プライマー伸長キャプチャ：重縮退DNAソースからターゲットシーケンスの取得

このビデオでは、コピー数が極めて少なく高度に断片化したDNAソースから、標的となるDNA配列を回収することを可能にするプライマー伸長キャプチャー（PECA）法について解説します。我々はこの手法を用いて、4万年以上前のネアンデルタール人の骨から完全なミトコンドリアゲノムのシーケンシングを行いました。本法は、任意の小さな標的領域や一塩基多型（SNP）のキャプチャーに利用でき、多くの個体に対しても適用可能です。本手順の主なステップは、一次DNAライブラリーのPCR増幅、定量PCRによる増幅ライブラリーの定量、増幅ライブラリーに対する一次伸長の標的化、非標的断片を除去するための一次伸長産物のビーズキャプチャー、そしてキャプチャーおよび洗浄後の標的DNAの溶出とシーケンシングです。

こんにちは。私はライプツィヒにあるマックス・プランク進化人類学研究所遺伝学部のShanti Payable研究室のアドリアン・ブリッグスです。本日は、古代の骨のような、高度に分解された複雑なDNAソースから、目的の特定のDNA配列を単離する手順をご紹介します。私たちはこの手順を用いて、Homo neanderthalensis（ネアンデルタール人）のミトコンドリア遺伝的多様性の研究を行いました。

それでは始めましょう。本実験で使用するDNAは、ネアンデルタール人の地理的分布域全域の4つの遺跡で発見された、40,000年から70,000年前のネアンデルタール人の骨に由来します。まず、骨を一晩UVライトにさらし、表面に付着した外来DNAを除去して除染します。

微細ドリルを用いて100〜500 mgの骨粉を調製します。骨粉からのDNA抽出は、Nadine RocklandおよびMichael Hofが2007年の論文「comparison and optimization of ancient DNA extraction」で述べた手順に従って行います。次に、すべてのDNA断片の末端にユニバーサルアダプタープライミングサイトを付加することで、DNA抽出物をシーケンシングライブラリに変換します。これは、ネアンデルタール人の骨から作製された454ライブラリに含まれるDNA量が、時にはわずか数pgという極微量であるためです。この一次DNAライブラリを、まずユニバーサルライブラリプライマーに対応するエマルションPCRプライマーを用いてPCRで増幅させます。

ライブラリ増幅用のPCRミックスを調製するため、PCRチューブに以下の試薬を混合します。10 X GAMP PCRバッファー 10 µL、塩化マグネシウム 10 µL、BSA 2 µL、dNTPミックス 1 µL、4 54 MPCR forwardおよびreverseプライマーを各3 µL、AmpliGold DNAポリメラーゼ 1 µL、ライブラリテンプレート 25 µLを加えます。最後に、PCRグレードの水 45 µLを加え、最終容量を100 µLにします。AmpliTech Gold DNAポリメラーゼは室温で安定しているため、氷上での操作は不要です。

PCR反応液を調製した後、PCRチューブをサーモサイクラーにセットし、まず95 °Cで12分間の変性ステップを行い、続いて95 °Cで30秒、60 °Cで1分、72 °Cで1分のサイクルを14回繰り返します。これら14サイクルの最後に、72 °Cで5分間の最終ステップを設定します。PCR増幅完了後、使用するまでPCRチューブを10 °Cで不定期間保存することが可能です。その後、製造元の指示に従ってKyogen MinLuスピンカラムを用いてPCR産物を精製し、一次伸長および産物キャプチャーの前に、MinLuキット付属のEBバッファー50 µLでカラムからDNAを溶出させます。

増幅産物の量と品質を確認するため、未増幅ライブラリおよび増幅済みライブラリのアリコートを用いて定量PCRを行う必要があります。14サイクルの増幅済みライブラリには、一次ライブラリの数千倍のDNAが含まれているはずです。そうでない場合は、増幅条件を確認し、再度実施してください。

