Name: ルシフェラーゼ免疫系による抗体のプロファイリング（LIPS） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-07T17:25:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学ぶルシフェラーゼ免疫沈降システム（LIPS）による抗体定量法。COS-1細胞を用いた抗原発現と粗抽出液を利用した簡便な免疫沈降アッセイで、疾患診断やワクチン効果評価に応用可能です。

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この研究は、NIDCRの学内研究プログラムによってサポートされていました。

1。回路図の概要： このビデオでは、LIPSのアッセイを行うために必要な手順を示しています。抗原は、組換えウミシイタケルシフェラーゼ（RUC）-抗原の融合、および粗抽出物などのCOS1細胞で発現され得られ、精製せずに使用。 LIPSのアッセイは、マイクロタイターウェルの患者の血清を使用するCRUD 電子 RUC -抗原抽出物をインキュベートすることによって開始されます。抗体 - 抗原の混合物を、次いでIgG分子を捕捉するプロテインA / Gビーズを含む96ウェルフィルタープレートに移している。プロテインA / Gビーズを含むフィルタープレートを洗浄した後、RUC -抗原結合した抗体は、ルミノメーターで測定されるセレンテラジンの基板と光ユニットを添加することによって測定されます。 PART 1： シイタケ -抗原融合タンパク質の生産のためのプラスミドのトランスフェクション セットアップ：COS1細胞を標準組織培養のプロトコルを使用して、DMEM - 10％FCSで培養されています。 ウミシイタケルシフェラーゼ融合のためのプラスミドは、以前は1記載されている。これらのプラスミドのDNAはキアゲンからミディプレップキットを用いて調製される。収率は約1-3 mgのはずです。 -20℃で1000μg/ mlのストック溶液としてDNA濃度とストアを測定手順： <ol><li>トランスフェクション前日、分割されたCOS - 1 37新100への細胞プレートとインキュベート当たり約2 × 10 6時× 20 mmディッシュを℃に</li><li>次の日に、COS - 1細胞​​は80から95パーセントコンフルエントにする必要があります。各プラスミドDNA用ラベル1.5mlのポリプロピレンマイクロチューブは、トランスフェクトされる。 4℃で保存されているトランスフェ- 6トランスフェクション試薬は、室温にウォームアップ。 </li><li>各マイクロチューブにのOpti - MEMのメディアの94μlを添加する。次側の壁に触れることなくのOpti - MEM培地にFuGENE 6トランスの6μlを加える。 </li><li>室温で5分間混合物をインキュベートする。 </li><li>構築ウミシイタケルシフェラーゼ抗原の融合のためのプラスミドの1〜2μgのを（1mg/ml DNAのストックから）を追加します。混和し、次いで室温で15分間混合物をインキュベートする。 </li><li> COS1細胞の培地に均等にそれを滴下して細胞にDNA - FuGENE 6トランスフェ - のOpti - MEMのソリューションを転送する。 </li></ol> PART 2：収穫シイタケ -抗原の融合<ol><li>トランスフェクションの2日後、COS - 1細胞​​を回収している。これは、メディアを削除してからPBSを6mlで細胞を洗浄することで開始されます。 PBSをデカントした後、組織培養皿から離れて任意の残留PBSをピペット。 </li><li> 50mMトリス、pH7.5の、100mMのNaCl、5 mMのMgCl 2、1％トリトンX - 100、50％グリセロールおよびプロテアーゼ阻害剤（50 mlあたりの完全miniprotease阻害剤のカクテルの2錠で構成される冷溶解緩衝液1.4 mlを加え溶解バッファー）。セルの解体作業員による収穫の細胞は、すぐに氷上に2つの1.5mlマイクロチューブの各々にライセートの半分を譲渡する。 </li><li>ブランソン超音波処理150は、細胞が開いて分割するために使用されます。それぞれ、2,2および4の超音波処理の設定で5秒、5秒と5秒のための氷とパルスで細胞溶解液を含むマイクロ遠心チューブを置きます。 </li><li>最初のスピンの後、軽くチューブの側壁から緩やかに添付された残骸を削除するためにチューブを逆さに4℃で2つの4分間のスピン℃、12,500 rpmで細胞ライセートを遠心。第二スピンした後、氷上に新しいマイクロ遠心チューブに2本の管から、ペレットを中断することなく、上清を慎重に移す。 </li><li>ライセートの添加あたりの光ユニット（LU）を計算する。 LUを測定するために、新しいマイクロチューブにPBSを8μlのライセートの1μlを希釈する。直接希釈した混合物に1Xセレンテラジン基質100μlを加えるとすぐに5秒の読み取りとチューブルミノメーターを（20/20 Nターナーサイエンティフィック）を使用してチューブの発光を測定する。 </li><li> -80アリコートで時間の長い期間の1〜2日またはストアするため-20℃でRUC -抗原のライセート℃にて保存してください。 </li></ol> PART 3：セラマスタープレートの準備<ol><li>最初に（50 mMトリス、pH 7.5、100mMのNaCl、5 mMのMgCl 2、1％トリトンX - 100）96ディープウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートの各ウェルにバッファー450μlを添加することにより血清のマスタープレートを作る。