Name: 幼虫のモニタリングの心機能キイロショウジョウバエ生理学的研究のための (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-16T17:02:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学ぶキイロショウジョウバエ幼虫の心機能モニタリング手法。無拘束観察、接着固定、解剖標本の作製、電気刺激、膜電位記録などの技術を用いて、心拍数測定とイオンチャネル機能解析を行う生理学研究手法です。

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生物学の部門でのG.のリブルフェローシップ、ケンタッキー州若手研究者と学部教育=ユリーカで提供される資金調達！事務所（ケンタッキー大）。

<ol><li>Ashton, K., Wagoner, A. P., Carrillo, R., Gibson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+for+the+monoamine-related+traits+heart+rate+and+headless+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci for the monoamine-related traits heart rate and headless behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157, 283-294 (2001).</li>
<li>Azpiazu, N., Frasch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinman+and+Bagpipe%3A+Two+homeo+box+genes+that+determine+cell+fates+in+the+dorsal+mesoderm+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Tinman and Bagpipe: Two homeo box genes that determine cell fates in the dorsal mesoderm of Drosophila.</a> Genes & Development. 7, 1325-1340 (1993).</li>
<li>Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological+and+behavioral+effects+of+carbon+dioxide+on+Drosophila+melanogaster+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A+Mol+Integr+Physiol%22%5BJournal%5D)">The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 140, 363-376 (2005).</li>
<li>Baker, J. D., McNabb, S. L., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hormonal+coordination+of+behavior+and+physiology+at+adult+ecdysis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The hormonal coordination of behavior and physiology at adult ecdysis in Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 202, 3037-3048 (1999).</li>
<li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+an+emerging+model+for+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342, 1-11 (2004).</li>
<li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+tinman+is+required+for+specification+of+the+heart+and+visceral+muscles+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila.</a> Development. 118, 719-729 (1993).</li>
<li>Bodmer, R., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+homeobox-containing+gene%2C+msh-2%2C+is+transiently+expressed+early+during+mesoderm+formation+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new homeobox-containing gene, msh-2, is transiently expressed early during mesoderm formation of Drosophila.</a> Development. 110, 661-669 (1990).</li>
<li>Cooper, A. S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+activity+of+Drosophila+larvae%3A+Impedance+%26+video+microscopy+measures%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Information+Service%22%5BJournal%5D)">Monitoring activity of Drosophila larvae: Impedance & video microscopy measures.</a> Drosophila Information Service. 87, 85-87 (2004).</li>
<li>Dasari, S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+influence+of+serotonin+on+the+larval+heart+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+B%22%5BJournal%5D)">Direct influence of serotonin on the larval heart of Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Physiol. B. 176, 349-357 (2006).</li>
<li>Dasari, S., Viele, K., Turner, A. C., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+p-CPA+and+MDMA+on+physiology%2C+development+and+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22European+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Influence of p-CPA and MDMA on physiology, development and behavior in Drosophila melanogaster.</a> European J. Neurosci. 26, 424-438 (2007).</li>
<li>Dowse, H., Ringo, J., Power, J., Johnson, E., Kinney, K., White, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+congenital+heart+defect+in+Drosophila+caused+by+an+action-potential+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A congenital heart defect in Drosophila caused by an action-potential mutation.</a> J. Neurogenetics. 10, 153-168 (1995).</li>
<li>Dulcis, D., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+innervation+of+the+heart+initiates+retrograde+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster.</a> J. Neurosci. 25, 271-280 (2005).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J. Neurogenetics. 18, 377-402 (2004).</li>
<li>Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+ion+channel+dysfunction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of ion channel dysfunction in Drosophila.</a> Kidney International. 3, 766-771 (2000).</li>
<li>GG, G. u <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+analysis+of+heartbeat+in%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila.+J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological analysis of heartbeat in.</a> Drosophila. J. Neurobiol. 28, 269-280 (1995).</li>
<li>He, B., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+in+the+development+of+the+Drosophila+arista%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms in the development of the Drosophila arista.</a> Mechanisms of Development. 104, 69-78 (2001).</li>
<li>Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Drosophila+heartbeat+by+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+B%22%5BJournal%5D)">Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters.</a> J. Comp. Physiol. B. 167, 89-97 (1997).</li>
