幼虫のモニタリングの心機能キイロショウジョウバエ生理学的研究のための

ショウジョウバエは、心臓の発達と機能、およびその根底にあるペースメーカー活動を研究する上で、遺伝学的に非常に有用なモデルです。本手順では、無傷および解剖後の幼虫を用いた標本作成方法と、心拍数のモニタリング方法について解説します。また、解剖標本を用いることで、細胞外または細胞内電位の記録が可能となり、イオンチャネル機能のさらなる解析が行えます。

こんにちは、ケンタッキー大学生物学部の教員、ロビン・クーパーです。本日は、私の学生であるアン・クーパー、カイラ・ライマン、マット・ウォード、そしてイースター・ボクが、Drosophila 幼虫の心拍数をモニタリングするためのさまざまな手順について解説します。これから紹介する拘束しない手法は、幼虫を単一の焦点面内で可視化するため、「アントファーム法」と呼ばれています。

幼虫を最適に観察するためには、1 cm × 0.5 cmの領域において最高の空間分解能と倍率を得られるよう、2倍の対物レンズと0.5倍のチューブレンズを備えた解剖顕微鏡を使用してください。接眼レンズに取り付けたカメラを使用して、写真および動画を記録できます。本手法を開始するには、2枚のガラススライドの間で、薄い餌の層と共に幼虫を挟み込みます。

スライドガラスは、四辺すべてにプラスチック製スペーサーを配置し、1〜1.5 mmの間隔を空けて固定します。幼虫の頭部を下方に向けた状態を維持させるため、標本を20〜45度の角度で数分間傾けます。心拍を観察するために、心臓または2本の気管のコントラストが最適になるよう、顕微鏡ミラーを調整してください。

グルー法は、ガラススライド上で幼虫を固定するための恒久的封入法です。グルー法を開始するには、清潔なカバーガラスをガラススライドの上に置きます。カバーガラスの隅に少量のシアノアクリレート系接着剤（スーパーグルー）を滴下します。

次に、幼虫を水で洗浄します。余分な餌を取り除くため、ティッシュやペーパータオルの角で液体を吸い取ります。幼虫が十分に洗浄されたら、清潔なピンセットで慎重に摘み上げ、顕微鏡下でカバーガラスから離れたスライドグラス上に、幼虫を腹側から下にして配置します。

胃には、微細な黒い毛を伴うかすかな水平方向の溝が走っています。幼虫の背面を上に向けます。そこには気管である2本の走行線が見えます。接着剤専用のもう1本のピンセットを使用し、スライド端の液滴から少量を採取して、反対側の角に配置します。

ピンセットの先端を覆うのに十分なごく少量の量を使用します。個体を拾い上げ、腹側を下にして黒い口の部分の接着剤の上に配置し、そのまま固定されるようにします。

フックはカバーガラスの端またはその付近に配置してください。口部のフックと褐色のらせん状構造が、接着剤に触れないようにします。幼虫をそっと押し下げて、平らにしてください。

試験物質を投与するには、シリンジを用いて幼虫の頭部付近に少量ずつ滴下するのが最適です。心拍数は、1分間に心臓が拍動する回数を数えることで観察します。長時間の観察を行う場合は、その場で幼虫に餌を与え、脱水を防ぐために湿らせておきます。顕微鏡下で使用可能な解剖プレートを作成するには、メスを用いて磁気テープの中心に直径2 cmの穴を開け、それをガラススライドに貼り付けます。

ピン留めを容易にするため、曲げてゼムクリップに接着させた解剖用ピンを使用します。解剖の際、無傷の3齢幼虫を解剖プレート上に置きます。背側を上にすると、クチクラを通して気管が見えるはずです。

幼虫の口鉤の両側に2本のピンを、またらせんの両側にさらに2本のピンを刺します。次に、幼虫の湿潤状態を維持するために生理食塩水を加えます。その後、尾端付近で水平に切開し、続いてらせんの側面に沿って動物の頭部に向かって縦に切開します。

背面のピンを1本持ち上げ、クチクラの下に引っ掛けます。ピンを使用して広げ、体腔を開きます。

他の3本のピンでも同様に繰り返します。個体をピンで固定して開いた後、気管や心臓を傷つけないように注意しながら内臓を取り除きます。脳や一部の脂肪体などの構造は心臓に付着しており、これらを除去する際に心臓を損傷させる可能性があります。

解剖後、調製物をHL3生理食塩水バス内で3〜5分間静置させます。心臓に薬理剤を直接投与しながら、この調製物を用いて細胞内記録およびフィールド記録を行います。この解剖ステップの所要時間は合計3〜6分です。電気的ペーシングを行うには、まず局所電極を作製する必要があります。ガラス電極を加熱エレメント上で走らせて火炎研磨し、約45度の緩やかな曲げを加えて局所電極を作製します。室温のHL3生理食塩水を満たした局所電極を、先端を下に向けた状態でマニピュレーターに取り付けます。

刺激装置の電線が電極内の生理食塩水に接触していること、および刺激装置の電源がオフであることを確認してください。新しく心臓を摘出した試料を顕微鏡上に固定します。接地線を生理食塩水の中に入れてください。

ピンに触れたり、プレパレーションを乱したりしないよう注意してください。マニピュレーターを使用して電極を生理食塩水の中へ下ろしながら、電極に焦点を合わせ続けます。生理食塩水に入れたら、電極の先端のルーメンを心臓に平らに密着させ、軽く触れるように配置します。

電極を配置した後、刺激装置の周波数を2 Hzに設定し、電圧を最低設定にします。刺激装置の電源を入れます。周波数を約3 Hzに調整し、心拍数が刺激装置のリズムに一致して速くなるまで、ゆっくりと電圧を上げます。

刺激装置を用いてリズムを操作することができます。化合物を添加し、収縮や電気伝導に影響があるかを確認できます。電位記録を行うには、マクロパッチ記録電極を浸漬液で満たし、複合顕微鏡上のマニピュレーターに取り付けます。

電極をアンプおよび記録装置に接続します。マニピュレーターを使用して、顕微鏡に固定した解剖標本の心臓の上に電極のルーメンを降ろします。電極の先端で心臓に非常に軽く触れます。

心臓の別の領域から電位を記録するために、電極記録を行うことができます。マニピュレーターを使用して電極の先端をゆっくりと上げ、新しい領域に移動させた後、再度先端の電位記録を行います。心臓における電気信号の速度と持続時間を精密にモニタリングすることで、幼生心筋細胞の膜電位を測定します。

まず、3 M 塩化カリウムを満たした鋭い電極のルーメンが、垂直から約45度の角度で心臓に平らに接していることを確認します。適切に配置されたら、電極の先端で心臓に軽く触れ、先端を細胞内に刺入します。電極が破損していなければ、再利用が可能です。

細胞内記録を行うことで、活動電位のイオン基盤や電位の特有の波形を測定し、イオンチャネルの変異やチャネルモジュレーターの影響を調べることが可能です。ここまで、心臓の記録方法、および細胞内電位と細胞外電位（フィールドポテンシャル）の測定方法について説明しました。これらの手法を用いて、心臓の変容、薬理学的操作、および遺伝子改変を解析することができます。

この手順を行う際は、心臓に付着している関連組織を引っ張ったり、フォーカル電極で強く押しすぎたりしないことが重要です。また、接着剤を用いる方法では、開口部や球状の閉鎖部を接着させないように注意してください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。