ルシフェラーゼ免疫系による抗体のプロファイリング（LIPS）

このビデオでは、LIPSの実施手順を実演します。アッセイ抗原は、組換えRenilla luciferaseまたはRuc抗原融合タンパク質としてCOS-1細胞で発現させます。粗抽出液を回収し、精製せずに使用します。

lipsアッセイは、粗抽出したrook抗原抽出液と患者のSRAをインキュベートすることで開始します。その後、抗原抗体混合液を、Protein A/Gビーズを含む96ウェルフィルタープレートのマイクロタイターウェルに移し、Protein A/Gビーズを含むフィルタープレートを洗浄してIgG分子を捕捉します。抗体に結合したrook抗原は、ルミネッセンス基質の添加によって測定し、発光ユニットをルミノメーターで測定します。

こんにちは。国立歯科・口腔顔面疾患研究所、感覚生物学研究室のCatherine Chang博士です。本日は、LIPS（ルシフェラーゼ免疫沈降システム）の手順をご紹介します。当研究室では、疾患や感染症の診断を目的として、抗体価を測定するためにLIPSを用いています。

疾患状態の層別化、ワクチンのモニタリング、および抗体プロファイルの作成に関わるその他のアプリケーションに利用されます。それでは始めていきましょう。トランスフェクションを開始する前に、BMC biotechnologyの論文に記載されている方法に従い、バニラルシフェラーゼ融合タンパク質用のプラスミドをあらかじめ調製しておきます。

BYO etal 2005 プラスミドDNAは、MIDI prepキットを用いて1〜3 mgの収量で調製し、1 mg/mLのストック溶液として-20 °Cで保存します。トランスフェクションに使用するCos-1細胞は、標準的な組織培養プロトコルに従い、10% FCS含有DMEMで培養します。トランスフェクションの1日前に、Cos-1細胞を新しい100 × 20 mmディッシュに、1プレートあたり約2 × 10⁶ cellsとなるように播種し、37 °Cでインキュベートし、翌日に使用します。

細胞のコンフルエンシーは80～95%である必要があります。4°Cで保存されているFusionGene 6トランスフェクション試薬を室温に戻します。試薬が室温になるまで待機している間に、トランスフェクションに使用する各プラスミドDNA用に1.5 mLポリプロピレン製マイクロ遠心チューブにラベルを貼ります。この際、チューブの側壁に触れないように注意してください。すでに94 µLのOpti-MEMが入っているチューブに、FusionGene 6を6 µL加えます。室温で5分間インキュベートします。1～2 µgのプラスミドDNA（Luciferase抗原融合コンストラクト）を加え、チューブを数回反転させて混合し、短時間遠心分離した後、室温で15分間インキュベートします。

DNA融合物6の最適溶液すべてを、COS-1細胞の培地に均等に滴下して導入します。トランスフェクションしたCOS-1細胞を2日間インキュベートした後、回収します。融合タンパク質の回収を開始するには、培地を除去し、6 mLのPBSで細胞を洗浄してください。

組織培養ディッシュから残りのPBSをピペットで取り除き、冷たい溶解バッファーを1.4 milliliters加え、セルスクレイパーで細胞を回収します。溶解液の半分ずつを、氷上に置いた2本の1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに迅速に移します。細胞を破砕するために、Branson SOLIDIFIER 150を使用します。細胞溶解液の入ったマイクロ遠心チューブを氷上に置き、5秒間パルス処理します。

5秒間、そしてさらに5秒間。超音波処理の設定をそれぞれ2、2、4として行います。細胞溶解液を12,500 RPMで4分間遠心分離します。

4 °Cで遠心分離を行います。遠心分離の合間にチューブを穏やかに転倒混和し、チューブ壁面に緩く付着したデブリを除去します。その後、2本のチューブから、ペレットを乱さないように注意して上清を回収し、氷上の新しいマイクロ遠心チューブに移します。

溶解液の光単位（lu）を測定するには、新しいマイクロ遠心チューブ内で溶解液 1 µL を 8 µL の PBS で希釈します。希釈した混合液に OneCelent INE 基質 100 µL を直接加え、チューブルミノメーターを用いて直ちにチューブ内のルミネッセンスを測定します。このステップ以降の読み取り時間は 5 秒に設定してください。ヒトおよび動物由来のサンプルを扱う際は、安全上の予防措置を講じることを忘れないでください。抗原プロファイリングのための患者抗体のソースとなる血清マスタープレートを作成するには、まず 96 ウェル深孔ポリプロピレンマイクロタイタープレートの各ウェルにバッファーAを 450 µL 加えます。

このステップでは、今後のSRAサンプルの添加やlipsアッセイのその他のステップをモニタリングするためのトレーサーとして、フェノールレッド染料をバッファーAに添加してもよい。次に、450 µLのバッファーを含む各ウェルに、各サンプルから50 µLの血清を添加する。注：これは、バッファーによるSRAの10倍希釈である。