<li>Johnson, E., Ringo, J., Bray, N., Dowse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+pharmacological+identification+of+ion+channels+central+to+the+Drosophila+cardiac+pacemaker%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and pharmacological identification of ion channels central to the Drosophila cardiac pacemaker.</a> J. Neurogenetics. 12, 1-24 (1998).</li>
<li>Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+and+heterologous+neuropeptides+are+cardioactive+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Native and heterologous neuropeptides are cardioactive in Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 1, 1229-1236 (2000).</li>
<li>Johnson, E., Sherry, T., Ringo, J., Dowse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+cardiac+pacemaker+of+Drosophila%3A+cellular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+B%2C+Biochem.%2C+Systemic%2C+Environmental+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of the cardiac pacemaker of Drosophila: cellular mechanisms.</a> J. Comp. Physiol. B, Biochem., Systemic, Environmental Physiol. 172, 227-236 (2002).</li>
<li>Lewis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+standard+food+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Inform.+Serv%22%5BJournal%5D)">A new standard food medium.</a> Drosophila Inform. Serv. 34, 117-117 (1960).</li>
<li>Miller, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+circulation+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22General+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Control of circulation in insects.</a> General Pharmacol. 29, 23-38 (1997).</li>
<li>Molina, M. R., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ostia%2C+the+inflow+tracts+of+the+Drosophila+heart%2C+develop+from+a+genetically+distinct+subset+of+cardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells.</a> Mechanisms of Development. 118, 51-59 (2001).</li>
<li>Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMuller%2C+KJ+%22Neurobiology+of+the+Leech%22">Neurobiology of the Leech</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. 254-254 (1981).</li>
<li>Nichols, R., Kaminski, S., Walling, E., Zornik, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+the+activity+of+a+cardioacceleratory+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Regulating the activity of a cardioacceleratory peptide.</a> Peptides. 20, 1153-1158 (1999).</li>
<li>Ocorr, K., Akasaka, T., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+cardiac+disease+model+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Age-related cardiac disease model of Drosophila.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 128, 112-116 (2007a).</li>
<li>Ocorr, K. A., Crawley, T., Gibson, G., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+for+cardiac+dysfunction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genetic variation for cardiac dysfunction in Drosophila.</a> PLoS ONE. 2, e601-e601 (2007).</li>
<li>Papaefthmiou, C., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+method+for+recording+the+electrical+activity+of+the+isolated+heart+of+the+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biol.+Animal%22%5BJournal%5D)">An in vitro method for recording the electrical activity of the isolated heart of the adult Drosophila melanogaster.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biol. Animal. 37, 445-449 (2001).</li>
<li>Peron, S., Zordan, M. A., Magnabosco, A., Reggiani, C., Megighian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+action+potential+to+contraction%3A+Neural+control+and+excitation-contraction+coupling+in+larval+muscles+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.Physiol.+A%3A+Molecular+%26+Integrative+Physiol%22%5BJournal%5D)">From action potential to contraction: Neural control and excitation-contraction coupling in larval muscles of Drosophila.</a> Comp. Biochem.Physiol. A: Molecular & Integrative Physiol. 154, 173-183 (2009).</li>
<li>Ponzielli, R., Astier, M., Chartier, A., Gallet, A., Therond, P., Semeriva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+tube+patterning+in+Drosophila+requires+integration+of+axial+and+segmental+information+provided+by+the+Bithorax+Complex+genes+and+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Develop%22%5BJournal%5D)">Heart tube patterning in Drosophila requires integration of axial and segmental information provided by the Bithorax Complex genes and hedgehog signaling.</a> Develop. 129, 4509-4521 (2002).</li>
<li>Sl ma, K., Farkas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heartbeat+patterns+during+the+postembryonic+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heartbeat patterns during the postembryonic development of Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 51, 489-503 (2005).</li>
<li>St hmer, W., Roberts, W. S., Almers, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSt+hmer%2C+W+%22Single+channel+recordings%22">Single channel recordings</a>. Sakmann, B., Neher, E. The loose patch clamp, Plenum Press. New York. 123-132 (1983).</li>
<li>Wessells, R. J., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+assays+for+heart+function+mutants+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Screening assays for heart function mutants in Drosophila.</a> Biotechniques. 37, 58-66 (2004).</li>
<li>Zornik, E., Paisley, K., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+transmitters+and+a+peptide+modulate+Drosophila+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Neural transmitters and a peptide modulate Drosophila heart rate.</a> Peptides. 20, 45-51 (1999).</li>
</ol>

