイベントのタイミングを研究しています。培養液にFGFを添加した後、さまざまな時間経過でEXPLANを回収します。次に、ウェスタンブロッティングでタンパク質発現を、R-T-P-C-RまたはマイクロアレイでRNA発現を解析し、目的タンパク質の細胞内局在を決定するために水晶体の免疫染色を行います。それでは、新生ラットからの水晶体摘出から始めていきましょう。まず、安楽死させた生後2〜4日のラットの眼の後方を小さく切開し、反対側から押すことで、マイクロ解剖用はさみを用いて水晶体を取り出します。0.1 mm先のピンセットを用いて、レンズを5 mLの温めた滅菌懸濁培地を含む60 mmプラスチック組織培養ディッシュに移します。レンズに付着している組織をきれいに取り除き、さらに5 mLの滅菌懸濁培地を入れた2つ目の60 mm培養ディッシュに移します。これにより、ピンセットによる汚染を低減させることができます。必要数の水晶体を、2 mLの滅菌済みunsu添加培地を含む35 mm培養皿に移します。このサイズの皿の中心部には、最大12個のx explanを作成できます。余った水晶体は、前述の2枚目の60 mm皿に保存し、x explanの作成に使用するまで最大1時間、37 °Cの組織培養インキュベーター内に置いておくことができます。次に、水晶体の後側を特定します。こちらの2つは前側が上を向いていることがわかります。端を立てて上から覗けるようにします。すると、中央に不透明な領域であるコールドカタラクト（寒冷白内障）が見えます。不透明な中心から最も遠い側が後面です。したがって、後面に合わせて裏返します。後面には、この腱周囲血管炎の痕跡である条紋も見られます。これは水晶体の周辺部にある血管パターンであり、背面側を示す指標にもなります。その通りです。ここが被膜を切開する部位となるため、正確な識別が不可欠です。水晶体の前面側を切開すると、上皮が破裂してしまいます。後側を特定する方法はいくつかあります。まず、後側は前側に比べてより円形しており、前側はわずかに扁平になっています。次に、新生子ラットの水晶体は、解剖中に室温まで冷却されるにつれて冷冷白内障を形成します。冷白内障がまだ水晶体全体に広がっていない場合、不透明な領域から最も遠い側が後面となります。不透明化が水晶体全体に及んでいる場合は、ディッシュを37 °Cで数分間温めることで、この状態を可逆させることができます。冷却により再び白内障が形成される際に、後面を特定することが可能です。tunica VASIsの3番目の痕跡が後面に確認できる場合があります。最後に、後面の縫合線が後面に確認できる場合があります。後面が特定されたら、それを上に向け、左のピンセットでレンズを保持します。次に、右のピンセットで後嚢を保持しながら、後嚢を軽くつまんで小さなひだを作ります。左のピンセットでその嚢のひだを掴み、2本のピンセットを反対方向に引っ張ることで、嚢に小さな裂け目を作ります。ピンセットで後退する嚢の端を掴み、まず片側を、次に反対側を下方に引っ張り、ピンセットでディッシュのプラスチック面に押し付けます。嚢がプレートにしっかりと付着するまで、水晶体赤道部の全周にわたってこの操作を数回繰り返します。多くの箇所で、左のピンセットで嚢を固定しながら、右のピンセットで繊維塊を軽く揺すり、水晶体赤道部における繊維細胞と上皮細胞の間の接着を断ち切ります。次に、繊維塊をそっと引き離し、ディッシュの底に付着したままのカプセルから転がすようにして取り出します。ディッシュ内のすべてのレンズでこの操作を繰り返します。繊維塊は廃棄するか、あるいは凍結保存して、上皮外植片全体のマイクロダイセクション完了後の他の研究におけるレンズタンパク質源として利用することができます。中央外層の微小解剖と培養について見ていきましょう。滅菌済みのメスを用いて、分化の初期段階にある細胞を含む周辺上皮を切り取り、中央上皮細胞からなる一辺約2 mmの正方形の部分を残します。中央の切片を含むディッシュのみをバイオセーフティキャビネットに移します。切片を滅菌PBSで3回、次いで1 mLの新鮮な平衡化懸濁培地で1回洗浄します。次に、分化を誘導するために2 mLの培養液を加え、切片を37 °C、5% carbon dioxideに設定した加湿組織培養インキュベーター内に置きます。培養期間は、研究対象となるパラメータに応じて、数時間から2〜3週間まで異なります。培地は2〜3日ごとに、マイクロダイセクションおよびTuring completeを用いて交換してください。それでは、解析のために外植えを回収しましょう。培養期間の終了後、マイクロ解剖用ピンセットを用いて培養液を除去します。各 explan の端をそっと緩めます。ピンセットで各 explan を掴み、タンパク質分析用の SDS lysis buffer 約 100 µL または RNA 分析用の RNA later が入ったチューブに移し、ピンセットの先端を溶液中で動かして explan がピンセットに付着していないことを確認します。外植片は、タンパク質またはRNAの解析が可能な状態になりました。また、免疫蛍光染色による解析も可能です。まず、外植片をPBSで短時間すすぎます。次に、4%パラホルムアルデヒドを加えて、組織を30分間固定します。室温で固定液を除去し、PBSに置き換えます。固定された外植片はやや硬くなるため、持ち上げて免疫染色のためのガラススライドへ移すことが可能になります。組織の配置を助け、丸まりを防ぐために、カルシウムおよびマグネシウム不含のPBSをスライド上に少量滴下します。マイクロディセクティングピンセットを使用して外植片を持ち上げ、外植片に触れないように注意しながらスライド上の液滴の中に挿入します。ペーパーウィックを用いて慎重に液体を除去し、外植片をガラス面上で平らにします。組織を室温で3〜5分間、自然乾燥させます。これで、インプラントの免疫蛍光分析の準備が整いました。ここに、細胞マーカーであるNCO adhereで免疫染色した、マイクロダイセクションによる上皮外植片全体の例を示します。分化の初期段階では、上皮の周辺領域にある細胞のみが、この切断タンパク質に対して陽性に染色されます。本プロトコルで述べる周辺上皮を除去すると、中央に領域が残り、そこにはこのタンパク質を発現する細胞はほとんど、あるいは全く含まれません。これはウェスタンブロッティングによって示されており、中央および周辺の上皮組織を用いてGA.DHのウェスタンブロッティングを行い、タンパク質サンプルが等量ロードされていることを確認しました。分化に伴うイベントのタイミングは、中心外植体を異なる期間培養することで決定できます。中心外植体を、100 ng/mLのFGFを含む培地または含まない培地で2、5、24、および48時間培養しました。各指定時間に外植体を回収し、ウェスタンブロッティングによる解析のため、SDSサンプルバッファーに転移させました。結果から、培養開始後24〜48時間で目的タンパク質の発現が誘導されることが示されました。GAPDHのウェスタンブロッティングにより、タンパク質サンプルが等量ロードされていることが確認されました。100 ng/mLのFGFが存在するかしない条件下で4日間培養した中心部外植片の免疫染色の結果、FGFに曝露した外植片ではN-cadherinの免疫蛍光が強く上昇していることが示されました。また、免疫蛍光により、N-cadherinが細胞境界に細胞内局在していることも示されました。以上で、分化の研究のために水晶体上皮細胞を培養して調製する方法を説明しました。このシステムの主な利点は、細胞が同期して分化することです。これにより、一連のイベントの順序を決定することが可能になります。さらに、特定のシグナル伝達経路を活性化または遮断するために、培地に特定の成長因子や阻害剤を添加することも可能です。この手順を行う際は、清潔な環境で解剖および培地の滅菌を行い、培養前に外植体を十分に観察することで、コンタミネーションを防ぐことが重要です。以上で手順は終了です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。それでは。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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新しいヒトの言語性の高いレティナル文化技術の特徴付け

このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウスRPE細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。手続きには約3時間かかります。...

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

このプロトコルは、成体マウスから得られた網膜外植片の単離、解剖、培養、および染色の手順を提示し、説明しています。この方法は、糖尿病性網膜症などの異なる網膜神経血管疾患を研究するための ex vivo...

網膜神経血管疾患研究のための ex vivo モデルとしての成体マウス網膜網膜の外植片

この原稿では、初代水晶体上皮細胞(LEC)を培養するための詳細なビデオプロトコルの概要を説明し、白内障および後嚢混濁(PCO)の再現性を向上させ、研究を支援することを目的としています。レンズの解剖、LECの分離、バリデーションに関するステップバイステップの説明を提供し、特にこの分野の初心者にとって貴重なガイドとなります。...

マウス一次水晶体上皮細胞培養の最適化:トリプシン処理の包括的ガイド

私たちは、角膜上皮の掻爬術と角膜縫合糸の組み合わせにより、重度の角膜炎症のラットモデルを開発しました。この研究では、炎症条件下での角膜の炎症パターン、上皮の増殖、および辺縁系幹細胞の変化を評価しました。...

角膜上皮掻爬術と角膜縫合糸の併用に基づくラットにおける重篤な角膜炎症モデルの確立

このプロトコルは、マウス眼レンズ上皮と線維細胞バルク塊の分離、続いてRNA単離およびqPCR分析を詳述する。この方法により、水晶体細胞コンパートメントを分離して、上皮細胞と分化した線維細胞におけるトランスクリプトームと生物学的プロセスをより詳細に分析することができます。...

マウス眼水晶体上皮および線維細胞バルク塊からのRNA単離

学ぶラットの水晶体上皮外植片の培養法とFGF-2による最終分化の誘導。免疫蛍光顕微鏡で遺伝子発現とシグナル伝達を解析し、水晶体の発生と疾患の理解に貢献する研究手法を習得する。

最終分化を研究するための準備とラットの水晶体上皮外植片の培養

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