組織工学のための3Dハイドロゲルの細胞のカプセル化
October 26th, 2009
我々は、合成ハイドロゲル内の細胞の3次元（3D）カプセル化するためのプロトコルを提示する。カプセル化手順は、次の2つの一般的に使用される架橋の方法（マイケル型の加算と光 - 開始フリーラジカル機構）だけでなく、カプセル化された細胞の挙動を評価するためのテクニックの数のために概説されています。
細胞をカプセル化するための段階的なプロセスは、ヒドロゲル型やその他の材料の調製と滅菌から始まり、続いて細胞を個々の集団に単離し、各ゲルセットのチューブに分離します。次に、細胞の存在下でイオン化を行い、その後、in vitroまたはin vivoのインキュベーション期間を行います。細胞挙動の下流解析には、生存率、形態、増殖、分化の試験が含まれる場合があります。
こんにちは、ペンシルベニア大学生物工学部のジェイソン・バーディック博士の研究室のアミディオ・カハン。本日は、組織工学のための3Dハイドロゲルへの細胞カプセル化の手順をご紹介します。この手順を使用して、カプセル化された細胞の挙動に対するヒドロゲルの組成と構造の影響を研究します。
それでは始めましょう。この手順を開始するには、PBS中のフォトイニシエーターエアキュア2 9 5 9またはI 2 9 5 9の0.5%重量溶液を調製します。混合し、摂氏37度の暗闇で2〜3日間インキュベートします。
準備ができたら、シリンジフィルターを使用して溶液を滅菌し、室温で保管します。次に、Microsoft Excelなどのスプレッドシートプログラムを使用して、必要なポリマーと架橋剤の量を計算します。こちらは、アクリレート反応基で官能基化されたヒアルロン酸です。
また、アミノ酸シスチン、アルギニン、グリシン、アスパラギン酸を含む機能性接着ドメインを含むペナントペプチドの量も計算します。シスチンはポリマーにテザリングするためのものです。ポリマー架橋剤とペントの必要量が決定されたので、それらを秤量し、それぞれをeinorチューブに入れます。
それに応じて計算スプレッドシートを調整します。得られたポリマーの実際の質量については、ゲル型の準備に進みます。カミソリの刃を使用して、個別に包装された滅菌の先端を切り取ります。
1ミリリットルの使い捨て注射器。写真パターンからゲル化に使用する型にフラットカットが施されていることを確認します。最後に、シリンジ型のEORチューブをキャップを開けた状態で、その他の必要な材料を生物学的安全キャビネットに組み込まれた殺菌光源の下に30分間置いて滅菌します。
滅菌が完了したら、実験装置の滅菌後に細胞の調製に進みます。フードで作業し、マイカルタイプの架橋に使用されるポリマーに滅菌TEAを、フリーラジカル架橋に使用されるポリマーに滅菌PBSを追加します。ペンダント部分とボルテックスに一致するバッファーを追加します。
ペンダント部分を溶解するには、ペプチド上のINE基からのチオールを介してアルキル化ヒアルロン酸に結合し、ペンダント部分をポリマーに結合させ、ポリマー溶液に添加してパラメータで密封します。簡単に言えば、ボルテックスし、摂氏37度で混合しながらインキュベートします。細胞を調製する際、ペンダント部分が付着している間に、ヒト間葉系幹細胞またはHMCをPBSで洗浄することにより、ヒト間葉系幹細胞またはHMCをカプセル化する細胞を調製する。
次に、室温で1分間トリプシンとインキュベートし、トリプシンを除去して37度でさらに5分間インキュベートします。次に、HMSC増殖培地を添加してトリプシンを中和し、プレートの表面から細胞を放出します。ヘモサイトメーターで細胞をカウントします。
カウントした細胞を、ゲルの各セットに適切な数を含む部分に分けます。1ミリリットルあたり1,000万個の細胞の密度で50マイクロリットルのゲルを3個セットにする場合、150万個の細胞を個々の円錐形のチューブに分離します。イオン化のタイミングのため、個々のセットに4つ以上のゲルを調製しないでください。
次に、細胞を500 RCFで6分間遠心分離します。室温で細胞がスピンダウンしている間に、mical edition架橋用の重合ミックスを調製します。架橋剤にバッファーを添加して、適切な濃度を達成します。
光開始フリーラジカル架橋のために、以前に調製したI 2 9 5 9溶液をポリマー溶液に加えます。全ゲルセット容量の10%で、最終開始剤濃度が0.05%の重量。これで、細胞と重合混合物をハイドロゲルにカプセル化する準備が整いました。
まず、遠心分離機の細胞からスナットを吸引します。最初の吸引後に液体が沈殿するのを待ち、再吸引して、細胞ペレットのResusを中断することなく、できるだけ多くの培地を除去します。セルペレットをポリマー溶液で懸濁させ、気泡を防ぎます。
溶液を約10回ゆっくりと上下させますが、これは細胞を均等に分布させるのに十分であるはずです。マイカルタイプの付加反応では、幅の広いオリフィスピペットチップを使用して、ポリマーセルに適切な量の架橋剤溶液を添加します。ピペットを希望の個々のゲル容量に設定します。
溶液を上下にピペットで動かして均質化し、Eloquaをシリンジチップ型に注入します。ステップを迅速に実行して、細胞の均一な分布を確保し、架橋のために培養フード内で10〜30分間インキュベーションできるようにします。光がフリーラジカル架橋を開始した場合。
適切な量をシリンジチップ型に分注します。シリンジをUV光にさらして、365ナノメートルに10分間露光してラジカル架橋します。4ミリワット/センチメートル四方のUV光は、ACRL官能基化ポリマーに一般的です。
このステップを迅速に実行して、UV光にさらされる前に細胞が沈降するのを最小限に抑えます。架橋後、ゲルを培地を含む組織培養プレートのウェルに注入し、インキュベーションと分析を行います。ハイドロゲルの架橋も逐次行うことができます。
まず、官能基化色素メトール化反芻液をゲル中の最終濃度20ナノモルまで添加します。この色素は、ゲルの根本的に架橋された領域に優先的に組み込まれるため、パターニングを視覚化するのに役立ちます。次に、マイク型重合反応から始め、以下の理論上の架橋の一部が得られます。
フリーラジカル架橋は、Adobe PhotoshopやIllustratorなどのプログラムで設計され、透明マスクに直接印刷されたマスクを使用する必要があります。マスクの寸法は、丸いシリンジの上部と一致する必要があります。滅菌したピンセットを使用して、滅菌マスクをゲル表面に直接適用し、光を当ててゲルを架橋します。