このステップでは、染料、フェノールレッドは、また将来の血清サンプルの追加とLIPSのアッセイの他のステップを監視するためのトレーサーとして動作する（最終濃度は、バッファーに0.2μg/ mlの場合）バッファに含めることができます。 </li><li>次の緩衝液A 450μlを含む別のウェルに各サンプルから血清50μlを追加するには、これは一般的に血清をマスタープレートの最後の二つのウェルに添加されていないバッファAの血清の1:10希釈ことに注意してくださいので、これは、バッファのブランクのために予約されています。 </li><li>マスタープレートを使用する前に、それは広範囲にローテータプラットフォーム上で（1-2時間）振とうする。マスタープレートの血清はSTAです。少なくとも1ヶ月BLE（または長い）4℃、蒸発を防ぐために正しく保存されている場合。 </li><li>後述のように、このマスタープレートを繰り返し、複数の抗原に対する血清中のプロファイリングのために削除される希釈血清10μlを提供します。大きくしたり小さくマスタープレートを使用することもできる。それが使用されていないパラフィルムでプレートをシール。 </li></ol>パート4：LIPSアッセイ<ol><li>ポリプロピレン96浅いウェルマイクロタイタープレートは、血清をテストするために使用されています。最初のステップでは、8チャンネルマイクロピペットを用いて96ウェルプレートの各ウェルにバッファー40μlを加える。 </li><li>次のマスタープレートから希釈血清（1μlの血清と同等）の10μlを取り、8チャンネルマイクロピペットを用いてワーキングプレートの各ウェルに直接追加してください。 </li><li> RUC -抗原の抽出物を含有するマスターミックスは、次の1 × 10 7ライトユニット（LU）を各ウェルに緩衝液50μlに追加されるように製剤化される。下の入力（わずか1 X 10 6）にも使用できますが、低ダイナミックレンジの結果をすることができます。各ウェルにこのマスターの混合物とRUC -抗原の混合物のピペットを50μlを加えます。 </li><li>室温で1時間ロータリーシェーカー上でインキュベートする。 </li><li>インキュベーション中に、新しい96ウェルフィルターHTSプレート（ミリポア、ベッドフォード、MA）の各ウェルの底にULTRALINKタンパク質PBSで/ Gビーズ（ピアースバイオテクノロジー、ロックフォード、IL）の30％懸濁液の5μlを追加。 </li><li> 1時間のインキュベーションの後、蛋白質8チャンネルマイクロピペットを使用して/ Gビーズを含む96ウェルフィルターHTSプレートに100μlのRUC -抗原抗体反応混合物を転送する。 </li><li>室温でさらに1時間のためのロータリーシェーカー上で96ウェルフィルタープレートをインキュベートします。 </li><li>次の真空マニホールドのフィルタープレートを洗浄する。各ウェルをPBS100μlで2回に続いて、バッファー100μlで8回洗浄する。これは、手動またはロボットピペッティングのワークステーションで実行できます。 </li><li>最後の洗浄に続いて、真空がオフになっています。フィルタープレートを取り外して、紙タオルやプレートの上部と下部に水分を除去することを確認してろ紙のスタックを使用して乾燥さ汚点。 </li></ol>第5部：測定発光とデータ分析セットアップ： ベルトルトのLB 960セントロマイクロプレートルミノメーターは、各ウェル単一のインジェクタを使用して発光を測定するために使用されます。マシンの電源がオンになると、インジェクタの洗浄サイクルを使用して蒸留H 2 Oでインジェクタをすすいでください。セレンテラジンを基質は、製造業者によって記載されたようプロメガシイタケの基板キットを用いて調製される。 1Xセレンテラジン基板ミックスの一般的に6mlの（すなわち、60μlのセレンテラジンの株式に加え、1Xバッファー6 ml）をプライミングマシンのために準備し、つの完全な96ウェルプレートを実行しています。プレートを分析する前に、ベルトルトのLB 960セントロマイクロプレートルミノメーターは、1Xセレンテラジンの基板で準備されている。基質を注入し、プレートを読み取るための設定を含むプログラムファイルを開きます。これらの測定では、セレンテラジンを基質50μlを注入した、プレートは発光の読み取り5秒に続いて、2秒間振とうする。 <ol><li>プレートルミノメーターはプレート全体を読み取る能力がありますが、板の部分的な読み取りは、（読み込みメニューの下）を選択することができます。プレートの読み取りを開始するプログラムを起動します。 </li><li>実行後、ルミノメーターでこぼれを防ぐために速やかにマイクロタイターフィルタープレートを取り外します。分析のためのExcel形式にMikroWinプログラムで生成されたデータをエクスポートします。 </li><li>我々は、2つの独立した実行から血清を評価することをお勧めします。その後、データは各サンプルのLUの力価の値を生成するために平均化されます。これらの値は、さらにバッファのブランクを差し引き、調整することができます。 </li><li>このようなカットを決定するなど、追加のデータ分析は、平均値と制御値の3または5の標準偏差を取ることによって計算することができます。 </li></ol>