<ol><li>解剖ツール：ファイン＃5ピンセットと（すべてのファイン科学のツール（米国）、（株）、373 - Gビンテージパークドライブ、フォスターシティー、CA 94404から1139から得られる）罰金はさみ</li><li>解剖と計数心拍数のためのズーム機能で顕微鏡を解剖。心臓の局所刺激のためにこれも必要です。 </li><li>細胞外および細胞内記録のために直立の目標（4 ×と20倍）を持つ化合物の顕微鏡が使用されます。 コンピュータへのライン録音での標準的な細胞内のアンプとA / Dボード。電気信号は、PowerLab/4sインタフェース（ADInstruments、オーストラリア）への行に記録されます。我々は、チャートまたはScopeというADInstrumentsから標準のソフトウェアを使用してください。 </li><li>化学物質：すべての生理食塩水の化学物質は、シグマケミカル社（セントルイス、MO）から入手されています。 </li><li>細胞内記録のための我々はガラスキャピラリチューブ（FHC、ブランズウィック、ME、04011、アメリカ合衆国カタログ＃30-31-0）を使用すると焦点macropatchの記録と刺激電極のために我々はKimax - 51を使用して、キンブルプロダクトアート。 100ミリメートル番号34502、ID 0.8〜1.1ミリメートル、長さ。細胞内電極は、20〜30オームの抵抗を持つ必要があります。 macropatch電極は、微細な先端が電極の引き手から作られた後のガラスの先端を切り離すことにより構築されます。壊れたオフの先端の直径は20μM程度きれいな垂直のブレークにする必要があります。ヒントは、焦点外記録用10μM約内径に研磨熱である。心臓を駆動するために刺激電極のために我々は、直径約20〜50μMの最後のヒントを使用してください。電極のシャフトは、それが徐々に曲げて約45度に曲げるために発生する発熱体を介して実行されます。これは準備にさらに45度程度が生成されますマイクロマニピュレータを持つ角度など、心臓の管がフラットまたは垂直電極の内腔を生成します。 </li></ol>

幼虫のモニタリングの心機能キイロショウジョウバエ生理学的研究のための

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

私たちは、幼虫の心臓機能を記録するためにさまざまな方法を提示<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;。アプローチは、心拍数が無制限と控えめ全体幼虫で測定することができます。心臓の周りの環境を直接制御するための別のアプローチは、所望の化合物に心を入浴するために切開幼虫や内臓の除去を利用しています。露出の心も膜電位が心筋細胞で、心臓の管に沿って電気伝導のために生成されたイオン電流の洞察力を与えることができる監視することができます。これらのアプローチは説明されている将来の実験のための様々な長所と短所があります。幼虫の心の準備は、ほかに追加のモデルが用意されています<em&gt;ショウジョウバエ</em細胞機能に対する細胞内カルシウム調節の役割を調査するために&gt;骨格NMJ。様々な種における筋細胞における活動電位を形作る基本的なイオン電流をより深く学ぶ、人は哺乳類の様々な疾患の原因特異的な遺伝子に関連する既知のイオン性機能障害のハンドルを取得するために期待できます。

我々はの幼虫に心機能を監視するためにさまざまな方法を提示<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ギャップ結合、イオンチャネルの変異が、ペースメーカー活性の調節と薬理学的研究の機能を扱うの質問を評価する。

ショウジョウバエ幼虫における心機能記録のためのさまざまな手法を提示します。これらのアプローチにより、拘束されていない状態での心拍数測定が可能となり、...