さらに、ここには、カプセル化の1時間後にHAベースのハイドロゲル内のHMCが示されています。合成されたハイドロゲルは通常透明であるため、光学顕微鏡を使用して細胞の形態を視覚化できます。同じ細胞を、蛍光生死染色キットを使用して、カプセル化の24時間後に生存率を視覚化しました。
カルシウムMを使用して生細胞を検出し、死細胞のアテリウムホモダイマーを検出し、95%を超える生存率を観察しました。また、alamar blueアッセイを使用して、細胞がアッセイ試薬をどれだけうまく代謝し、色の変化をもたらすかによって測定される細胞増殖レベルを決定しました。細胞染色は、H HMCsに対して、分解性および接着性のHAベースのハイドロゲル内にカプセル化してから7日後に、標準的な固定および透過性手順を用いて行いました。
細胞のアクトンは、フルオレセイン標識フィンとdpiで拘束された核を使用して見ることができます。カリンに対する免疫染色は、ハイドロゲルマトリックス内の焦点接着の可視化に使用されます。組織学的染色は、脱水、パラフィン包埋、および標準プロトコールの根重合HMSCカプセル化HAハイドロゲルを用いたハイドロゲルの切片化後に行われます。
培養後1週間後、核にヘマットトインをマーキングし、結合組織AをマーキングするASINとグリコサミノグリカンの青色染色で染色した。リアルタイム。PCRは、カプセル化された幹細胞の分化を定量化するために使用されます バックグラウンドを差し引いた後、目的の遺伝子の発現レベルは、蛍光が閾値に達したサイクル数と、恒常的に活性なハウスキーピング遺伝子である受動参照シグナルによって決定されます。そこで、細胞を3Dハイドロゲルにカプセル化し、ゲル内の細胞の挙動を研究する方法を紹介しました。
これらの手順を使用する場合は、滅菌緩衝液と試薬を長期間保存するか、殺菌UVランプで滅菌することにより、完全な無菌材料を確保することが重要です。というわけで、これだけです。洗ってくれてありがとう、そしてあなたの実験に頑張ってください。
概要
この記事では、合成ハイドロゲル内で細胞を3D封入するためのプロトコルを提示し、架橋と細胞挙動の評価方法を詳述します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- バイオエンジニアリング
- 組織工学
背景
- 3D細胞封入は組織工学応用にとって重要です。
- ハイドロゲルは細胞の成長と分化のための支持環境を提供します。
- 異なる架橋方法が細胞挙動に影響を与える可能性があります。
- これらの方法を理解することで組織工学戦略を強化できます。
研究目的
- ハイドロゲル内で細胞を封入する手順を概説すること。
- 異なる架橋技術を比較すること。
- 様々な条件下での封入細胞の挙動を評価すること。
使用した方法
- ハイドロゲルモールドの準備と滅菌。
- 細胞集団の分離と準備。
- ミカエル型付加と光起始ラジカル機構を用いた架橋。
- 細胞生存率、形態、増殖、分化のダウンストリーム分析。
主要な結果
- ハイドロゲル内での細胞の封入に成功しました。
- 異なる架橋方法が細胞挙動に影響を与えました。
- 封入細胞の生存率と形態を評価しました。
- ハイドロゲルの組成と構造が結果に影響を与えることが示されました。
結論
- 確立したプロトコルは様々な組織工学応用に使用できます。
- 架橋効果の理解は細胞挙動の最適化に不可欠です。
- 将来の研究はこれらの知見に基づいて組織工学技術を強化できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
3D hydrogel encapsulation enables physiologically relevant cell culture models that improve predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. By mimicking native tissue microenvironments, this approach supports more translatable assessments of stem cell behavior, differentiation, and response to bioactive cues. It addresses a key discovery-stage challenge: reducing biological ambiguity when evaluating therapeutic candidates in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a tissue-like 3D context that better reflects in vivo conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation by allowing observation of cellular phenotype, viability, and differentiation under controlled matrix properties.
- Predictive Value: Improves confidence in lead identification by linking hydrogel composition to stem cell behavior and lineage specification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for preparing validated biological systems suitable for downstream compound screening.
- Operational Value: Enables quantitative readouts such as proliferation (via Alamar Blue), viability (live/dead staining), and morphology, supporting assay reproducibility.
