Name: プライマー伸長キャプチャ：重縮退DNAソースからターゲットシーケンスの取得 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: 学ぶプライマー伸長キャプチャ法による古代DNAの標的配列取得法。ネアンデルタール人のミトコンドリアゲノム完全解読に応用し、集団遺伝学的多様性解析に貢献する技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

科学と芸術のクロアチアアカデミーとロジスティックと科学的サポートのための科学のベルリン - ブランデンブルクアカデミー;と財政支援のためのマックスプランク協会の大統領イノベーション基金私たちは、アドバイスM.マイヤーに感謝。 JMGは、NSFの国際ポスドク（OISE - 0754461）によってサポートされていました。ネアンデルタール人の1（Feldhofer 1）FM865407、ネアンデルタール人2（Feldhofer 2）FM865408、Sidron 1253 FM865409、Vindija 33.25 FM865410、Mezmaiskaya 1 FM865411：シーケンスは、アクセッション番号とEBIヌクレオチドデータベースに寄託されています

このメソッドは、で報告された研究で使用されて<a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/325/5938/318">ブリッグスら、Science 325（5938）。 318〜321（2009） 。</a> 必要な試薬： <ul><li>のAmpliTaqゴールドDNAポリメラーゼ</li><li> 10倍ジーンアンプPCRバッファーII </li><li> MgCl 2の 25mMの</li><li> dNTPミックス、25mMの各</li><li> BSA、10 mgの水のML - 1 </li><li>分子生物学グレードの水</li><li> EBバッファ（アプライPCR精製キットに付属）、10mMのトリスHCl、pH8.5で</li><li>アプライPCR精製キット</li><li> M - 270ストレプトアビジンのDynabeads </li><li> 2倍のバインドとウォッシュ（BW）バッファー（2 M NaCl、10mMのトリス- Cl、1mMのEDTA、pH8.0の0.2％ツイーン20） </li><li> 1Xバインディングとウォッシュ（BW）バッファー（2 × BindWashのバッファ水で2倍希釈） </li><li>ホットウォッシュ（HW）バッファ（2.5mmの塩化マグネシウム、1 × Taqポリメラーゼゴールドバッファー、0.1％のTween 20） </li></ul>非標準試薬と機器に関するメーカーの情報については、後でテーブルを参照してください。 1）図書館の増幅<ol><li>ここにDNA鋳型は454で説明されているように、低コピー数のDNAの源から調製したライブラリ（RohlandとHofreiter、2007A、2007B）と（MaricicとPääbo、2009）である。ライブラリ全体を増幅するために、以下のPCRミックスを調製： <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 反応あたりμL </td></tr><tr><td>水</td><td> 45 </td></tr><tr><td> 10XジーンアンプPCR緩衝液II </td><td> 10 </td></tr><tr><td>のMgCl 2（25mMの） </td><td> 10 </td></tr><tr><td> BSA（10 mg / ml）を</td><td> 2 </td></tr><tr><td>のdNTP（25mMの各） </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 454 emPCR FWD primer/10uM </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 454 emPCRのRV車のprimer/10uM </td><td> 3 </td></tr><tr><td>のAmpliTaqゴールドのDNAポリメラーゼ（5 U /μL） </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 454 DNAライブラリーのテンプレート</td><td> 25 </td></tr><tr><td> 合計 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table></li><li> 14サイクルの増幅のためのサーモサイクラーに以下のPCRプログラムを使用して、 <ol><li> 95℃12分</li><li> 95℃30秒</li><li> 60 ° C（または、目的のアニーリング温度）1分</li><li> 72℃1分</li><li> 2（× 13）に移動します</li><li> 72℃5分</li><li> 10 ° C∞ </li></ol></li><li>製造元の指示に従ってキアゲンMinEluteスピンカラム上の反応を清める。 50μlのバッファーのEBで溶出します。 </li><li>精製された増幅産物だけでなく、定量PCRで増幅されていないライブラリのアリコート（Meyerら、2007）定量化する。増幅産物は、ULあたり以上1 × 10 12個のコピーを持っている場合ではなく、2つ以上のX 10 12コピーは、プライマー伸長反応に追加されるように以下のプライマー伸長のステップでテンプレートの量を減らす。 </li></ol> 2）プライマー伸長<ol><li>反応の必要な数のマスターミックスを調製する。 <table border="0" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 反応あたりμL </td></tr><tr><td>水</td><td> 45 </td></tr><tr><td> 10XジーンアンプPCR緩衝液II </td><td> 10 </td></tr><tr><td>のMgCl 2（25mMの） </td><td> 10 </td></tr><tr><td> BSA（10 mg / ml）を</td><td> 2 </td></tr><tr><td>のdNTP（25mMの各） </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 454 emPCR FWD primer/10uM </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 454 emPCRのRV車のprimer/10uM </td><td> 3 </td></tr><tr><td>のAmpliTaqゴールドのDNAポリメラーゼ（5 U /μL） </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 454 DNAライブラリーのテンプレート</td><td> 25 </td></tr><tr><td> 合計 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table></li><li> 単一のプライマー伸長反応のためのサーモで次のプログラムを実行します。 <ol><li> 95℃12分</li><li> 60 ° C（または、PECのプライマーのアニーリング温度と異なる場合）1分</li><li> 72℃5分</li><li> 72 ° C永遠に！ 重要なステップは、72で拡張後の反応℃以下でご使用ください。ヒートブロックから削除する前に、チューブにQIAGENアプライの​​精製のため、直接ピペット150ul PBIまたはPBバッファ。これは、アニーリング非特異的プライマーを避けるために、混合物は冷却としてキャプチャすることが重要です。 </li></ol></li><li>製造元の指示に従って、キアゲンMinEluteスピンカラム上に反応して浄化する。 50μlのEBで溶出。 </li></ol> 3）拡張製品のキャプチャ<ol><li>ボルテックスによりM - 270ビーズの再懸濁し、ストック溶液。サンプルあたり25μlのビーズ懸濁液を取り出してください。サンプルあたり25μlの2xBWバッファに500ul 2倍BWバッファーに懸濁するで二回ビーズを洗浄してください。 </li><li>ステップ3.1からステップ2.3から25μlのビーズ懸濁液に25μlの溶出液を追加。 1に対して回転して混ぜる室温で5分。 推奨 ：定量PCRの定量化のためのステップ2.3からの溶出液の5μlの残り続ける。 </li><li>新鮮な1.5mlチューブに混合物全体を転送する（これは、非ターゲットライブラリのフラグメントのキャリーオーバーを減らすのに役立ちます）。ペレット磁気粒子のコレクタ（MPC）を用いて上清、上清を捨てる。 </li><li> 500μlの1xBWバッファー（多くの洗浄はできるだけ多くのバックグラウンドとして除去するのに役立つ）で5回洗浄する。最後の洗浄ステップの後、一時的にスピンダウンし、上清の最後の痕跡を削除する。 </li><li> 500μL× 1ホットウォッシュ（HW）バッファを追加します。サーマルブロックに65 ° C（またはPECプライマーのTm上記5C）で2分間振とうする。冷却最小限に抑えるために、この後すぐに上清を取り除く。 （このステップはまだPECプライマーではなく、実際に延長工程の間に延長に関連付けられている背景の断片を削除することです）。上清の最後の痕跡を削除します。 </li><li> 30μlのEBバッファにビーズペレットを再懸濁する。新鮮な1.5mlチューブに混合物全体を転送する（これは、非ターゲットライブラリのフラグメントのキャリーオーバーを減らすのに役立ちます）。溶出用サーマルサイクラーで3分間95℃でインキュベートする。 MPCの場所と背後にあるビーズを残すように注意しながら、上清を取り除く。 </li></ol> 4）製品の増幅をキャプチャ<ol><li>サンプルの必要な数のPCRマスターミックスを調製する。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 反応あたりμL </td></tr><tr><td>水</td><td> 45 </td></tr><tr><td> 10XジーンアンプPCR緩衝液II </td><td> 10 </td></tr><tr><td>のMgCl 2（25mMの） </td><td> 10 </td></tr><tr><td> BSA（10 mg / ml）を</td><td> 2 </td></tr><tr><td>のdNTP（25mMの各） </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 454 emPCR FWD primer/10uM </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 454 emPCRのRV車のprimer/10uM </td><td> 3 </td></tr><tr><td>のAmpliTaqゴールドのDNAポリメラーゼ（5 U /μL） </td><td> 1 </td></tr><tr><td>溶出されたキャプチャ製品</td><td> 25 </td></tr><tr><td> 合計 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table></li><li> 14サイクルの増幅のためにサーモサイクラーでは、次のPCRプログラムを使用します。 <ol><li> 95℃12分</li><li> 95℃30秒</li><li> 60 ° C（または、目的のアニーリング温度）1分</li><li> 72℃1分</li><li> 2（× 13）に移動します</li><li> 72℃5分</li><li> 10 ° C∞ </li></ol></li><li>製造元の指示に従ってキアゲンアプライシリカスピンカラムを介して反応を清める。 50μlのEBのバッファーで溶出。製品はステップ2.1で始まる、キャプチャの第二ラウンドのいずれかを使用、または順序付けのために、454エマルジョンPCRのプロトコルに直接入力できます。 </li></ol>代表的な結果： 推奨ノーマルと混在さ - &quot;陽性対照標的配列&quot;（1ピコグラムは、簡単に十分な例：a〜100ベーシスポイントPCR産物）の少量が最初に捕獲反応を行うためにPECのプロトコルを使い始めたときにそれを強くお勧めします。増幅された454ライブラリのテンプレート（ステップ2.1参照）の量、およびキャプチャはポジティブコントロールの製品をキャプチャするために設計された単一のPECのプライマーを使用して実行されます。このコントロール反応が行われる場合、ポジティブコントロール固有の、454アダプタ固有のプライマーペアの両方の定量PCRは、精製したプライマー伸長反応（1.3）で&quot;制御対象&quot;対バックグラウンドの量を定量することができる、プライマー伸長生成物（2.3 ）と溶出ビーズキャプチャ製品（3.6）。この方法では、あなたの実験条件におけるバックグラウンドの除去（&quot;特異性&quot;）とターゲットの回復（&quot;感度&quot;）の効率性の両方の効果を直接測定することができます。 成功したPECプロト​​コルは、通常、次のプロパティがあります - 感度（プロトコルを介して保持された制御対象の量によって測定される）： 溶出ビーズキャプチャ製品で制御対象の合計金額（3.6）=〜プライマー伸長反応（2.3）精製における総量1〜20％。 背景 （454 emPCRのプライマー対によって測定される）： 溶出ビーズキャプチャ製品（3.6）で背景の総量&lt;精製したプライマー伸長反応（2.3）の合計額の0.01％。 最終製品に残っているターゲットの1％未満がある場合は、プライマー伸長のステップは失敗している可能性があり、調査する必要があります。 最終製品に残っている背景の0.01％よりもはるかにある場合は、洗浄ステップが正しく実行された可能性があり、調査する必要があります。