通常、マスタープレートの最後の2ウェルにはSRAを添加しません。これは、マスタープレートを将来の使用のために保存する前に、バッファーブランクとして予約しておくためです。その後、ローテータープラットフォーム上で1〜2時間十分に振盪させます。650 RPMで回転させた場合、血清は4 °Cで少なくとも1ヶ月以上安定して保持されます。LIPSアッセイを実施する前に保存する場合は、蒸発を防ぐためにパラフィルムでプレートを密封してください。サンプル識別番号とマスタープレート上の対応するウェルを記載したスプレッドシートを作成します。血清の検査には、ワーキングプレートとしてポリプロピレン製の96 shallow wellマイクロタイタープレートを使用します。

最初のステップとして、8チャンネルマイクロピペットを用いて、96ウェルプレートの各ウェルにバッファーAを40 µLずつ加えます。次に、マスタープレートから希釈した血清を10 µL分取り、8チャンネルマイクロピペットを用いてワーキングプレートの各ウェルに直接加えます。使用後、マスタープレートをパラフィルムで密封し、蓋を閉めてからサランラップで覆い、4 °Cで保存します。

次に、各ウェルに1 × 10⁷ LUが添加されるように、50 µLのバッファーAにrook抗原抽出物を含むマスターミックスを調製します。このマスターミックスを作成し、各ウェルにrook抗原混合液を50 µLずつピペッティングします。プレートをポリスチレン製プレートカバーで覆い、ロータリーシェーカーを用いて100 RPMで1時間インキュベートします。

インキュベーション中の室温にて、冷蔵庫からPBS中の30% Ultra Link Protein AGビーズ懸濁液の1.5 mL分注量を取り出します。新しい96ウェルフィルターHTSプレートの各ウェルの底に5 µLずつ加えます。プレートを1時間インキュベートした後、マルチチャンネルマイクロピペットを用いて、100 µLの抗原抗体反応混合液をProtein AGビーズを含む96ウェルフィルターHTSプレートに移します。96ウェルフィルタープレートをロータリーシェーカーにかけ、室温、100 RPMでさらに1時間インキュベートします。

次に、Biome FXオートメーションワークステーションを用いてフィルタープレートを洗浄します。真空マニホールドを使用し、各ウェルを100 µLのバッファーAで8回洗浄し、続いて100 µLのPBSで2回洗浄します。最後の洗浄後、真空をオフにします。フィルタープレートを取り出し、ペーパータオルの束またはろ紙を用いて、プレートの上下の水分を完全に取り除いて吸い取ります。プレートの各ウェルの発光強度の測定には、Burt hold LB nine 60 Centroマイクロプレートルミノメーターを使用します。

装置の電源を入れ、インジェクターを蒸留水で洗浄します。インジェクター洗浄サイクルを使用します。INE基質は、装置のプライミングおよび運転に使用され、製造元の指示に従ってPromega ranil基質キットを用いて調製します。通常、1プレートにつき6 mLの1×基質ミックスが必要です。基質混合物をルミノメーターにロードし、基質の注入およびプレートの読み取り設定が含まれているプログラムファイルを開きます。

これらの測定では、50 µLの基質を注入します。プレートを2秒間振盪させた後、5秒間発光を測定します。

測定後、プレートの読み取りを開始するプログラムを立ち上げ、ルミノメーター内での液漏れを防ぐため、速やかにマイクロタイターフィルタープレートを取り出します。データは、さらなる解析のためにmicrowindプログラムからExcel形式で自動的にエクスポートされます。同一血清を用いた2回の異なるランの結果を平均化します。

各サンプルのluタイター値を算出するために、2回の測定を行うことが推奨されます。重複サンプル間のタイター値は、2回のランの間で高い一致を示すはずです。データプロットにおいては、ここで示すように、バッファーブランクを差し引くことでluタイター値をさらに調整することが可能です。

本アッセイの感度と特異度は、コントロールサンプルの平均値に標準偏差の3倍または5倍を加えたカットオフ値を利用して算出することも可能です。以上で、LIPSを用いた抗体価の測定方法について説明しました。LIPSはアッセイの最適化をほとんど必要とせず、その簡便さから、どのような抗原に対しても2週間以内に高品質なデータを生成することができます。ヒト血清を取り扱う際は、適切な安全上の予防措置を講じることが重要です。

また、Liftsは拡張性が非常に高く、そのため、手動洗浄による少数のサンプル測定から、ロボットワークステーションを用いたフルプレート測定まで対応可能です。このような汎用性を持つLiftsは、血清抗原分析において非常に有用であり、疾患分析および一般的な公衆衛生に幅広い影響を与えると考えています。以上です。ご視聴ありがとうございました。抗体プロファイリング実験の成功をお祈りしています。