- Platform Utility: Compatible with multiple crosslinking mechanisms (Michael-type addition, free radical) and polymer types (e.g., hyaluronic acid, PEG), allowing assay adaptation across target classes.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains biological relevance from discovery through preclinical validation by preserving stem cell multipotency and differentiation capacity in degradable, adhesive hydrogels.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of cellular behavior over time (e.g., one-week culture) to inform go/no-go decisions based on matrix-mediated effects on proliferation and lineage commitment.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development through immunostaining of focal adhesions (e.g., vinculin) and histological analysis of glycosaminoglycan deposition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for modalities requiring assessment of cell-matrix interactions and differentiation potential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled study of how hydrogel structure influences stem cell fate and mechanotransduction.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible 3D cultures with quantifiable outputs for viability, proliferation, and morphological analysis.
- Analytics: Generates measurable readouts including gene expression (via qPCR), protein localization (immunostaining), and metabolic activity, facilitating comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work through degradation-adaptive hydrogels and extracellular matrix-like cues that model tissue remodeling.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, modular capability applicable across multiple projects in regenerative medicine, disease modeling, and mechanistic screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in stem cell responses to biomaterial cues.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined sterilization, crosslinking, and cell encapsulation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing earlier, more physiologically relevant functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on their performance in tissue-mimetic environments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique, hydrogel chemistry, and stem cell culture.
- Depends on access to UV light sources for photoinitiated crosslinking and standard tissue culture equipment.
- Necessitates cross-team standardization of hydrogel formulation and cell preparation protocols.
- Involves adaptation considerations when transferring across different stem cell types or polymer backbones.
- Includes practical limitations such as gel settling timing constraints and the need for rapid processing to ensure uniform crosslinking.