増幅済みライブラリーから目的の配列を捕捉するために使用する一次伸長キャプチャプライマーは、通常のPCRプライマーと同様に設計し、標的領域の5'末端に一致させます。融解温度は60 °Cが理想的であり、12塩基のテイル配列を含め、5'末端にビオチン残基を付加します。200 µMのストック溶液を用いて調製した単一のマルチプレックスミックスにおいて、最大150種類のPECプライマーを併用することが可能です。一次伸長反応では、適切なPCRチューブに、10X GAMP PCR buffer 5 µL、塩化マグネシウム 2.5 µL、BSA 1 µL、dNTP 0.5 µLを加えてPCRミックスを調製します。ここに、一次伸長キャプチャプライマーミックス 5 µL、Taq gold DNA polymerase 0.5 µL、14サイクル増幅済みのライブラリーDNA 2 µLを加え、最後にPCRグレードの水 31 µLを加えて、最終容量を50 µLにします。

増幅されたライブラリーテンプレートの濃度が1 µLあたり1 × 10¹²コピーを超える場合は、反応液に添加されるコピー数が2 × 10¹²コピーを超えないよう、あらかじめEBバッファーでテンプレートを希釈してください。PCRチューブを準備した後、サーモサイクラーにセットし、シングルランの反応条件を設定します。まず95 °Cで12分間の変性を行い、続いて60 °Cで1分間、さらに72 °Cで5分間の一次伸長反応を行います。

シングルサイクルが終了すると、次のステップまでPCR産物を保持するため72 °Cで維持します。非特異的なプライマーのアニーリングを回避し、直接キャプチャーするために、反応混合物がサーモサイクラー内で72 °Cに保持されている間に、Kyogen DNA purification kitのPBIまたはPBバッファー150 µLをPCR反応チューブに分注します。これにより、ポリメラーゼを不活性化させると同時に、ターゲットプライマーの非特異的な伸長が起こらないよう高温の状態を維持します。チューブを密閉し、短時間ボルテックスした後、ベンチトップ遠心機で液を回収してください。

Qiagen PM Bufferなどの他の結合バッファーは、後続のキャプチャ工程を妨げる可能性があるため、このステップではPBIまたはPBバッファーのみを使用してください。次に、PCRチューブから混合液を取り出し、製造元の指示に従ってRogen MinLuスピンカラムに移して精製し、MinLuキットに付属のEBバッファー 30 µLを用いてカラムからDNAを溶出させます。PECプライマーにアニーリングしなかったすべてのフラグメントを除去するために、ビーズベースのキャプチャ工程を行います。

まず、M 270 ストリップビーズのストック溶液をボルテックスで再懸濁し、サンプル1つあたり 25 µL に相当する量のビーズを分取します。ビーズを 500 µL の 2× BW バッファーで2回洗浄し、最初に分取したビーズと同容量の 2× BW で再懸濁します。この懸濁液を 25 µL 用意します。

各サンプルについて、精製・溶出したDNA 25 µLをビーズ懸濁液 25 µLに加え、残りの 5 µLは後の定量用に保存します。ピペッティングとペペットチップによる撹拌でDNAとビーズ懸濁液を混合し、その後、ベンチトップローテーターを用いて室温で15分間ゆっくりと回転させます。混合後、内容物を新しい 1.5 mL PCRチューブに移します。

前段階の回転インキュベーションステップにおいて、一部の非標的DNAがチューブ壁に付着した可能性があります。そのため、ビーズ懸濁液を新しいチューブに移すことで、これらの非標的DNAが最終産物に放出される可能性を回避します。加熱溶出ステップでは、磁性粒子コレクターを使用してビーズをペレット化します。10〜20秒後、すべてのビーズが壁側に移動し、上清が透明になります。この上清を除去してビーズを洗浄し、1×BWバッファー 500 µLをチューブに加え、低速で約3秒間ボルテックスします。

チューブを立てた状態および逆さまにした状態でそれぞれ確認し、チューブ壁にビーズが付着していないことを確かめます。卓上遠心機を用いて、チューブ壁からすべての液体が流れ落ちるまで、1〜3秒間懸濁液を遠心分離します。チューブをMPCに戻し、すべてのビーズがチューブの側面に集まるまで10〜20秒間待ちます。

