組織工学のための3Dハイドロゲルの細胞のカプセル化

細胞を封入するための段階的なプロセスは、ハイドロゲル型およびその他の材料の準備と滅菌から始まり、続いて細胞を個別の集団に分離し、各ゲルセット用のチューブに分注します。その後、細胞の存在下でゲル化を行い、続いてin vitroまたはin vivoでの培養期間を設けます。細胞挙動のダウンストリーム解析には、生存率、形態、増殖、および分化の試験が含まれます。

ペンシルベニア大学バイオエンジニアリング学科のJason Burdick博士の研究室から、Amidio Kahanです。本日は、組織工学における3Dハイドロゲルへの細胞封入の手順について解説します。私たちは、ハイドロゲルの組成や構造が封入された細胞の挙動に及ぼす影響を研究するために、この手順を用いています。

それでは、手順を開始しましょう。まず、光開始剤 Irgona 2959（I 2959）をPBSで0.5% (w/v) 溶液として調製します。混合後、37 °Cの暗所で2〜3日間インキュベートします。

準備ができたら、シリンジフィルターを用いて溶液を滅菌し、室温で保存します。次に、Microsoft Excelなどの表計算ソフトを使用して、提示されたポリマーと架橋剤の必要量を算出します。ここでは、アクリレート反応基で機能化されたヒアルロン酸を使用します。

また、アミノ酸としてシステイン、アルギニン、グリシン、およびアスパラギン酸を含む、機能性接着ドメイン含有ペナントペプチドの量を算出します。システインはポリマーへの繋ぎ止めに使用されます。ポリマー架橋剤とペプチドの必要量が決定したら、それぞれを秤量し、エッペンドルフチューブに入れます。

計算用スプレッドシートを適宜調整してください。得られたポリマーの実際の質量を確認し、「ゲルの型を準備する」へ進みます。カッターナイフを使用して、個別に包装された滅菌済みのチップの先端を切り取ります。

1 mL使い捨て注射器。フォトパターニングゲルに使用する型として、平坦にカットされていることを確認してください。最後に、キャップを開けた状態で注射器の型およびEORチューブと、その他必要な器具を、生物学的安全キャビネットに内蔵された殺菌灯の下に30分間置き、滅菌します。

滅菌が完了したら、実験器具の滅菌後、細胞の調製に進みます。フード内で作業を行い、マイケル型架橋に使用するポリマーに滅菌済みのTEAを、ラジカル架橋に使用するポリマーに滅菌済みのPBSを加えます。ペンダント部位のチューブに適合するバッファーを加え、ボルテックスします。

ペプチド上のINE基のチオールを介して、ペンダント部位をアルキル化ヒアルロン酸に結合させ、ポリマーにペンダント部位を付着させるため、これをポリマー溶液に加え、パラフィルムで密閉します。簡潔に述べると、ボルテックスミキサーで攪拌し、37 °Cで混合しながらインキュベートします。ペンダント部位の付着を待つ間に、封入させる細胞（ヒト間葉系幹細胞またはHMC）をPBSで洗浄して準備します。

次に、室温で1分間トリプシンとともにインキュベートし、トリプシンを除去した後、37°Cでさらに5分間インキュベートします。その後、HMSC増殖培地を加えてトリプシンを中和し、プレート表面から細胞を遊離させます。血球計数計を用いて細胞数をカウントします。

カウントした細胞を、各ゲルセットに必要な数に分けて分注します。10 million cells/mLの密度で50 µLのゲルを3枚作成する場合、1.5 million cellsを個別のコニカルチューブに分注してください。処理時間の都合上、1セットあたり4枚を超えるゲルを準備しないでください。

次に、細胞を 500 RCF で6分間遠心分離します。細胞の沈降を待つ間、室温でmical edition架橋用の重合ミックスを調製します。架橋剤にバッファーを加え、適切な濃度にします。

光開始自由基架橋を行うため、あらかじめ調製したI 2 9 5 9溶液をポリマー溶液に添加します。最終的な開始剤濃度が0.05%重量となるよう、全ゲル設定量の10%を添加してください。これで、細胞と重合混合液をハイドロゲルに封入する準備が整いました。

