Name: ザリガニ開閉筋肉のNMJにおいて歴史的なビューと生理学のデモンストレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 学ぶザリガニ開閉筋肉の神経筋接合部におけるシナプス生理と可塑性の研究方法。焦点マクロパッチ電極を用いた電気生理学的記録により、シナプス伝達効率を測定し、神経筋機能の理解を深める。

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ザリガニ開閉筋肉のnmjにおいて歴史的なビューと生理学のデモンストレーション

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

ここでは、甲殻類のオープナー神経筋（NMJ）の準備で作成したキーの重要な発見のいくつかを提示し、このモデルの準備から学ぶことがまだたくさんあることを示しています。このNMJはまだプレとポストシナプス機能と可塑性についての質問に対処するための豊富な遊び場を提供している理由でも、今日の歴史を理解することで1つは理解することができる。細胞内の端末へのアクセスだけでなく、細胞外電気生理学とイメージングの可能性と使いやすさは大きな利点です。高と低出力端末の小胞動態と融合の変調の背後にあるメカニズムは、調査のために懇願されています。製剤は、短期的なファシリテーションの間に例のカルシウム動態については、シナプス機能の理論的なモデルで重要な変数を調べるために、計算の評価と操作のためにテスト可能なモデルシステムを提供しています。アクティブゾーンと量子的放出の統計的性質のシナプスの複雑さはまた、両方の実験とコンピューター計算で将来の調査のためのオープンエリアです。