次に、上清を除去します。これで1回目の洗浄が完了です。最後に1回のBW洗浄と上清除去を行った後、この手順をさらに4回繰り返します。

1倍濃度のホットウォッシュバッファーを500 µL加えます。前と同様に、短時間のボルテックス処理とスピンダウンを行って懸濁液を混合し、その後、サーマルブロックシェーカーを用いて65 °C、1000 RPMで2分間チューブを振盪します。サーマルブロックから取り出した後1分以内に、短時間のスピンダウンを行い、上清の残渣を除去します。このステップにより、PECプライマーに結合しているがプライマー伸長ステップで伸長しなかったフラグメントが除去されます。ペレットを30 µLのEBバッファーで再懸濁し、混合液を新しい1.5 mL PCRチューブに移します。

サーマルサイクラーを用い、チューブを95 °Cで3分間インキュベートします。磁気粒子コレクターでビーズをペレット化します。上清が完全に透明になるまで10〜20秒かかるはずです。その後、上清Sを回収し、ラベルを貼った新しいチューブに移します。

ビーズが混入しないように注意します。回収されたDNA断片を含む上清を回収してください。ビーズはこの段階で廃棄して構いません。

捕捉した産物を増幅させるため、パート2と同様に合計容量100 µLのPCRミックスを調製し、同じPCRサイクル条件で実施します。再度、捕捉した産物のPCR増幅が完了した後、セクション2で既に行った通り、Qiagen Uteスピンカラムを用いて精製を行い、50 µLのEeb BufferでカラムからDNAを溶出させます。これで、産物をハイスループットシーケンシングに使用できる状態になります。我々は、ネアンデルタール人のミトコンドリアゲノム全体をタイル状にカバーするように、574種類のPECプライマーを設計しました。

これらを4つのマルチプレックスミックスに分け、ユーラシア各地の4つの遺跡から出土した4万年から7万年前のものと推定される5体のネアンデルタール人化石のライブラリに対して、プライマリーエクステンションキャプチャー（PEC）を2回の連続ラウンドで実施しました。これにより、個体あたり170,000から500,000の配列を生成し、得られた結果をミトコンドリア参照配列にアラインメントしました。その結果、PECの手法によってミトコンドリアDNAが大幅に濃縮され、各個体のミトコンドリアDNA全体にわたって完全なカバレッジが達成され、平均カバレッジは18倍から56.3倍の間となりました。これらの結果に基づき、各個体について高品質な完全ミトコンドリアゲノム配列を生成することができました。

次に、これらの配列と、現代のヒトおよび最も近い現生親戚であるチンパンジーとボノボの全世界的なサンプルとの系統比較を行いました。これにより、ネアンデルタール人のミトコンドリアDNAは現代人のものと密接に関連しているものの、明らかに異なっているという previous findings が確認されました。さらに、ネアンデルタール人の配列同士の比較により、ネアンデルタール人の遺伝的多様性は極めて低く、今日の全世界的なヒトの間よりも低く、現代のヨーロッパ人と同様であることが明らかになりました。

これらの証拠をネアンデルタール人の配列におけるタンパク質進化の解析と組み合わせると、ネアンデルタール人は長期的に個体群サイズが小さかったことが示唆されます。これは、ネアンデルタール人の人口密度がホモ・サピエンスが到達したレベルに決して達しなかったことを示す考古学的証拠とも一致しています。ここまで、ハイスループットシーケンシングに向けた標的配列の増幅および捕捉を行うための、霊長類エクステンションキャプチャーの手法について解説しました。この手順を行う際は、サーモサイクラーのすべての温度指定に従うことが重要ですが、プライマーによってアニーリング温度が異なる場合があるため、使用する特定のプライマーに合わせてアニーリング温度を調整する必要があることに注意してください。また、すべての洗浄ステップにおいて、可能な限り多くの液体を取り除くよう注意してください。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。