まず、遠心分離した細胞から上清を吸引します。最初の吸引後、液体が落ち着くまで待ち、細胞ペレットを乱さないようにして可能な限り多くの培地を再度吸引して除去します。気泡が入らないように注意しながら、ポリマー溶液で細胞ペレットを再懸濁します。

溶液をゆっくりと10回ほどピペッティングします。これにより細胞を均一に分散させることができます。mical型の添加反応では、孔径の大きいピペットチップを使用して、適切な量の架橋剤溶液をポリマーセルに加えます。混合します。ピペットを希望する個々のゲル量に設定してください。

溶液をピペッティングして均質化し、シリンジチップ型に注入します。細胞を均一に分散させるため、この操作は迅速に行い、架橋させるために培養フード内で10〜30分間インキュベートします。光開始自由基架橋については以下の通りです。

適切な量をシリンジチップ型に分注します。ラジカル架橋のため、シリンジを365 nmのUV光に10分間照射します。ACRL機能化ポリマーには、4 mW/cm²のUV光が一般的に用いられます。

UV照射前に細胞が沈降するのを最小限に抑えるため、このステップは速やかに行ってください。架橋後、ゲルの入ったウェルを、培養および解析用の培地が入った組織培養プレートに移します。ハイドロゲルの架橋は、逐次的に行うことも可能です。

まず、機能化染料のメトキシ化ルミンを、ゲル内で最終濃度が20 nanomolarになるように添加します。この染料は、ゲルのラジカル架橋領域に優先的に組み込まれるため、パターニングの可視化に役立ちます。次に、以下について、理論的な架橋密度の数分の一となるマイクロタイプ重合反応を開始します。

フリーラジカル架橋を行うには、Adobe PhotoshopやIllustratorなどのプログラムで設計し、透明フィルムに直接印刷したマスクを使用する必要があります。マスクの寸法は、円形のシリンジ上部と一致していなければなりません。滅菌済みのピンセットを使用して、滅菌済みマスクをゲルの表面に直接適用し、光を照射してゲルを架橋させます。

ここでは、封入から1時間後のHAベースのハイドロゲル内におけるHMCを示しています。合成されたハイドロゲルは通常透明であるため、光学顕微鏡を用いて細胞の形態を観察することが可能です。また、封入から24時間後の同細胞について、蛍光生存死染色キットを用いて生存率を可視化しました。

生細胞の検出にはカルシウム M を、死細胞の検出にはアテリウム・ホモダイマーを用い、95%以上の生存率を確認しました。また、細胞の代謝能による試薬の色の変化を測定するアラマーブルーアッセイを用いて、細胞増殖レベルを判定しました。細胞染色および固定・透過処理は、分解性および接着性を有する HA ベースのハイドロゲルに封入してから 7 日後の H HMCs に対して、標準的な手順で実施しました。

フルオレセイン標識 phalloidin を用いて細胞のアクチンを、DPIを用いて核を可視化します。ハイドロゲルマトリックス内の焦点接着を可視化するために、cullin に対する免疫染色を行います。脱水、パラフィン包埋、および標準的なプロトコルに従ったハイドロゲルの切片作成後、ラジカル重合させた HMSC 封入 HA ハイドロゲルの組織学的染色を行います。

培養して1週間後、核を染めるヘマトキシリン、結合組織を染めるASIN、およびグリコサミノグリカンを染める青色染料で染色しました。カプセル化された幹細胞の分化を定量化するために、リアルタイムPCRを用います。バックグラウンドを差し引いた後、目的遺伝子の発現レベルは、構成的に活性なハウスキーピング遺伝子である受動的なリファレンスシグナルと比較して、閾値蛍光に達したサイクル数によって決定されます。以上で、3Dハイドロゲルへの細胞のカプセル化方法と、ゲル内における細胞の挙動の研究方法について説明しました。

これらの手順を実施する際は、滅菌バッファー溶液や試薬を長期保存するか、殺菌用UVランプで滅菌し、材料の完全な無菌性を確保することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。