ショウジョウバエは、心臓の発達、機能、およびその基盤となるペースメーカー活性を研究する上で遺伝学的に非常に有用なモデル生物です。本手順書では、無傷および解剖した幼虫の調製方法と、心拍数のモニタリング方法について解説します。また、解剖した個体を用いることで、細胞外または細胞内電位の記録が可能となり、イオンチャネル機能の詳細な解析が行えます。こんにちは。ケンタッキー大学生物学部の教員、ロビン・クーパーです。本日は、私の学生であるアン・クーパー、カイラ・ライマン、マット・ワード、そしてイースター・ボクが、Drosophila 幼虫の心拍数をモニタリングするための様々な手法をご紹介します。この後にお見せする拘束しない方法は、幼虫を単一の焦点面内で可視化させるため、「アントファーム法」と呼ばれています。幼虫を最適に観察するために、1 cm × 0.5 cmの範囲において最高の空間分解能と倍率を得られるよう、2倍の対物レンズと0.5倍の接眼レンズを備えた解剖顕微鏡を使用してください。写真は接眼レンズに装着したカメラで撮影し、ビデオを記録することができます。本手法を開始するには、2枚のスライドガラスの間に、少量の餌とともに幼虫を挟み込みます。スライドは、4辺すべてにプラスチック製スペーサーを配置し、1〜1.5 mmの間隔を空けて保持します。幼虫の頭部を下方に向けさせるため、標本を20〜45度の角度に数分間傾けます。心臓の拍動を観察するために、心臓または2本の気管のコントラストが最適になるよう顕微鏡のミラーを調整してください。接着剤法は、ガラススライド上に幼虫を固定するための恒久的なマウント方法です。接着剤法を開始するには、まずきれいなカバーガラスをガラススライドの上に置きます。カバーガラスの端の隅に、シアノアクリレート系接着剤を少量滴下します。次に、幼虫を水で洗浄します。過剰な餌を取り除くため、ティッシュやペーパータオルの角で液体を吸い取ります。幼虫を十分に洗浄したら、清潔なピンセットでそっとつまみ、顕微鏡下でカバーグラスから離れたスライドガラス上に、幼虫が腹側を下にするように配置します。胃には、細かい黒い毛を伴うかすかな水平方向の溝があります。幼虫の背面を上に向けますが、そこには気管である2本の走行線（レーシングストライプ）が見えます。接着剤専用の2組目のピンセットを使用して、スライド端の液滴から少量を取り、反対側の角に配置します。ピンセットの先端を覆うのに十分なごく少量の量を使用してください。動物を拾い上げ、腹側を黒い口の方に向けた状態で、固定されるように接着剤の上に配置します。フックはカバーガラスの端またはその付近に配置してください。口部のフックと褐色の螺旋状の部分が接着剤に触れないようにします。幼虫を軽く押し下げて平らに広げてください。試験物質を投与するには、シリンジを用いて幼虫の頭部の近くに小さな液滴を滴下するのが最適です。心拍数は、1分間に螺旋状の拍動が起こる回数を数えることで観察します。長時間の観察を行う場合は、その場で幼虫に餌を与え、脱水を防ぐために湿らせておきます。顕微鏡下で使用可能な解剖プレートを作成するには、磁気テープの一片の中央に、メスを用いて直径2 cmの穴を開け、それをガラススライドに貼り付けます。ピン留めを容易にするため、曲げてペーパークリップに接着した解剖ピンを使用してください。解剖の際、無傷の3期幼生を解剖プレート上に置きます。背側を上にすると、クチクラを通して気管が見えるはずです。口鉤の両側に2本のピンを、またらせんの両側にさらに2本のピンを刺して幼虫を固定します。次に、生理食塩水を加え、幼虫を湿らせた状態に保ちます。その後、coddle端で水平に切開し、続いてらせんの側面に沿って動物の頭部に向かって縦方向に切開します。背面のピンを1本持ち上げ、クチクラの下に引っ掛けます。ピンを用いて広げ、体腔を開きます。他の3本のピンでも同様に繰り返します。動物の体をピンで固定して開いた後、気管や心臓を傷つけないように注意しながら内臓を取り除きます。脳や一部の脂肪体などの構造は心臓に付着しており、これらを取り除く際に心臓を損傷させる可能性があります。解剖後、調製物をHL three saline浴中で3〜5分間静置させます。薬理学的薬剤を心臓に直接投与しながら、この調製物を用いて細胞内記録および電場記録を行います。この解剖ステップの所要時間は合計で3〜6分です。電気的ペーシングを行うには、まずフォーカル電極を作成する必要があります。ガラス電極を加熱ヒーターの上で走らせて火炎研磨し、約45度の緩やかな曲げ加工を施してフォーカル電極を作成します。室温のHL three salineを満たしたフォーカル電極を、先端を下に向けた状態でマニピュレーターに装着します。刺激電極のワイヤーが電極内の生理食塩水に接触していること、および刺激装置の電源がオフになっていることを確認してください。新しく心臓を解剖し、準備した試料を顕微鏡上に固定します。接地ワイヤーを生理食塩水に入れます。ピンに触れたり、標本を乱したりしないよう注意してください。マニピュレーターを使用して電極を生理食塩水の中へ移動させる間、電極に焦点を合わせ続けます。生理食塩水に入れたら、電極の先端のルーメンを心臓に平らに密着させ、軽く触れるように配置します。電極を配置したら、刺激装置の周波数を2 Hzに設定し、電圧を最低設定にします。刺激装置の電源を入れます。周波数を約3 Hzに調整し、心拍数が刺激装置のリズムに一致して速くなるまで、ゆっくりと電圧を上げてください。これで、刺激装置を通じてリズムを操作できるようになります。さらに、化合物を添加し、それが収縮や電気伝導に影響を与えるかを確認できます。場電位記録を行うには、マクロパッチ記録電極に浸漬液を満たし、複合顕微鏡上のマニピュレーターに取り付けます。電極をアンプおよび記録装置に接続します。マニピュレーターを使用して、顕微鏡に固定した解剖標本の心臓の上に電極のルーメンを降ろします。電極の先端で心臓に非常に軽く触れます。心臓の別の領域から電位を記録するために、電位記録を行うことができます。電極の先端をゆっくりと持ち上げ、マニピュレーターを使用して新しい領域に移動させ、再び先端の電位記録を行います。心臓における電気信号の頻度と持続時間を精密にモニタリングすることで、幼生心筋細胞の膜電位を測定します。まず、3 M 塩化カリウムを満たした鋭利な電極のルーメンが、垂直から約45度の角度で心臓に対して平らに接していることを確認します。適切に配置されたら、電極の先端で心臓にそっと触れ、先端を細胞内にタップして挿入します。電極が折れていなければ、再度使用することが可能です。細胞内記録を用いることで、活動電位のイオン的根拠や電位の特徴的な波形を測定し、イオンチャネルの変異やチャネルモジュレーターの影響を検討することが可能です。以上で、心臓の記録方法、および細胞内電位とフィールド電位の測定方法について説明しました。これらの手法を用いて、心臓の変化だけでなく、薬理学的な操作や遺伝子改変による影響を解析することができます。この手順を行う際は、心臓に付着している関連構造物を引っ張ったり、フォーカル電極で強く押しすぎたりしないことが重要です。また、接着剤を用いる方法では、開口部や球状部分を接着して塞がないように注意してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