<ol><li>Burbelo, P. D., Goldman, R., Mattson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunoprecipitation+method+for+quantitatively+measuring+antibody+responses+in+clinical+sera+samples+by+using+mammalian-produced+Renilla+luciferase-antigen+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simplified immunoprecipitation method for quantitatively measuring antibody responses in clinical sera samples by using mammalian-produced Renilla luciferase-antigen fusion proteins.</a> BMC Biotechnol. 5, 22-22 (2005).</li>
<li>Burbelo, P. D., Leahy, H. P., Iadarola, M. J., Nutman, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Four-Antigen+Mixture+for+Rapid+Assessment+of+Onchocerca+volvulus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A Four-Antigen Mixture for Rapid Assessment of Onchocerca volvulus Infection.</a> PLoS Negl Trop Dis. 3, e438-e438 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+luminescent+profiling+of+anti-La+and+other+autoantibodies+in+Sj+gren%E2%80%99s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust luminescent profiling of anti-La and other autoantibodies in Sj gren’s syndrome.</a> Autoimmunity. 139, 241-245 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+antibody+quantification+and+generation+of+whole+proteome+antibody+response+profiles+using+LIPS+%28luciferase+immunoprecipitation+systems%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Rapid antibody quantification and generation of whole proteome antibody response profiles using LIPS (luciferase immunoprecipitation systems).</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 889-895 (2007).</li>
<li>Burbelo, P. D., Groot, S., Dalakas, M. C., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+definition+profiling+of+autoantibodies+to+glutamic+acid+decarboxylases+GAD65%2FGAD67+in+stiff-person+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High definition profiling of autoantibodies to glutamic acid decarboxylases GAD65/GAD67 in stiff-person syndrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 366, 1-7 (2008).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+luminescence+assay+for+autoantibodies+to+mammalian+cell-prepared+insulinoma-associated+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">A new luminescence assay for autoantibodies to mammalian cell-prepared insulinoma-associated protein 2.</a> Diabetes Care. 31, 1824-1826 (2008).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+diagnosis+of+human+herpes+simplex+virus+type+1+and+2+infections+by+luciferase+immunoprecipitation+system+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serological diagnosis of human herpes simplex virus type 1 and 2 infections by luciferase immunoprecipitation system assay.</a> Clin Vaccine Immunol. 16, 366-371 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+quantitative+serological+detection+of+anti-cytomegalovirus+%28CMV%29+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Highly quantitative serological detection of anti-cytomegalovirus (CMV) antibodies.</a> Virol J. 6, 45-45 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-antigen+mixture+containing+v-cyclin+for+serological+screening+of+human+herpesvirus+8+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Four-antigen mixture containing v-cyclin for serological screening of human herpesvirus 8 infection.</a> Clin Vaccine Immunol. 16, 621-627 (2009).</li>
<li>Ramanathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luciferase+immunoprecipitation+systems+assay+enhances+the+sensitivity+and+specificity+of+diagnosis+of+Strongyloides+stercoralis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A luciferase immunoprecipitation systems assay enhances the sensitivity and specificity of diagnosis of Strongyloides stercoralis infection.</a> J Infect Dis. 198, 444-451 (2008).</li>
</ol>

