プライマー伸長キャプチャ：重縮退DNAソースからターゲットシーケンスの取得

このビデオでは、コピー数が極めて少なく高度に断片化したDNAソースから、標的DNA配列を回収することを可能にするプライマー伸長キャプチャ（PECA）法について解説します。我々はこの手法を用いて、40,000年以上前のネアンデルタール人の骨から完全なミトコンドリアゲノムをシーケンシングしました。本法は、任意の小さな標的領域や単一塩基多型（SNP）のキャプチャに利用でき、多くの個体に対しても適用可能です。本手順の主なステップは、一次DNAライブラリーのPCR増幅、定量PCRによる増幅ライブラリーの定量、増幅ライブラリーに対する一次伸長の実施、非標的断片を除去するための一次伸長産物のビーズキャプチャ、そしてキャプチャおよび洗浄後の標的DNAの溶出とシーケンシングです。

こんにちは。ライプツィヒにあるマックス・プランク進化人類学研究所、遺伝学部門のShanti Payable研究室のアドリアン・ブリッグスです。本日は、古代の骨のような、複雑に高度に分解されたDNA源から、目的の特定のDNA配列を単離する手順をご紹介します。私たちはこの手順を用いて、Homo neanderthalensis（ネアンデルタール人）のミトコンドリア遺伝的多様性の研究を行ってきました。

それでは開始しましょう。本実験で使用するDNAは、ネアンデルタルの分布圏内の複数の遺跡から発見された、40,000年から70,000年前のネアンデルタルの骨に由来します。まず、骨を一晩UV光にさらすことで、表面にある外来DNAを除去し、汚染を防ぎます。

精密ドリルを使用して100から500ミリグラムの骨粉を作製します。Nadine RocklandとMichael Hofによる2007年の論文「comparison and optimization of ancient DNA extraction」に記載された手順に従い、骨粉からDNAを抽出します。その後、すべてのDNA断片の末端にユニバーサルアダプタープライミング部位を付加することで、DNA抽出物をシーケンシングライブラリに変換します。これは、ネアンデルタール人の骨から作製された4 5 4ライブラリには、わずか数ピコグラムという極少量のDNAしか含まれていない場合があるためです。この一次DNAライブラリを、まずユニバーサルライブラリプライマーに対応するエマルションPCRプライマーを用いたPCRで増幅します。

ライブラリ増幅用のPCRミックスを調製するため、PCRチューブに以下の試薬を混合します。10 X GAMP PCR bufferを10 µL、塩化マグネシウムを2 µL、BSAを2 µL、dNTPミックスを1 µL、4 54 MPCRフォワードプライマーおよびリバースプライマーを各3 µL、AmplyGold DNA polymeraseを1 µL、ライブラリテンプレートを25 µL加えます。最後に、PCRグレードの水45 µLを加え、総量を100 µLにします。AmplyTech Gold DNA polymeraseは室温で安定しているため、氷上での操作は不要です。

PCR反応液を準備した後、PCRチューブをサーモサイクラーにセットし、まず95 °Cで12分間の変性ステップを行い、続いて95 °Cで30秒、60 °Cで1分、72 °Cで1分を1サイクルとして14サイクル繰り返します。これら14サイクルの後、最終ステップとして72 °Cで5分間設定します。PCR増幅が完了した後、使用準備が整うまでPCRチューブを10 °Cで無期限に保持することができます。その後、製造者の指示に従ってKyogen MinLuスピンカラムを用いてPCR産物を精製し、一次伸長および産物キャプチャを行う前に、MinLuキットに付属のEBバッファー50 µLでカラムからDNAを溶出させます。

増幅産物の量を定量し、クオリティを確認するために、非増幅ライブラリおよび増幅ライブラリのアリコートを用いて定量PCRを行う必要があります。14サイクルの増幅ライブラリには、プライマリライブラリの数千倍のDNAが含まれているはずです。そうでない場合は、増幅条件を確認し、再度実施してください。

