蛍光活性化細胞選別（FACS）によって特定の細胞集団の精製

こんにちは、ウィスコンシン州血液センター血液研究所のフローサイトメトリースペシャリストのホープ・キャンベルです。こんにちは、ボニー・ディーター博士の研究室の大学院生、STR Basoです。私もウィスコンシン州血液研究所の血液研究所にいます。

今日は、蛍光活性化細胞ソーティングを使用して細胞を分離する手順を行います。この手順を実験室で使用して、リンパ球と骨髄細胞集団の機能を研究しています。さっそく始めましょう。

この手順では、マウス細胞から4つのT細胞BおよびCDを精製します。ターゲットセルの開始数は、必要なセルの数と、この方法を使用したマシンの回収率に基づいて計算する必要があります。B細胞およびCDの4つのT細胞の典型的な回復率は85〜90%であり、開始SP細胞集団は約60〜70%のB細胞と20〜30%のT細胞である。

したがって、10の6つの細胞の100倍から始めると、事実を始める前に、5000万から6000万のB細胞と2000万から3000万のT細胞を回復させることができます。プロトコールに必要な溶液と試薬は、氷上に置く必要があります。これらには、ハンク平衡塩溶液で調製した25ミリモルHEPからなる3%ウシ胎児血清懸濁液バッファーを含むリン酸塩緩衝生理食塩水、または3%ウシ胎児血清A、25ミリモルHEP B溶液を含むHBSS、ウシ胎児血清染色抗体および補償ビーズで調製した染色バッファーが含まれます。

このプロトコルには、15ミリリットルのコニカルチューブ、12 x 75ミリメートルのポリスチレンまたはポリプロピレン製のフローチューブも必要です。これを行うには、ナイロンセルストレーナートリエンブルー、およびヘモサイトメーターソーティングコレクションチューブも事前に準備する必要があります。

300マイクロリットルのHEのFCSの解決の流れの管へのまたは15のミリリットルの円錐管へのHEPs FFC Sの解決の1ミリリットルで。これらは、収集プロセスが始まるまで氷の上に置く必要があります。まず、目的の細胞集団の単一細胞懸濁液を生成します。

細胞が単離された場合、この手順を使用して培養します。全細胞調製は、組織培養フードで行う必要があります。滅菌技術を使用して、細胞を一度洗浄し、氷冷染色緩衝液を追加し、チューブを数回反転させて細胞を懸濁します。

次に、細胞を摂氏4度で約250GSで7〜8分間遠心分離します。洗浄条件は、細胞の種類や濃度によって異なる場合があります。細胞については、10〜6個の細胞を10ミリリットルの染色緩衝液で200倍まで洗浄します。

細胞ペレットが無傷のままになるように、吸引によって上清を慎重に除去します。次に、細胞を氷冷染色緩衝液に100マイクロリットルあたり10〜6倍までの濃度で再懸濁します。チューブをフリックまたは穏やかにボルテックスして、細胞ペレットを再懸濁します。

次に、6つのセルのうち0.25〜10倍を、氷上の新しい12 x 75ミリメートルのポリスチレンまたはポリプロピレンフローチューブに移します。そして、これを後で未染色のコントロールサンプルとして最初のチューブに使用するために取っておき、細胞懸濁液に一次抗体を添加して、所望の最終濃度を達成します。ここでは、PEテキサスの赤色標識抗B2 20抗体を使用してB細胞を染色し、ZI標識抗TCR Rベータおよびまたは700標識抗CD4抗体を使用して、チューブの底をフリックするか光で混合したT細胞を染色します。

次に、ボルテックスにより細胞を氷上に置き、暗闇で20〜30分間インキュベートします。インキュベーション後、標識細胞をResusで洗浄し、上清を慎重に除去した後、前と同様に10ミリリットルの氷冷懸濁液、緩衝液、および遠心融合にそれらを懸濁します。この手順を繰り返して、細胞をもう一度洗浄します。