LIPSは、最小限のアッセイの最適化と、そのシンプルさのために、高品質のデータは通常、任意の抗原に2週間の下でLIPSを使用して生成することができますが必要です。最も時間のかかる手順がクローニングされ、RUC -抗原の融合を含む適切なプラスミド発現ベクターを生成する。これらのプラスミドが生成されると、単一または複数の抗原は、急速に上記のような唇でテストすることができます。それは、LIPSはそのようなその血清はまた、チューブの形式であるいは分注ロボットワークステーションの助けを借りて、マイクロタイターフィルタープレート2または吸引ろ過付きプレートウォッシャーでテストすることができる非常に汎用性であることに留意すべきである。この高度にスケーラブルなシステムとは、人間の自己抗原3またはウイルスの4の全プロテオームのパネルのプロファイリングを並列LIPSが可能になります。それは、LIPSによって生成される多くの異なった抗体のプロファイルは、治療10のコースに続く、ワクチンの監視診断3-9、抗原の発見9のに有用であると特定の疾患状態のため、一般的に公衆衛生のための広範な意味を持っている可能性が高いです。

<table><tbody><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm 組織培養皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>1814443</td><td></td></tr><tr><td>Complete, Mini プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Roche Group</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン製 96 DeepWell 1 ml プレート</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td>蓋付きディープウェルプレート、Parafilmで密封</td></tr><tr><td>ポリプロピレン製マイクロタイタープレート</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td></td></tr><tr><td>HTS フィルタープレート</td><td>EMD Millipore</td><td>MSBVN1B50</td><td></td></tr><tr><td>Ultralink 固定化 Protein A/G</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>53133 (10ml)</td><td></td></tr><tr><td>Renilla ルシフェラーゼアッセイシステム</td><td>Promega Corp.</td><td>E2820</td><td>2000回分析分</td></tr><tr><td>Centro マイクロプレートルミノメーター</td><td>Berthold Technologies</td><td>LB 960</td><td></td></tr></tbody></table>