<ol><li>Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Lalueza-Fox, C., Rudan, P., Brajkovic, D., Kucan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+retrieval+and+analysis+of+five+Neandertal+mtDNA+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted retrieval and analysis of five Neandertal mtDNA genomes.</a> Science. 325 (5938), 318-321 (2009).</li>
<li>Rohland, N., Hofreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+optimization+of+ancient+DNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Comparison and optimization of ancient DNA extraction.</a> Biotechniques. 42 (3), 343-352 (2007).</li>
<li>Rohland, N., Hofreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+DNA+extraction+from+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ancient DNA extraction from bones and teeth.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1756-1762 (2007).</li>
<li>Maricic, T., Pääbo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+454+sequencing+library+preparation+from+small+amounts+of+DNA+permits+sequence+determination+of+both+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands.</a> Biotechniques. 46 (1), 51-57 (2009).</li>
<li>Meyer, M., AW, B. riggs, Maricic, T., Hober, B., Hoffner, B., Krause, J., Weihmann, A., Paabo, S., Hofreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+micrograms+to+picograms%3A+quantitative+PCR+reduces+the+material+demands+of+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 36 (1), e5-e5 (2007).</li>
</ol>

著者らに開示すべき事項はありません。

PECの方法は、簡単、迅速、高感度かつ特異的である。したがって、我々は、著者などのRNAライブラリから小さなRNA断片のキャプチャのような古代のDNAの外側に描く、複数のアプリケーション、メタゲノムサンプルからプールされたサンプルや16Sのキャプチャ（または他の遺伝子座）多様性の構造変化の尋問。言及する一つのポイントは、キャプチャの感度は、多重捕獲反応が増加するのPECプライマーの数として低くなるということです。 PECは、したがって、理想的に（例えばメガベース以上）非常に大規模な捕獲領域のキャプチャには適していない、しかし非常によく迅速な方法で多くの個人から小規模なターゲット領域、あるいはSNP位置の捕獲に適しています。

