幼虫のモニタリングの心機能キイロショウジョウバエ生理学的研究のための

ショウジョウバエは、心臓の発達と機能、およびその根底にあるペースメーカー活性の研究において、遺伝学的に非常に有用なモデルです。本手順では、幼虫の生体ままの状態および解剖後の状態の両方でサンプリングする方法と、心拍数をモニターする方法について解説します。また、解剖したサンプルを用いることで、細胞外または細胞内電位の記録が可能となり、イオンチャネル機能の詳細な解析が行えます。

こんにちは。私はケンタッキー大学生物学部の教員、ロビン・クーパーです。本日は、学生のアン・クーパー、カイラ・ライマン、マット・ウォード、イースター・ボクが、ショウジョウバエ（Drosophila）幼虫の心拍数をモニタリングするためのさまざまな手順をご紹介します。以下の拘束しない手法は、幼虫を単一の焦点面内で可視化するため、「アントファーム法」と呼ばれています。

幼虫を最適に観察するためには、1 cm × 0.5 cmの範囲で最高の空間分解能と倍率を得られるよう、2倍の対物レンズと0.5倍の接眼レンズを備えた解剖顕微鏡を使用してください。写真および動画は、接眼レンズに取り付けたカメラで記録できます。本手法を開始するには、2枚のスライドガラスの間に、少量の餌とともに幼虫を挟み込みます。

スライドはプラスチック製スペーサーを用いて、全4辺で1〜1.5 mmの間隔を空けて固定します。幼虫の頭部を下方に向けさせるため、準備した試料を20〜45度の角度で数分間傾けます。心臓の拍動を観察するために、心臓または2本の気管のコントラストが最適になるよう顕微鏡ミラーを調整します。

グルー法は、ガラススライド上に幼虫を固定するための恒久的な封入法です。グルー法を開始するには、まず清潔なカバーガラスをガラススライドの上に置きます。次に、カバーガラスの片方の角に少量の超強力接着剤を滴下します。

次に、幼虫を水で洗浄します。余分な餌を取り除くため、ティッシュやペーパータオルの角で液体を吸い取ります。幼虫を十分に洗浄した後、清潔なピンセットで慎重に拾い上げ、顕微鏡下でカバーガラスから離れたスライドグラスの上に、幼虫を腹側から向けるように配置します。

胃には、微細な黒い毛を伴うかすかな水平方向の溝が走っています。幼虫の背面を上にし、気管である2本の走行線（レーシングストライプ）が確認できるようにします。接着剤専用の別のピンセットを使用して、スライドグラスの端にある液滴から少量を採取し、反対側の角に配置します。

ピンセットの先端を覆う程度の極少量を使用します。個体を掴み、腹側を下にして黒い口の部分に接着させ、そのまま固定してください。

フックはカバーガラスの端またはその付近に配置してください。口のフックと褐色のらせん状の部分が、接着剤に触れないようにします。幼虫を軽く押し下げて、平らにしてください。

試験物質を投与するには、シリンジを用いて幼虫の頭部付近に少量ずつ滴下するのが最適です。心拍数は、1分間に螺旋状の拍動が起こる回数を数えて観察します。長時間の観察を行う場合は、その場で幼虫に餌を与え、脱水を防ぐために湿らせておきます。顕微鏡下で使用可能な解剖プレートを作成するには、メスを用いて磁気テープの中心に直径2cmの穴を開け、それをガラススライドに貼り付けます。

ピン留めを容易にするため、曲げてペーパークリップに接着した解剖用ピンを使用してください。解剖の際、完全な第3段階の星状幼虫を解剖プレートの上に置きます。背側を上にすると、クチクラを通して気管が見えるはずです。

口鉤の両側に2本のピンを、また、らせんの両側にさらに2本のピンを幼虫に刺します。次に、幼虫を湿らせたままにするために生理食塩水を加えます。続いて、胴体末端側で水平に切開し、その後、らせんに沿って動物の頭部に向かって縦方向に切開します。

背面のピンを1本持ち上げ、クチクラの下に引っ掛けます。そのピンを使用して広げ、体腔を開きます。

他の3本のピンでも同様に繰り返します。個体をピンで固定して開いた後、気管や心臓を傷つけないように注意しながら内臓を取り除きます。脳や一部の脂肪体などの構造は心臓に付着しており、これらを取り除こうとすると心臓を損傷させる可能性があります。

解剖後、調製物をHL3生理食塩水浴に3～5分間浸して静置させます。細胞内記録および細胞外記録は、薬理剤を心臓に直接投与しながら、この調製物を用いて行います。この解剖ステップに要する合計時間は3～6分です。電気的ペーシングを行うには、まず局所電極を作成する必要があります。ガラス電極を加熱 elements 上で走らせて火炎研磨し、約45度の緩やかな曲げを付けて局所電極を作成します。室温のHL3生理食塩水で満たした局所電極を、チップが下を向くようにマニピュレーターに取り付けます。

刺激電極線が電極内の生理食塩水に接していること、および刺激装置の電源がオフであることを確認します。心臓解剖標本の新鮮なサンプルを顕微鏡上に固定します。接地線を生理食塩水の中に入れます。

ピンに触れたり、準備した試料を乱したりしないよう注意してください。マニピュレーターを使用して電極を生理食塩水の中へ下ろす際は、電極に焦点を合わせ続けます。生理食塩水に入ったら、電極の先端のルーメンを心臓に密着させ、軽く触れるように配置します。

電極を配置した後、刺激装置の周波数を2 Hzに設定し、電圧を最低設定にします。刺激装置の電源を入れます。周波数を約3 Hzに調整し、心拍数が刺激装置のリズムと一致して速くなるまで、ゆっくりと電圧を上げます。

刺激装置を用いて、リズムを操作することができます。また、化合物を追加し、それが収縮や電気伝導に影響を与えるかを確認できます。細胞外電位（フィールドポテンシャル）記録を行うには、マクロパッチ記録電極に浸漬液を満たし、複合顕微鏡上のマニピュレーターに取り付けます。

電極をアンプおよび記録装置に接続します。マニピュレーターを使用して、顕微鏡に固定した解剖標本の心臓の上に電極のルーメンを下ろします。電極の先端で心臓に非常に軽く触れます。

ここからは、心臓の別の領域から電位を記録するために、野外記録（フィールドレコーディング）を行うことができます。電極の先端をゆっくりと持ち上げ、マニピュレーターを用いて新しい領域に移動させた後、再度電位記録を行います。心臓内の電気信号の速度と持続時間を精密にモニタリングし、幼生心筋細胞の膜電位を測定します。

まず、3 M 塩化カリウムで満たした鋭い電極のルーメンが、垂直から約45度の角度で心臓に接していることを確認します。適切に配置されたら、電極の先端で心臓にそっと触れ、細胞に先端を軽く押し込みます。電極が折れていなければ、再利用が可能です。

細胞内記録を行うことで、活動電位のイオン的基盤や電位の特徴的な波形を測定し、イオンチャネルの変異やチャネルモジュレーターの影響を検討することが可能になります。以上で、心臓の記録方法に加えて、細胞内電位および場電位の測定方法について説明しました。これらの手法を用いることで、心臓の変化だけでなく、薬理学的な操作や遺伝子改変による影響を調べるすることができます。

本手順を実施する際は、心臓に付着している関連組織を引っ張ったり、フォーカル電極で強く押し付けすぎたりしないことが重要です。また、接着剤を用いる方法では、開口部や球状部分を接着して塞がないよう注意してください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。