ルシフェラーゼ免疫系による抗体のプロファイリング（lips）

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

総合的に自己抗原と感染性病原体に対する抗体のプロファイルを理解し、定量化するための技術は、病気のメカニズムに新たな洞察をもたらすかもしれませんし、別の臨床的特徴と病因についての理解を深めるとともに病気をsubstratifyに新しいマーカーを明らかにすることがあります。我々は、感染症に関連する自己抗原と病原体抗原に対する患者血清の抗体応答をプロファイリングするためのルシフェラーゼ免疫システムを（LIPS）と呼ばれる高度に定量的な方法を開発した。 ELISA法とは異なり、高感度なLIPSは、簡単に普遍的な形式の異なる抗原に対する体液性血清学的応答プロファイルを調査するために実装し、動的な抗体価が6ログまで変化して生成され<sub&gt; 10</sub&gt;いくつかの抗原に対して。これらの研究では、抗原のパネルあるいはいくつかの病原体（すなわちHIV）の全体プロテオームに対する患者の体液性応答のLIPSによる定量的プロファイリングは、通常、ELISAによって単一の抗原をテストするより有益です。さらに、LIPSはまた高度に精製した抗原だけでなく、標準的なELISAのために必要な労働集約型のアッセイの最適化のステップを生成するために必要な時間と労力を排除。ここでは、容易に単一または複数の抗原に対する抗体応答をプロファイリングするための実行LIPSアッセイの技術的な側面を説明する詳細なプロトコルを提供しています。

実行LIPS（ルシフェラーゼ免疫システム）の技術的な側面が説明されています。全体的なアプローチは、哺乳動物細胞でウミシイタケルシフェラーゼ（RUC）に融合した抗原をコードするキメラ遺伝子を発現する伴います。原油RUC -抗原の抽出液を調製し、精製することなく、抗体を定量化するために免疫沈降アッセイにおいて使用される。