<table><tbody><tr><td>AmpliTaq Gold polymerase (GeneAmp PCR buffer II および MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;含有)</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8080241</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN MinElute PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>M-270 ストレプトアビジンビーズ</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁気粒子セパレーター</td><td>Invitrogen</td><td>120.02D</td><td></td></tr></tbody></table>

プライマー伸長キャプチャ：重縮退dnaソースからターゲットシーケンスの取得

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

古代の骨の典型的なように我々は、大きく劣化し、微生物のDNAで汚染されているDNAの源から標的DNA配列の取得の方法を提示する。方法は、大幅にPCRまたはショットガンシーケンシングのアプローチを指示するために相対的なサンプルの破壊とシーケンシング要求を減少させる。我々は、地理的範囲にわたってから五ネアンデルタール人の完全なミトコンドリアDNA（mtDNA）のゲノムを再構成するためにこのメソッドを使用する。後期ネアンデルタール人のミトコンドリアDNAの遺伝的多様性は、現代的な現代人のそれよりも約3倍低かった。一緒にミトコンドリアのタンパク質の進化の分析と、これらのデータは、ネアンデルタール人の長期的効果的な集団サイズが現代人と現存の大型類人猿のそれより小さかったことを示唆している。

我々は、我々は5つのネアンデルタール人の完全なミトコンドリアゲノムを再構築するために使用されるターゲット古代のDNA配列の検索、の方法を提示する。現代の人間とのこれらの配列の比較は、ネアンデルタール人は、長期の低効果的な人口の大きさを持っていたことを示唆している。