ザリガニの脚のオープナーの筋肉は、筋肉の表現型、シナプス生理学と可塑性におけるその歴史的重要性と実験的な汎用性のために提示されます。

ザリガニ開閉筋肉のNMJにおいて歴史的なビューと生理学のデモンストレーション

ここでは、甲殻類の神経筋接合部（NMJ）標本を用いてなされた重要な発見のいくつかについて述べ、...があることを示します。

動物から自動的に分離されたザリガニの歩行脚から、開開筋（opener muscles）を採取します。筋肉が露出すると、さまざまな染色手順によって神経支配パターンを明らかにすることができます。短期的な促進（short-term facilitation）の形態によるシナプス応答を、この筋肉から容易に記録することが可能です。焦点化マクロパッチ電極を、神経末端に沿って特定された静脈瘤（varicosities）の直上に配置できます。その後、シナプス応答を記録することで、末端の特定位置におけるシナプス効率を質的に測定することが可能です。こんにちは、ケンタッキー大学生物学部のRobin Cooper博士の研究室のAnn Cooperです。こんにちは、ロビン・クーパーです。私と学生が、ザリガニの開口筋を解剖し、異なる刺激パラダイムを用いてシナプス応答を記録する方法を解説します。私たちの研究室では、これらの手順を用いて、シナプス伝達効率およびシナプスの超微細構造と機能の関係について研究しています。それでは始めていきましょう。1879年、動物学者のT.H.ハクスリーは『ザ・クレイフィッシュ（The Crayfish）』という本を執筆しました。この本は、この甲殻類の生活史、解剖学、および生理学に関する包括的なガイドとして今日でも高く評価されています。歴史上のこの時期、ザリガニの脚にある開筋（opener muscle）の革新的な特性が明らかにされつつあり、ザリガニの筋肉を用いた生理学的研究がすでに進められていました。実際、ザリガニを用いた実験は、神経筋接合部（NMJ）における促進現象を実証した最初のものであった可能性があります。Riche博士は、医学生に筋肉の機能について教えるために使用した医学教科書の中で、自身の主要な研究成果を発表しました。その後数十年にわたり、ザリガニのNMJの張力発生と解剖学的構造に関する解剖学的および生理学的な記述が行われました。1961年、DoodleとKlerはザリガニの開筋において促通（facilitation）を実証し、シナプス前抑制の現象を初めて示し、シナプス伝達の定量的性質について報告しました。1971年、ShermanとEdwardはこの神経筋接合部（NMJ）において、ザリガニの開筋NMJが長期促通（LTF）を示すという画期的な発見をしました。これは、短期促通（STF）に加えて認められる現象です。この時期以降、多くの研究者がザリガニの開口筋神経筋接合部（NMJ）を用いて、細胞メカニズムを研究するために短期促進（SDF）および長期促進（LTF）の特性に着目しました。今日においても、ザリガニの開口筋標本は、他の多くの標本と比較してアクセスが容易で非常に堅牢であるため、シナプス伝達の基礎研究に引き続き利用されています。解剖のためにザリガニの脚を採取するシナプス標本作製では、体長6から10 cmのザリガニの等脚類節を強くつまむことで、第1または第2歩脚の自切を誘発させます。この手順では、保持タンクに戻されたザリガニを殺すことはありません。ザリガニの脚をティッシュペーパーの上に置き、顕微鏡のステージに載せます。脚を回転させ、外側が上を向くようにします。通常、アーチ状になった側を上にします。鋭いカミソリの刃を使用して、キューティクルを切り抜けるまでエッチングします。このパターンでは、髄莢（ずいきょう）から銅莢（どうきょう）の関節にかけて背側から腹側へ切る際、遠位側まで切りすぎないよう注意してください。キューティクルはそのままにしておきます。カミソリのメスを用いて、適切な部位のキューティクルを、片側の適切なセグメントに沿って、切り込む直前までこのパターンでエッチングします。その後、反対側でも同様に繰り返し、開閉筋（opener muscle）を切断しないよう近位側の切り口を接合させます。この際、刃を閉鎖筋（closer muscle）側に傾けてください。キューティクルを切断する際は、一旦キューティクルをそのままにしておきます。次に、底面に1 cm厚のシルガードコーティングを施した解剖皿に入れ、脚をザリガニ生理食塩水に浸します。精細ピンセットを用いて、肢節に作成したウィンドウの切り込み内にある背側神経索の角にピンを刺し、標本を固定します。遠位端からクチクラをわずかに持ち上げ、カミソリを用いて屈筋線維を遠位から近位に向かってクチクラから切り離します。次に、クチクラのウィンドウを持ち上げて取り除きます。クチクラを取り除いたら、脚の空洞から腱を慎重に引き出し、meiteとCARiteの関節部分でAEMを切断します。この際、腱のみを切断し、腱の内側にある主脚神経を切断しないよう注意してください。ピンセットで切断した腱の部分をつまみ、コード状に持ち上げて屈筋を引き離します。これで、主脚神経と伸筋が露出します。適切な食事セグメントに進み、適切な食事から指脂質部位関節にかけて切断します。適切な食事の腹側セグメントを、後下方へ四分の一回転させるように引き下げ、コード領域に付着している筋肉が見えるようにします。これらの筋肉をカミソリで切断します。開閉筋に向かう運動神経枝を切断しないよう注意してください。開開筋が生理食塩水にさらされた状態になります。脚神経束に通常2つの分離した神経束が含まれている、meiteセグメントの最もcordalな領域に戻ります。細い鋏を用いて、背側の神経束を切断します。次に、ピンセットで切断端をつまみ、meiteセグメントの長さの約半分に達するまで遠位方向にゆっくりと引きます。この長い神経分枝には興奮性開閉神経が含まれています。一方、より大きな神経束には開閉筋の抑制性運動ニューロンが含まれています。解剖標本のmeite節を、昆虫ピンをmeiteの背面から刺し通せるように斜めに切断します。これにより、開筋の腹側が上を向き、観察者の方を向くようになります。次に、開筋の視界を遮っている閉筋の残留繊維を取り除きます。繊維をクチクラに押し付け、空洞の外へ出すことで、開筋に沿って走り指節脂質へと続く主脚神経を、精密ピンセットで慎重に引き上げ、切断することができます。これで、妨げとなる組織がない状態で開筋が露出します。興奮性突起後電位（EPSP）を記録するための細胞内電極または局所マクロパッチ電極を用いるため、プラスチック吸引電極を備えた記録室に開筋標本を設置します。刺激電極をチャンバーに組み込むことで、マイクロマニピュレーターを使用して刺激電極を配置し、記録ディッシュ内の標本をピンで固定し、興奮性神経を含む神経分枝を吸引電極に配置する手間を省くことができます。開口筋は、遠位、中央、近位の3つの一般的な領域に分けられます。開口筋全体は単一の運動ニューロンによって支配されていますが、神経筋接合部（nj）は構造的に異なり、シナプス伝達効率に領域固有の差があります。調製例間での一貫性を確保するため、最も遠位の線維は容易に区別できるため、本デモンストレーションでは誘発反応を導き出すために遠位領域を使用します。興奮性軸索は、grass 88 スティミュレーターを用いて選択的に刺激します。開眼筋の遠位領域に、3 M 塩化カリウムを満たした鋭利な細胞内電極を刺入します。細胞内EPSPの記録には、Axon Clamp 2BアンプおよびAxon XLヘッドステージを使用します。刺激条件を変化させることで、短期促通（STF）やその他のさまざまな種類の応答を得ることができます。STFは、興奮性神経に10または20回のパルスを、それぞれ10または22msの間隔で連続的に与えることで得られます。刺激列内の刺激頻度は変更可能です。Grass刺激装置の出力は、プラスチック製吸引電極内の銀線に接続された刺激絶縁ユニットに接続します。リード線はバス浴中の銀線に取り付け、神経終末の特定領域の直上から局所的なクオリEPSPを直接記録します。まず、生存蛍光染料のfour dye two Aを用いてシナプス静脈瘤を可視化します。ここでは、チクガラス製のmacro patch記録電極を使用します。電極のルーメンを生理食塩水バス溶液で満たし、蛍光顕微鏡下で、macro patch記録電極のルーメンを単離された単一の静脈瘤の直上に配置して、神経末端を誘発させます。興奮性運動神経は、先に示した方法で刺激します。電極のルーメンをゆっくりと下げ、また上げることで、可視化された静脈瘤の連なりに沿って、自発的な反応および誘発的なqual反応を記録することができます。低頻度の刺激を用いた各誘発反応では、個々の静脈瘤におけるqualイベントの直接カウントが可能です。一連の反応について、qualイベントの数を決定することができます。合計のqualイベント数をカウントし、これらの直接カウントに基づいて平均qualコンテンツを推定します。平均qualコンテンツを算出する方法の一つは、刺激中の誘発されたqualイベントのタイプの総数を、以下の式を用いて刺激試行の総数で割ることです。ここでは、40 hertzで30パルス刺激する一連の反復試行を示しています。刺激を60 hertzに増加させた場合の各ランの促通および平均応答を確認してください。1 hertzで刺激し、静脈瘤上の焦点電極で記録した際に、より顕著な促通が観察されます。誘発されたqal応答が観察されます。ザリガニの開閉筋を摘出し、さまざまな刺激パラダイムおよび手法を用いてシナプス応答を記録する方法について解説しました。これらの手順を行う際は、ニューロンを丁寧に扱い、強く引っ張ったり挟んだりしないよう注意することが重要です。また、可視化した静脈瘤（varicosities）にフォーカル・マクロパッチ電極を配置する際は、電極を静脈瘤に軽く接触させ、その後すぐに離すようにしてください。もう一点注意すべき点は、水銀灯への曝露時間を長くしすぎないことです。長時間曝露すると、神経終末にダメージを与える可能性があります。以上になります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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