ルシフェラーゼ免疫系による抗体のプロファイリング（LIPS）

自己抗原および感染症因子に対する抗体プロファイルを包括的に理解し、定量化するための技術は、疾患に関する新たな知見をもたらす可能性があります。

このビデオでは、LIPSの実施手順を実演します。アッセイ抗原は、組換えRenilla luciferaseまたはRuc抗原融合タンパク質としてCOS-1細胞で発現させます。粗抽出液を回収し、精製せずに使用します。lipsアッセイは、粗抽出したrook抗原抽出液と患者のSRAをインキュベートすることで開始します。その後、抗原抗体混合液を、Protein A/Gビーズを含む96ウェルフィルタープレートのマイクロタイターウェルに移し、Protein A/Gビーズを含むフィルタープレートを洗浄してIgG分子を捕捉します。抗体に結合したrook抗原は、ルミネッセンス基質の添加によって測定し、発光ユニットをルミノメーターで測定します。こんにちは。国立歯科・口腔顔面疾患研究所、感覚生物学研究室のCatherine Chang博士です。本日は、LIPS（ルシフェラーゼ免疫沈降システム）の手順をご紹介します。当研究室では、疾患や感染症の診断を目的として、抗体価を測定するためにLIPSを用いています。疾患状態の層別化、ワクチンのモニタリング、および抗体プロファイルの作成に関わるその他のアプリケーションに利用されます。それでは始めていきましょう。トランスフェクションを開始する前に、BMC biotechnologyの論文に記載されている方法に従い、バニラルシフェラーゼ融合タンパク質用のプラスミドをあらかじめ調製しておきます。BYO etal 2005 プラスミドDNAは、MIDI prepキットを用いて1〜3 mgの収量で調製し、1 mg/mLのストック溶液として-20 °Cで保存します。トランスフェクションに使用するCos-1細胞は、標準的な組織培養プロトコルに従い、10% FCS含有DMEMで培養します。トランスフェクションの1日前に、Cos-1細胞を新しい100 × 20 mmディッシュに、1プレートあたり約2 × 10⁶ cellsとなるように播種し、37 °Cでインキュベートし、翌日に使用します。細胞のコンフルエンシーは80～95%である必要があります。4°Cで保存されているFusionGene 6トランスフェクション試薬を室温に戻します。試薬が室温になるまで待機している間に、トランスフェクションに使用する各プラスミドDNA用に1.5 mLポリプロピレン製マイクロ遠心チューブにラベルを貼ります。この際、チューブの側壁に触れないように注意してください。すでに94 µLのOpti-MEMが入っているチューブに、FusionGene 6を6 µL加えます。室温で5分間インキュベートします。1～2 µgのプラスミドDNA（Luciferase抗原融合コンストラクト）を加え、チューブを数回反転させて混合し、短時間遠心分離した後、室温で15分間インキュベートします。DNA融合物6の最適溶液すべてを、COS-1細胞の培地に均等に滴下して導入します。トランスフェクションしたCOS-1細胞を2日間インキュベートした後、回収します。融合タンパク質の回収を開始するには、培地を除去し、6 mLのPBSで細胞を洗浄してください。組織培養ディッシュから残りのPBSをピペットで取り除き、冷たい溶解バッファーを1.4 milliliters加え、セルスクレイパーで細胞を回収します。溶解液の半分ずつを、氷上に置いた2本の1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに迅速に移します。細胞を破砕するために、Branson SOLIDIFIER 150を使用します。細胞溶解液の入ったマイクロ遠心チューブを氷上に置き、5秒間パルス処理します。5秒間、そしてさらに5秒間。超音波処理の設定をそれぞれ2、2、4として行います。細胞溶解液を12,500 RPMで4分間遠心分離します。4 °Cで遠心分離を行います。遠心分離の合間にチューブを穏やかに転倒混和し、チューブ壁面に緩く付着したデブリを除去します。その後、2本のチューブから、ペレットを乱さないように注意して上清を回収し、氷上の新しいマイクロ遠心チューブに移します。溶解液の光単位（lu）を測定するには、新しいマイクロ遠心チューブ内で溶解液 1 µL を 8 µL の PBS で希釈します。希釈した混合液に OneCelent INE 基質 100 µL を直接加え、チューブルミノメーターを用いて直ちにチューブ内のルミネッセンスを測定します。このステップ以降の読み取り時間は 5 秒に設定してください。ヒトおよび動物由来のサンプルを扱う際は、安全上の予防措置を講じることを忘れないでください。抗原プロファイリングのための患者抗体のソースとなる血清マスタープレートを作成するには、まず 96 ウェル深孔ポリプロピレンマイクロタイタープレートの各ウェルにバッファーAを 450 µL 加えます。このステップでは、今後のSRAサンプルの添加やlipsアッセイのその他のステップをモニタリングするためのトレーサーとして、フェノールレッド染料をバッファーAに添加してもよい。