プライマー伸長キャプチャ：重縮退DNAソースからターゲットシーケンスの取得

私たちは、……に典型的な、高度に分解され、かつ微生物DNAに汚染されたDNAソースから、標的DNA配列を回収する方法を提示します。

このビデオでは、コピー数が極めて少なく高度に断片化したDNAソースから、標的DNA配列を回収することを可能にするプライマー伸長キャプチャ（PECA）法について解説します。我々はこの手法を用いて、40,000年以上前のネアンデルタール人の骨から完全なミトコンドリアゲノムをシーケンシングしました。本法は、任意の小さな標的領域や単一塩基多型（SNP）のキャプチャに利用でき、多くの個体に対しても適用可能です。本手順の主なステップは、一次DNAライブラリーのPCR増幅、定量PCRによる増幅ライブラリーの定量、増幅ライブラリーに対する一次伸長の実施、非標的断片を除去するための一次伸長産物のビーズキャプチャ、そしてキャプチャおよび洗浄後の標的DNAの溶出とシーケンシングです。こんにちは。ライプツィヒにあるマックス・プランク進化人類学研究所、遺伝学部門のShanti Payable研究室のアドリアン・ブリッグスです。本日は、古代の骨のような、複雑に高度に分解されたDNA源から、目的の特定のDNA配列を単離する手順をご紹介します。私たちはこの手順を用いて、Homo neanderthalensis（ネアンデルタール人）のミトコンドリア遺伝的多様性の研究を行ってきました。それでは開始しましょう。本実験で使用するDNAは、ネアンデルタルの分布圏内の複数の遺跡から発見された、40,000年から70,000年前のネアンデルタルの骨に由来します。まず、骨を一晩UV光にさらすことで、表面にある外来DNAを除去し、汚染を防ぎます。精密ドリルを使用して100から500ミリグラムの骨粉を作製します。Nadine RocklandとMichael Hofによる2007年の論文「comparison and optimization of ancient DNA extraction」に記載された手順に従い、骨粉からDNAを抽出します。その後、すべてのDNA断片の末端にユニバーサルアダプタープライミング部位を付加することで、DNA抽出物をシーケンシングライブラリに変換します。これは、ネアンデルタール人の骨から作製された4 5 4ライブラリには、わずか数ピコグラムという極少量のDNAしか含まれていない場合があるためです。この一次DNAライブラリを、まずユニバーサルライブラリプライマーに対応するエマルションPCRプライマーを用いたPCRで増幅します。ライブラリ増幅用のPCRミックスを調製するため、PCRチューブに以下の試薬を混合します。10 X GAMP PCR bufferを10 µL、塩化マグネシウムを2 µL、BSAを2 µL、dNTPミックスを1 µL、4 54 MPCRフォワードプライマーおよびリバースプライマーを各3 µL、AmplyGold DNA polymeraseを1 µL、ライブラリテンプレートを25 µL加えます。最後に、PCRグレードの水45 µLを加え、総量を100 µLにします。AmplyTech Gold DNA polymeraseは室温で安定しているため、氷上での操作は不要です。PCR反応液を準備した後、PCRチューブをサーモサイクラーにセットし、まず95 °Cで12分間の変性ステップを行い、続いて95 °Cで30秒、60 °Cで1分、72 °Cで1分を1サイクルとして14サイクル繰り返します。これら14サイクルの後、最終ステップとして72 °Cで5分間設定します。PCR増幅が完了した後、使用準備が整うまでPCRチューブを10 °Cで無期限に保持することができます。その後、製造者の指示に従ってKyogen MinLuスピンカラムを用いてPCR産物を精製し、一次伸長および産物キャプチャを行う前に、MinLuキットに付属のEBバッファー50 µLでカラムからDNAを溶出させます。増幅産物の量を定量し、クオリティを確認するために、非増幅ライブラリおよび増幅ライブラリのアリコートを用いて定量PCRを行う必要があります。14サイクルの増幅ライブラリには、プライマリライブラリの数千倍のDNAが含まれているはずです。そうでない場合は、増幅条件を確認し、再度実施してください。増幅ライブラリから目的の配列をキャプチャするために使用する一次伸長キャプチャプライマーは、通常のPCRプライマーと同様に設計し、標的領域に一致させます。各標的配列の5'末端に対して、理想的な融解温度60 °Cとなるように設計し、12塩基のテイル配列を付加させるとともに、5'末端にビオチン残基を含めます。200 µMのストック溶液を用いて調製した単一のマルチプレックスミックスに、最大150種類のPECプライマーを組み合わせて使用することが可能です。一次伸長反応では、適切なPCRチューブに10 X GAMP PCR緩衝液 5 µL、塩化マグネシウム 5 µL、BSA 1 µL、dNTP 0.5 µLを加えてPCRミックスを調製します。ここに、一次伸長キャプチャプライマーミックス 5 µL、Taq Gold DNAポリメラーゼ 0.5 µL、14サイクル増幅ライブラリDNA 2 µL、そして最後にPCRグレードの水 31 µLを加え、最終的に全量を50 µLにします。増幅させたライブラリテンプレートが1µLあたり1×10¹²コピー以上含まれている場合は、反応液に加えるコピー数が2×10¹²コピーを超えないよう、まずEBバッファーでテンプレートを希釈してください。PCRチューブを準備した後、サーモサイクラーにセットし、1回の反応サイクルに設定します。まず95°Cで12分間の変性を行い、続いて60°Cで1分間、さらに72°Cで5分間の一次伸長を行います。シングルサイクルが終了した後、次のステップまでPCR産物を保持するため、72°Cで維持します。非特異的なプライマーのアニーリングを回避し、直接キャプチャーを行うため、反応混合物がサーモサイクラー内で72°Cに保持されている間に、Qiagen UTE精製キットのPBIまたはPBバッファー150 µLをPCR反応チューブに分注します。これにより、ポリメラーゼを不活性化させると同時に、ターゲットプライマーの非特異的な伸長が起こらない高温状態を維持します。チューブを密閉して軽くボルテックスし、ベンチトップ遠心機で液を回収します。