増幅ライブラリから目的の配列をキャプチャするために使用する一次伸長キャプチャプライマーは、通常のPCRプライマーと同様に設計し、標的領域に一致させます。各標的配列の5'末端に対して、理想的な融解温度60 °Cとなるように設計し、12塩基のテイル配列を付加させるとともに、5'末端にビオチン残基を含めます。200 µMのストック溶液を用いて調製した単一のマルチプレックスミックスに、最大150種類のPECプライマーを組み合わせて使用することが可能です。一次伸長反応では、適切なPCRチューブに10 X GAMP PCR緩衝液 5 µL、塩化マグネシウム 5 µL、BSA 1 µL、dNTP 0.5 µLを加えてPCRミックスを調製します。ここに、一次伸長キャプチャプライマーミックス 5 µL、Taq Gold DNAポリメラーゼ 0.5 µL、14サイクル増幅ライブラリDNA 2 µL、そして最後にPCRグレードの水 31 µLを加え、最終的に全量を50 µLにします。

増幅させたライブラリテンプレートが1µLあたり1×10¹²コピー以上含まれている場合は、反応液に加えるコピー数が2×10¹²コピーを超えないよう、まずEBバッファーでテンプレートを希釈してください。PCRチューブを準備した後、サーモサイクラーにセットし、1回の反応サイクルに設定します。まず95°Cで12分間の変性を行い、続いて60°Cで1分間、さらに72°Cで5分間の一次伸長を行います。

シングルサイクルが終了した後、次のステップまでPCR産物を保持するため、72°Cで維持します。非特異的なプライマーのアニーリングを回避し、直接キャプチャーを行うため、反応混合物がサーモサイクラー内で72°Cに保持されている間に、Qiagen UTE精製キットのPBIまたはPBバッファー150 µLをPCR反応チューブに分注します。これにより、ポリメラーゼを不活性化させると同時に、ターゲットプライマーの非特異的な伸長が起こらない高温状態を維持します。チューブを密閉して軽くボルテックスし、ベンチトップ遠心機で液を回収します。

Qiagen PMバッファーなどの他の結合バッファーは、後続のキャプチャープロセスを妨げる可能性があるため、このステップではPBIまたはPBバッファーのみを使用してください。次に、PCRチューブから混合物を除去し、メーカーの指示に従って、以前に行った通りRogen MinLuスピンカラムに転送して精製します。MinLuキットに付属のEBバッファー30 µLを用いて、カラムからDNAを溶出させます。PECプライマーにアニールしなかったすべてのフラグメントを除去するため、ビーズを用いたキャプチャーステップを行います。

まず、M 270 strip divide in beadsのストック溶液をボルテックスで再懸濁し、サンプル1つあたり25 µLに相当する量のビーズを分取します。ビーズを500 µLの2倍BW緩衝液で2回洗浄し、最初に分取したビーズ量と同量の2倍BW緩衝液で再懸濁します。この懸濁液を25 µL準備します。

各サンプルについて、精製・溶出したDNA 25 µLをビーズ懸濁液 25 µLに加えます。残りの5 µLは後の定量用に保存しておきます。ピペッティングによる吸い上げと排出、およびパーペットチップでの撹拌によってDNAとビーズ懸濁液を混合し、その後、ベンチトップローテーターを用いて室温で15分間ゆっくりと回転させます。混合後、内容物を新しい1.5 mL PCRチューブに移します。

前回の回転インキュベーション工程において、一部の非標的DNAがチューブ壁面に付着した可能性があります。そのため、ビーズ懸濁液を新しいチューブに移すことで、この非標的DNAが最終産物に放出される可能性を回避します。熱溶出工程では、磁性粒子コレクターを使用してビーズをペレット化します。10〜20秒後にはすべてのビーズが壁面に移動し、上清が透明になります。ビーズを洗浄するためにこの上清を除去し、1× BWバッファーを500 µLチューブに加え、低速で約3秒間ボルテックスします。