次に、450 µLのバッファーを含む各ウェルに、各サンプルから50 µLの血清を添加する。注：これは、バッファーによるSRAの10倍希釈である。通常、マスタープレートの最後の2ウェルにはSRAを添加しません。これは、マスタープレートを将来の使用のために保存する前に、バッファーブランクとして予約しておくためです。その後、ローテータープラットフォーム上で1〜2時間十分に振盪させます。650 RPMで回転させた場合、血清は4 °Cで少なくとも1ヶ月以上安定して保持されます。LIPSアッセイを実施する前に保存する場合は、蒸発を防ぐためにパラフィルムでプレートを密封してください。サンプル識別番号とマスタープレート上の対応するウェルを記載したスプレッドシートを作成します。血清の検査には、ワーキングプレートとしてポリプロピレン製の96 shallow wellマイクロタイタープレートを使用します。最初のステップとして、8チャンネルマイクロピペットを用いて、96ウェルプレートの各ウェルにバッファーAを40 µLずつ加えます。次に、マスタープレートから希釈した血清を10 µL分取り、8チャンネルマイクロピペットを用いてワーキングプレートの各ウェルに直接加えます。使用後、マスタープレートをパラフィルムで密封し、蓋を閉めてからサランラップで覆い、4 °Cで保存します。次に、各ウェルに1 × 10⁷ LUが添加されるように、50 µLのバッファーAにrook抗原抽出物を含むマスターミックスを調製します。このマスターミックスを作成し、各ウェルにrook抗原混合液を50 µLずつピペッティングします。プレートをポリスチレン製プレートカバーで覆い、ロータリーシェーカーを用いて100 RPMで1時間インキュベートします。インキュベーション中の室温にて、冷蔵庫からPBS中の30% Ultra Link Protein AGビーズ懸濁液の1.5 mL分注量を取り出します。新しい96ウェルフィルターHTSプレートの各ウェルの底に5 µLずつ加えます。プレートを1時間インキュベートした後、マルチチャンネルマイクロピペットを用いて、100 µLの抗原抗体反応混合液をProtein AGビーズを含む96ウェルフィルターHTSプレートに移します。96ウェルフィルタープレートをロータリーシェーカーにかけ、室温、100 RPMでさらに1時間インキュベートします。次に、Biome FXオートメーションワークステーションを用いてフィルタープレートを洗浄します。真空マニホールドを使用し、各ウェルを100 µLのバッファーAで8回洗浄し、続いて100 µLのPBSで2回洗浄します。最後の洗浄後、真空をオフにします。フィルタープレートを取り出し、ペーパータオルの束またはろ紙を用いて、プレートの上下の水分を完全に取り除いて吸い取ります。プレートの各ウェルの発光強度の測定には、Burt hold LB nine 60 Centroマイクロプレートルミノメーターを使用します。装置の電源を入れ、インジェクターを蒸留水で洗浄します。インジェクター洗浄サイクルを使用します。INE基質は、装置のプライミングおよび運転に使用され、製造元の指示に従ってPromega ranil基質キットを用いて調製します。通常、1プレートにつき6 mLの1×基質ミックスが必要です。基質混合物をルミノメーターにロードし、基質の注入およびプレートの読み取り設定が含まれているプログラムファイルを開きます。これらの測定では、50 µLの基質を注入します。プレートを2秒間振盪させた後、5秒間発光を測定します。測定後、プレートの読み取りを開始するプログラムを立ち上げ、ルミノメーター内での液漏れを防ぐため、速やかにマイクロタイターフィルタープレートを取り出します。データは、さらなる解析のためにmicrowindプログラムからExcel形式で自動的にエクスポートされます。同一血清を用いた2回の異なるランの結果を平均化します。各サンプルのluタイター値を算出するために、2回の測定を行うことが推奨されます。重複サンプル間のタイター値は、2回のランの間で高い一致を示すはずです。データプロットにおいては、ここで示すように、バッファーブランクを差し引くことでluタイター値をさらに調整することが可能です。本アッセイの感度と特異度は、コントロールサンプルの平均値に標準偏差の3倍または5倍を加えたカットオフ値を利用して算出することも可能です。以上で、LIPSを用いた抗体価の測定方法について説明しました。LIPSはアッセイの最適化をほとんど必要とせず、その簡便さから、どのような抗原に対しても2週間以内に高品質なデータを生成することができます。ヒト血清を取り扱う際は、適切な安全上の予防措置を講じることが重要です。また、Liftsは拡張性が非常に高く、そのため、手動洗浄による少数のサンプル測定から、ロボットワークステーションを用いたフルプレート測定まで対応可能です。このような汎用性を持つLiftsは、血清抗原分析において非常に有用であり、疾患分析および一般的な公衆衛生に幅広い影響を与えると考えています。以上です。ご視聴ありがとうございました。抗体プロファイリング実験の成功をお祈りしています。