Qiagen PMバッファーなどの他の結合バッファーは、後続のキャプチャープロセスを妨げる可能性があるため、このステップではPBIまたはPBバッファーのみを使用してください。次に、PCRチューブから混合物を除去し、メーカーの指示に従って、以前に行った通りRogen MinLuスピンカラムに転送して精製します。MinLuキットに付属のEBバッファー30 µLを用いて、カラムからDNAを溶出させます。PECプライマーにアニールしなかったすべてのフラグメントを除去するため、ビーズを用いたキャプチャーステップを行います。まず、M 270 strip divide in beadsのストック溶液をボルテックスで再懸濁し、サンプル1つあたり25 µLに相当する量のビーズを分取します。ビーズを500 µLの2倍BW緩衝液で2回洗浄し、最初に分取したビーズ量と同量の2倍BW緩衝液で再懸濁します。この懸濁液を25 µL準備します。各サンプルについて、精製・溶出したDNA 25 µLをビーズ懸濁液 25 µLに加えます。残りの5 µLは後の定量用に保存しておきます。ピペッティングによる吸い上げと排出、およびパーペットチップでの撹拌によってDNAとビーズ懸濁液を混合し、その後、ベンチトップローテーターを用いて室温で15分間ゆっくりと回転させます。混合後、内容物を新しい1.5 mL PCRチューブに移します。前回の回転インキュベーション工程において、一部の非標的DNAがチューブ壁面に付着した可能性があります。そのため、ビーズ懸濁液を新しいチューブに移すことで、この非標的DNAが最終産物に放出される可能性を回避します。熱溶出工程では、磁性粒子コレクターを使用してビーズをペレット化します。10〜20秒後にはすべてのビーズが壁面に移動し、上清が透明になります。ビーズを洗浄するためにこの上清を除去し、1× BWバッファーを500 µLチューブに加え、低速で約3秒間ボルテックスします。チューブを立てた状態と逆さまにした状態の両方で、チューブ壁にビーズが付着していないことを確認します。卓上遠心機を用い、チューブ壁からすべての液体が流下するまで、1～3秒間短時間遠心します。チューブをMPCに戻し、すべてのビーズがチューブの側面に集まるまで10～20秒間待ちます。次に、上清を除去します。これで1回目の洗浄が完了しました。この手順を、最後に行う1回のBW洗浄および上清除去を含めて、さらに4回繰り返します。1倍濃度のホットウォッシュバッファーを500 µL加えます。前述と同様に、短時間のボルテックス処理とスピンダウンで懸濁液を混合し、その後、サーマルブロックシェーカーを用いて65 °C、1000 RPMで2分間チューブを振盪します。サーマルブロックから取り出した後、1分以内に短時間スピンダウンを行い、上清の残留物を除去します。この工程により、PECプライマーに結合しているがプライマー伸長ステップで伸長されなかった断片が除去されます。ペレットを30 µLのEBバッファーで再懸濁し、混合液を新しい1.5 mL PCRチューブに移します。チューブをサーマルサイクラーに入れ、95 °Cで3分間インキュベートします。磁性粒子コレクターを用いてビーズをペレット化します。上清が完全に透明になるまで10〜20秒かかります。その後、S上清を回収し、ラベルを貼った新しいチューブに移します。ビーズを移行させないように注意してください。捕捉されたDNA断片の産物が含まれている上清を回収します。ビーズはこの段階で廃棄できます。キャプチャした産物を増幅させるため、パート2と同様に、合計容量100 µLのPCRミックスを調製し、同じPCRサイクリング条件で実施します。再び、キャプチャした産物のPCR増幅が完了した後、セクション2で既に行ったようにQiagen Uteスピンカラムを用いて精製し、50 µLのEeb BufferでカラムからDNAを溶出させます。これで、産物をハイスループットシーケンシングに供することが可能です。私たちは、ネアンデルタール人のミトコンドリアゲノム全体をカバーするように、574本のPECプライマーを設計しました。これらを4つのマルチプレックスミックスに分け、ユーラシア大陸の4つの遺跡から出土した、40,000年から70,000年前のものと推定される5体のネアンデルタール人化石のライブラリに対して、プライマリーエクステンションキャプチャ（PEC）を2ラウンド連続で実施しました。これにより、個体あたり170,000から500,000の配列を生成し、その結果をミトコンドリアリファレンス配列にアラインメントしました。その結果、PECの手法によってミトコンドリアDNAが大幅に濃縮され、各個体のミトコンドリアDNA全域にわたって完全なカバレッジが達成され、平均カバレッジは18倍から56.3倍となりました。これらの結果に基づき、各個体について高品質な完全ミトコンドリアゲノム配列を構築することができました。次に、これらの配列を、現代の人類および我々に最も近い現生親縁種であるチンパンジーとボノボの世界的なサンプルと比較し、系統解析を行いました。これにより、ネアンデルタール人のミトコンドリアDNAは現代人と密接に関連しているものの、明確に区別されるという以前の知見が確認されました。さらに、ネアンデルタール人の配列同士を比較したところ、ネアンデルタール人の遺伝的多様性は極めて低く、現在の世界的な人類よりも低く、現代のヨーロッパ人と同様であることが明らかになりました。これらの証拠をネアンデルタール人配列におけるタンパク質進化の解析と組み合わせると、ネアンデルタール人は長期的に個体群サイズが小さかったことが示唆されます。これは、ネアンデルタール人の人口密度が、現代人が到達したレベルに一度も達しなかったとする考古学的証拠と一致しています。以上で、ハイスループットシーケンシングに向けて標的配列を増幅および回収するための、霊長類エクステンションキャプチャの実施方法について解説しました。この手順を行う際は、サーモサイクラーのすべての温度設定に従うことが重要ですが、プライマーによってアニーリング温度が異なる場合があるため、使用する特定のプライマーに合わせてアニーリング温度を調整する必要があることに注意してください。また、すべての洗浄ステップにおいて、可能な限り多くの液体を取り除くよう注意してください。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。