最後に、細胞を氷冷懸濁液バッファーに再懸濁します。一次抗体がフルオロフォーに直接結合していない場合は、標識二次抗体または連鎖球菌AVIDを細胞懸濁液に結合させて添加し、インキュベーション後20〜30分間、氷上で細胞をインキュベートします。細胞を氷冷懸濁液バッファーで2回洗浄します。

氷冷懸濁液バッファーに細胞を懸濁した後。トライアンブルーやヘモサイトメーターなどのバイタル色素を使用して、細胞の濃度と生存率を測定します。懸濁液バッファーを追加することで、細胞濃度を1ミリリットルあたり10〜20倍に調整し、分離中に死んだ可能性のある細胞のクラスターでファックス機が詰まらないようにします。

手順と染色。ソーティングプロトコルを開始する直前に、ドリップストレーナーで細胞をろ過します。ストレーナの細孔サイズは、細胞の種類に応じて選択する必要があります。細胞の場合は、孔径が40マイクロメートルのストレーナが使用されます。

ろ過したセルを、容量に応じて15リットルの円錐形チューブまたは12 x 75ミリメートルのフローチューブに集めます。そして、サイトメーターがソーティング手順のためにセットアップされている間に、細胞を氷の上に置きます。BD comp ビーズを単色ポジティブコントロールとして使用する場合は、アッセイで使用する色ごとに 1 本のコントロールチューブと未染色のネガティブコントロールチューブを調製します。

ビード懸濁液を徹底的にボルテックスした後、1つ追加し、ネガティブおよびポジティブビーズ懸濁液のそれぞれを、使用する色およびネガティブコントロールごとに100マイクロリットルの懸濁液バッファーにドロップします。次に、標識した抗体を1マイクロリットルずつ各ポジティブコントロールチューブに加えます。この実験では、PE Texas'Red B two 20抗体を用いて1本のチューブを作製します。

1つは適合ETCRベータ抗体を使用し、もう1つはlor 700 CDを使用して4つの抗体をチューブの底をフリックして混合し、室温で暗所で15〜30分間インキュベートします。ビーズを2ミリリットルの染色液で1回洗浄し、緩衝液を緩衝し、200Gで10分間遠心分離します。吸引によって上清を取り除き、ビーズペレットを200〜500マイクロリットルの染色に再懸濁します。

フローサイトメーターのバッファーのセットアップはメーカーによって異なり、適切な訓練を受けた担当者のみが行う必要があります。ここでの細胞選別手順は、BD欠損アリアを使用して実行されます。ソーティングする前に、ソーティングするセルタイプに応じて適切なノズルを選択してください。

ファクトアリアに使用できるサイズは、70マイクロメートル、100マイクロメートル、および130マイクロメートルです。ノズルサイズは、リンパ球のために選別される細胞のサイズの少なくとも3倍であるべきであり、70マイクロメートルのノズルが選択される。無菌細胞ソーティングは、装置の無菌ソーティングオプションを使用して実行できます。

このオプションを使用して、シース経路全体がメーカーの指示に従って70%エタノールで除染されます。必ずシースフィルターを交換し、PBSを滅菌PBSに交換してください。サイトメーターの準備ができたら、ヒープFCSが入った事前に冷却された収集チューブを適切な収集デバイスに入れます。

利用可能な収集装置は、最大2本の15ミリリットルの円錐管を保持できます。12 x 75 mm チューブ 4 本、またはマイクロチューブ 4 本。第6細胞に1.5倍未満の10を採取する場合は12×75ミリ管を、第6細胞に1.5倍〜10×4.5倍を採取するには15ミリリットルの円錐管を使用する。

適切な収集デバイスをソート収集チャンバーに入れます。サイドストリームを取り付けられた収集デバイスに向け、マルチカラーソートを行います。サイトメーターは、まず検出器間のスペクトルのオーバーラップを考慮してキャリブレーションされます。