チューブを立てた状態と逆さまにした状態の両方で、チューブ壁にビーズが付着していないことを確認します。卓上遠心機を用い、チューブ壁からすべての液体が流下するまで、1～3秒間短時間遠心します。チューブをMPCに戻し、すべてのビーズがチューブの側面に集まるまで10～20秒間待ちます。

次に、上清を除去します。これで1回目の洗浄が完了しました。この手順を、最後に行う1回のBW洗浄および上清除去を含めて、さらに4回繰り返します。

1倍濃度のホットウォッシュバッファーを500 µL加えます。前述と同様に、短時間のボルテックス処理とスピンダウンで懸濁液を混合し、その後、サーマルブロックシェーカーを用いて65 °C、1000 RPMで2分間チューブを振盪します。サーマルブロックから取り出した後、1分以内に短時間スピンダウンを行い、上清の残留物を除去します。この工程により、PECプライマーに結合しているがプライマー伸長ステップで伸長されなかった断片が除去されます。ペレットを30 µLのEBバッファーで再懸濁し、混合液を新しい1.5 mL PCRチューブに移します。

チューブをサーマルサイクラーに入れ、95 °Cで3分間インキュベートします。磁性粒子コレクターを用いてビーズをペレット化します。上清が完全に透明になるまで10〜20秒かかります。その後、S上清を回収し、ラベルを貼った新しいチューブに移します。

ビーズを移行させないように注意してください。捕捉されたDNA断片の産物が含まれている上清を回収します。ビーズはこの段階で廃棄できます。

キャプチャした産物を増幅させるため、パート2と同様に、合計容量100 µLのPCRミックスを調製し、同じPCRサイクリング条件で実施します。再び、キャプチャした産物のPCR増幅が完了した後、セクション2で既に行ったようにQiagen Uteスピンカラムを用いて精製し、50 µLのEeb BufferでカラムからDNAを溶出させます。これで、産物をハイスループットシーケンシングに供することが可能です。私たちは、ネアンデルタール人のミトコンドリアゲノム全体をカバーするように、574本のPECプライマーを設計しました。

これらを4つのマルチプレックスミックスに分け、ユーラシア大陸の4つの遺跡から出土した、40,000年から70,000年前のものと推定される5体のネアンデルタール人化石のライブラリに対して、プライマリーエクステンションキャプチャ（PEC）を2ラウンド連続で実施しました。これにより、個体あたり170,000から500,000の配列を生成し、その結果をミトコンドリアリファレンス配列にアラインメントしました。その結果、PECの手法によってミトコンドリアDNAが大幅に濃縮され、各個体のミトコンドリアDNA全域にわたって完全なカバレッジが達成され、平均カバレッジは18倍から56.3倍となりました。これらの結果に基づき、各個体について高品質な完全ミトコンドリアゲノム配列を構築することができました。

次に、これらの配列を、現代の人類および我々に最も近い現生親縁種であるチンパンジーとボノボの世界的なサンプルと比較し、系統解析を行いました。これにより、ネアンデルタール人のミトコンドリアDNAは現代人と密接に関連しているものの、明確に区別されるという以前の知見が確認されました。さらに、ネアンデルタール人の配列同士を比較したところ、ネアンデルタール人の遺伝的多様性は極めて低く、現在の世界的な人類よりも低く、現代のヨーロッパ人と同様であることが明らかになりました。

これらの証拠をネアンデルタール人配列におけるタンパク質進化の解析と組み合わせると、ネアンデルタール人は長期的に個体群サイズが小さかったことが示唆されます。これは、ネアンデルタール人の人口密度が、現代人が到達したレベルに一度も達しなかったとする考古学的証拠と一致しています。以上で、ハイスループットシーケンシングに向けて標的配列を増幅および回収するための、霊長類エクステンションキャプチャの実施方法について解説しました。この手順を行う際は、サーモサイクラーのすべての温度設定に従うことが重要ですが、プライマーによってアニーリング温度が異なる場合があるため、使用する特定のプライマーに合わせてアニーリング温度を調整する必要があることに注意してください。また、すべての洗浄ステップにおいて、可能な限り多くの液体を取り除くよう注意してください。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。