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JoVE Journal

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生物学

ELISAは、簡単にルミネックスXMAPアッセイに変換することができると、多重化の利点を介して、いくつかの抗体は、アッセイのコストを削減しながら、増加した感度とダイナミックレンジの結果、最適な抗体のペアを識別するために同時にスクリーニングすることができる。...

多重抗体スクリーニング法を用いたLuminex XMAPアッセイへの捕捉ELISAの変換

このビデオは、ルシフェラーゼタグ付きタンパク質の定量に使用されるルシフェラーゼアッセイを示しています。このアッセイでは、目的のタンパク質と結合した小さなフラグメントと結合する大きなフラグメントで構成される人工的なルシフェラーゼ酵素を使用します。結合したサブユニットは活性酵素を形成し、基質の存在下で発光シグナルを放出します。次に、この信号をルミノメーターを使用して定量化します。...

ルシフェラーゼアッセイ:人工ナノルシフェラーゼシステムベースのバイオレポーターを使用して発光シグナルを測定するハイスループットアッセイ

このビデオでは、ELISpotアッセイを使用して抗体分泌B細胞(ASC)の機能を評価する方法を示しています。ASCから分泌された抗体は、膜結合ポリクローナル抗体フラグメントと相互作用し、酵素標識IgGまたはIgM抗体によって検出されます。各ウェルに生成された色付きのスポットは、B細胞の分泌活性と相関する特定の抗体のアイソタイプの存在を示しています。...

ELISpotアッセイを用いた抗体分泌B細胞の機能評価

タンパク質間相互作用は、細胞の核と細胞質の両方で発生する可能性があります。これらの相互作用を調べるために、従来の共免疫沈降と最新の近接ライゲーションアッセイが適用されます。本研究では、これら2つの方法を比較して、核と細胞質におけるNF90-RBM3相互作用の分布を可視化します。...

共免疫沈降により核および細胞質画分中のタンパク質間相互作用の可視化と<em&gt;その場で</em&gt;近接ライゲーションアッセイ

総蛋白製剤からの薬物の標的タンパク質を測定する商用プラットフォームを用いたキャピラリーを用いた免疫測定法が示されています。さらに、露光時間、タンパク質濃度と抗体希釈アッセイ...

プロシージャおよび自動キャピラリー電気泳動を用いた免疫測定法のためのキーの最適化戦略

複数の調査、ターゲット蛋白質の翻訳後修飾を内因性は非常に挑戦的なすることができます。ここで説明したテクニックを活用開発特定 PTM ターゲットでターゲットのアセチル化、ユビキチン化、sumo 化 2/3、およびチロシンのリン酸化の変更を検出する親和性のマトリックス最適化された換散バッファーとフィルター システム1...

標的タンパク質の翻訳後修飾の内因性プロファイルを識別するために包括的な免疫沈降濃縮システムを活用

ここでは、近接結紮の試金 (PLA) を使用して感度が高い固定細胞における MST1/MST2 heterodimerization...

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

大きな腫瘍サプレッサー (ラッツ) のキナーゼ活動を定量化するルシフェラーゼを用いたバイオ センサーの紹介-中央キナーゼ シグナル伝達経路カバで。このバイオ センサーには、カバ経路レギュレータの in vitroとin...

信号経路活性ルシフェラーゼ ベースの大きい腫瘍のサプレッサー (ラッツ) バイオ センサーを用いたカバを監視

ヒト末梢血単核細胞から個々の抗原特異的抗体を同定し、回収するBSelex法は、フローサイトメトリーと単一細胞PCRおよびクローニングを組み合わせたものです。...

濃縮ヒト記憶B細胞集団からの所望特異性を持つ抗体の選択と回収のための単細胞スクリーニング法

概説されたプロトコルは、HiBiT受容体結合ドメインタンパク質複合体を産生するための手順と、SARS-CoV-2抗体の迅速かつ感度的な検出のためのその応用について説明する。...

HiBiTベースバイオレポーターを用いたSARS-CoV-2受容体結合ドメイン抗体の検出

学ぶルシフェラーゼ免疫沈降システム（LIPS）による抗体定量法。COS-1細胞を用いた抗原発現と粗抽出液を利用した簡便な免疫沈降アッセイで、疾患診断やワクチン効果評価に応用可能です。

ルシフェラーゼ免疫系による抗体のプロファイリング（LIPS）

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