monitoring-heart-function-larval-drosophila-melanogaster-for

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

アダルトキイロショウジョウバエのロコモーションの高解像度のビデオトラッキング

の電気生理学的記録ショウジョウバエ胚

幼虫および成体での心臓の鼓動を可視化するために必要なテクニック...

の心臓の鼓動の可視化ショウジョウバエ</em

我々は、より高速の光記録を分析するための半自動化された光ビートの分析法（SOHA）を開発しました...

スモールハーツの半自動光ビート解析

このレポートは、TriKinetics Drosophila Activity...

幼虫活性の測定<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アクティビティモニタ

ここでは、さまざまな発生段階でショウジョウバエを準備し、カスタム光干渉顕微鏡(OCM)システムを使用してショウジョウバエの心拍の縦方向の光学イメージングを実行するための実験プロトコルが説明されています。心臓の形態学的および動的変化は、OCM画像から心臓の構造的および機能的パラメータを分析することにより、定量的に特徴付けることができます。...

ショウジョウバエの調製と光コヒーレンス顕微鏡を用いてin vivoで心機能の縦イメージング（OCM）

プロトコルでは、通常の大気酸素濃度下での低酸素症が発生しているショウジョウバエ幼虫を識別する簡易測定法について説明します。このプロトコルでは、低迷や低成長などの重複する表現型を示す他の変異体と区別される低酸素の幼虫をことができます。...

潜入/トンネル用キイロショウジョウバエ幼虫における低酸素の検出

このプロトコルは、コスト効率的かつ便利な神経蛋白質の遺伝の突然変異の薬理学的エージェントのテストを有効にするショウジョウバエ中枢神経系の降下の電気的活動を記録する方法をについて説明しますや未踏の生理学的経路の役割。...

第三令キイロショウジョウバエの中枢神経活動の電気生理学的記録

本プロトコールは、OCT画像化および光遺伝学的心臓ペーシングのために、心臓においてeNpHR2.0またはReaChRオプシンを発現するショウジョウバエメラノガスターの生成を記載する。ショウジョウバエOCTイメージングおよび心拍調節のための詳細な指示は、異なる発達段階における生きた動物における回復可能な心停止、徐脈、および頻脈のシミュレーションを含む、報告されている。...

ショウ ジョウバエのメラノガスター モデルの開発による心機能のイメージングと光遺伝学的制御

このプロトコルは、従来の哺乳類モデルに代わるものとして、自発運動機能障害の定量化を通じてショウジョウバエの神経毒性を評価するためのハイスループットで費用対効果の高い方法を提供します。これは、高感度で再現性があり、倫理的に有利なモデルを使用して、医薬品化合物、環境剤、または遺伝子組み換えの神経毒性効果を評価することを目的としています。...

神経毒性のリードアウトとしての Drosophila melanogaster の自発運動機能障害の行動解析

学ぶキイロショウジョウバエ幼虫の心機能モニタリング手法。無拘束観察、接着固定、解剖標本の作製、電気刺激、膜電位記録などの技術を用いて、心拍数測定とイオンチャネル機能解析を行う生理学研究手法です。

幼虫のモニタリングの心機能キイロショウジョウバエ生理学的研究のための

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