primer-extension-capture-targeted-sequence-retrieval-from-heavily

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

NGSシーケンシングのためのgDNA濃縮は、体質的突然変異の研究のための簡単で強力なツールです。この記事では、DNA損傷修復に関与する11個の遺伝子の完全な配列を簡単に解析する手順を紹介します。...

の全配列のNGS解析のためのトランスポゼースベースの技術によるgDNAのエンリッチメント BRCA1 BRCA2、およびDNA損傷修復に関与する遺伝子9

感染した細胞のゲノムDNAからレトロウイルス統合部位を増幅し、増幅されたウイルス-宿主ジャンクションを配列決定し、次にこれらの配列を参照ゲノムにマッピングするためのプロトコルを記述します。また、BEDToolsを使用して、さまざまなゲノムアノテーションに対する統合部位の分布を定量化する手法についても説明します。...

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

ここでは、メチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-seqのかMBD-seqの）技術とその後のバイオインフォマティクス解析パイプラインを使用して大規模な臨床患者スクリーニング研究におけるゲノムワイドDNAメチル化を調査するためのプロトコルを提示します。...

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

フローサイトメトリーとゲノムの後半の複製領域を識別する高スループット...

G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

本稿では葉緑体 ER 以下の低頻度の変異を検出するための手法を説明しますこのメソッドは、2 方向エラー訂正、特別なバック グラウンド...

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

次世代シーケンス (NGS)、プラットフォーム (~0.5–2.0%) の高い誤り率によって制限されるゲノム解析の強力なツールです。NGS のエラーレートを未然に防ぐし、バリアント アレル分 0.0001 のようにまれに突然変異を検出するエラー修正のシーケンスの我々...

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

遺伝子および調節配列の物理的な相互作用の同定が困難な染色体構造をキャプチャする方法によって促進されています。これは 4 C seq プロトコルを修正は PCR テンプレートが過大に増幅を最小限に抑えることによって PCR バイアスを軽減、追加制限の酵素のダイジェスト ステップを組み込むことによって読み取りの mappability...

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

本手法はホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)RNAサンプルから得ることができる配列データの質と量を改善するステップを説明する。我々は、FFPE-RNAサンプルの品質をより正確に評価し、シーケンシングライブラリを準備し、FFPE-RNAサンプルからのデータを分析するための方法論を説明する。...

分解されたFFPE-RNAサンプルのシーケンシングと分析の最適化

長さスケール全体で染色体コンフォメーションをキャプチャする

このプロトコルは、突然変異プロファイリング実験のために硫酸ジメチルでRNAを修飾するための指示を提供します。これには、2つの代替ライブラリ調製方法を使用したin vitro および in vivo...

硫酸ジメチルによるRNA構造のプロービング in vitro および細胞内でのシーケンシングによる突然変異プロファイリング(英語)

CRISPRのような技術に対する大きな障壁は、重要な遺伝子を破壊する可能性のあるオフターゲットイベントです。「Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by...

オフターゲット遺伝子編集の検討のためのCIRCLE-Seq

学ぶプライマー伸長キャプチャ法による古代DNAの標的配列取得法。ネアンデルタール人のミトコンドリアゲノム完全解読に応用し、集団遺伝学的多様性解析に貢献する技術です。

プライマー伸長キャプチャ：重縮退DNAソースからターゲットシーケンスの取得

さらに動画を探す