ここに示す例は、フィット E と pe の発光スペクトルのオーバーラップを示しています。暗い影付きの領域に示されているこのオーバーラップは、スピルオーバーと呼ばれます。ここでは、PE スピルオーバーは fit E チャネルで検出され、fit e スピルオーバーは PE チャネルで検出されます。

この波及効果は、1つのフロア4の残留蛍光を別のチャネルで除去するために補正する必要があります。スピルオーバーを補正するプロセスは、手動補正を実行するための補正と呼ばれます。サイトメトリーソフトウェアを使用して、前方散乱FSCと側方散乱SSCを表示するための二変量プロットと、使用するフルーロごとに1つのヒストグラムを含むテンプレートを設定します。

これらのプロットの設定方法は、ソフトウェアによって異なります。ネガティブコントロールCOMチューブをサイトメーターのローディングポートにセットし、サンプルの実行中にデータの取得を開始します。FSC と SSC を調整して、関心のある人口をスケールに配置します。

次に、蛍光PMT設定を調整して、負の母集団または自家蛍光をヒストグラムの左端に配置します。ネガティブコントロールチューブを記録します。ネガティブコントロールチューブをサイトメーターローディングポートから取り外し、最初のポジティブコントロールコムチューブと交換します。

今すぐ買収を開始します。各ポジティブコントロールチューブごとにこのプロセスを繰り返し、各チューブのデータを記録します。ポジティブコントロールごとに、ヒストグラムに記録されたイベントの周囲にインターバルゲートまたはボックスを描画します。

次に、ヒストグラムの負の部分に別のインターバルゲートを描画します。手動補正を行う場合は、実験で使用された各フルロを考慮に入れて、ポジティブの中央値をネガティブの中央値と等しくなるまで調整します。中央値を調整するには、各蛍光パラメータの中央値ができるだけ一致するまで、スペクトルのオーバーラップ値を高くまたは低く調整します。

ポジティブコントロールサンプルとネガティブコントロールサンプルで確立された設定を使用して、実験サンプルの歩行設定を決定して、ソーティング手順の準備をします。選別する細胞のチューブをサイトメーターのローディングポートにセットし、毎秒9〜10, 000イベントの速度で取得を開始します。ドット プロットを選択して、前方散乱と側面散乱を表示します。

前方散乱はセルサイズの一般的な指標であり、x軸に配置され、サイドスキャッターは細胞の粒度の指標であり、Y軸に配置されます。次に、関心のある母集団をゲートします。ゲートが決定したら、サイトメーターのローディングポートの温度が摂氏4度に設定されていることを確認します。

次に、実験用サンプルチューブをローディングポートに入れます。ソートオプションを押して取得を開始し、収集チューブが充填されたら氷の上に置く必要があります。必要な数の細胞が収集されるまで、またはサンプルチューブが空になるまで、ソーティングを続けます。

次に、並べ替えボタンを再度選択して並べ替えを停止し、サンプルを読み込みポートから取り出します。次に、コレクションチューブをサイトメーターのローディングポートに直接配置し、500〜1000のイベントを取得します。T細胞のソーティングに使用したのと同じ設定を使用して、ソーティング手順により純度が21%から99%に増加しましたB細胞の場合、開始B細胞の集団5%はソーティング後に98%に増加しました。

そこで、ファックスで細胞からb細胞とt細胞の集団を精製する方法を紹介しました。事実は、単一細胞懸濁液を生成することができ、適切な抗体が利用可能であれば、任意の細胞集団を精製するために使用できることを忘れないでください。また、蛍光マーカーで遺伝的にスタックした細胞は、抗体を使わずに簡単に精製することができます。

また、実験には適切なコントロールを使用することを常に忘れず、フローサイトメトリーレーザーの構成を常にチェックして、正しい蛍光色素を使用していることを確認し、適切なゲートを使用して集団の周囲に適切に配置されるようにしてください。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。