光度計2000C分光光度計を使った微量タンパク質の濃度測定

NanoDropテクノロジーは、光ファイバーと表面張力を組み合わせて、核酸やタンパク質などの少量のサンプルを保持し、測定します。サンプルの小さな液滴は、下部台座に直接ピペットで移されます。次に、上部の光学台座がサンプルと噛み合ってカラムを形成します。

台座は自動的に移動して、最適なパス長に調整されます。パス長を短くすると、ほとんどのタンパク質サンプルで希釈を行う必要がなくなり、測定は数秒で行われ、可視スペクトルの結果が表示されます。こんにちは、サーモフィッシャーサイエンティフィックのNanoDrop研究所のLynn Kalhornです。

本日は、革新的なマイクロボリューム分光光度計を使用してタンパク質濃度を測定する手順を示します。NanoDrop 2000 C.The NanoDrop 2000 C分光光度計は、液体の表面張力に依存する革新的なサンプル保持システムを使用して、キュベットやキャピラリーを使用せずに2つの光学台座間で微量サンプルを保持し、測定します。マイクロサンプルは検出面の真上に置かれ、表面張力によって光ファイバーの端間に液体カラムが形成されます。

この液体カラムは、垂直方向の光路を形成します。キセノンフラッシュランプを光源とし、リニアCCDアレイを用いた分光器を用いて試料を通過する光を分析します。キュベットなどの従来の封じ込め装置をシステムから取り外すことには、いくつかの利点があります。

測定に必要なサンプルはごく少量です。1〜2マイクロリットルのクリーンアップは、実験室のワイプで光学面を拭くだけで、測定中に光路の長さがリアルタイムで自動的に変更されます。さらに、パス長を短くすると、高濃度の測定が可能になり、ほとんどのタンパク質サンプルで希釈を行う必要がなくなります。

キネティックスタディなど、獣医が必要な場合、NanoDrop 2000 Cは同じ分光光度計に獣医オプションを提供します。このプロトコルでは、マイクロボリュームペデスタルオプションを使用してタンパク質濃度を決定します。プロテインA two 80法は、トリプトファンチロシンとフェニルアラニン残基、またはシステイン、システイン、ディススルフィド結合を含み、280ナノメートルで吸光度を示す精製タンパク質に適用できます。

この手順を開始するには、メインメニューからprotein A two 80アプリケーションを選択します。波長検証ウィンドウが表示されたら、アームが下がっていることを確認し、ドロップダウンリストから測定するサンプルのタイプを選択します。デフォルト設定は、1 ABSORBENCE が 1 ミリグラム/ミリグラムに等しいほとんどの未知のタンパク質混合物に推奨されます。

以前に特徴付けられた精製タンパク質を測定する場合は、質量吸光係数またはモル吸光係数のいずれかを入力できます。タンパク質の濃度をより正確に決定するには、色分けされたボックスの隣にあるドロップダウンリストから濃度単位を選択します。次に、空白を設定します。

適切な緩衝液を使用する場合は、タンパク質が懸濁している緩衝液を使用することが重要です。使用するバッファーは、サンプル溶液と同じpHおよび同程度のイオン強度である必要があります。異なるタンパク質間で表面張力が異なるため、適切なカラム形成を確保するために、2マイクロリットルのサンプルをロードすることをお勧めします。

溶液がピペットチップの外側に付着するのを防ぐために溶液を排出しながら、ローリテンションピペットチップを下台座面にロードタッチするには、噴出してサンプルに気泡が入るのを防ぐために、サンプルの全量よりも少量を排出します。サンプルがロードされたら、アームを下げて空白をクリックします。ブランキングが完了したら、下部と上部の台座からブランク溶液を拭き取ります。

測定のためにアリコートを採取する前に、ドライラボワイプを使用して、サンプルが均一であることを確認することが重要です。液体にマイクロバブルが混入しないように、中間レベルのRPMを使用して穏やかなボルテックスにより、サンプルを穏やかに、しかし完全に混合します。適切なフィールドにサンプル ID を入力します。

ブランクについて前述したように最初のサンプルを2マイクロリットルロードし、アームを下げてカチッと測定します 測定が完了したら、下部と上部の台座からサンプルを拭きます。ドライラボラトリーワイプを使用して、測定ごとに新しい2マイクロリットルのサンプルアリコートを使用して、他のすべてのサンプルを同じ方法で測定します。通常の糸くずの出ないラボ用ワイプは、多くの場合、測定の合間に光学式ペデスタルをクリーニングするのに十分です。

互換性がなく、使用してはならない唯一の溶媒はフッ化水素酸溶液であり、界面活性剤を含む試薬は、時間の経過とともに測定ペデスタル表面のコンディショニングを解除し、サンプル液体カラムの形成を妨げる可能性があります。下部台座の液滴が平らになっていることは、光学面が再調整できなくなったことを示しています。台座の表面は、実験室のワイプを使用して激しく磨くか、指示どおりにNanoDrop台座再調整コンパウンドPRのものを使用することが好ましい方法です。

サンプルが特徴化されていないタンパク質溶液、細胞溶解物、または粗タンパク質抽出物である場合は、NanoDrop 2000 C.These着色法にはBCAPの6つの60 BradfordおよびLowyアッセイが含まれる事前設定された着色法のいずれかを使用することをお勧めします。BCAアッセイのデモはこちらで行います。BCAアッセイに必要な試薬は、サーモス科学ピアス還元剤適合キットBCA、試薬A、B、C、A、試薬B、およびウシ血清アルブミン標準物質に含まれています。

私たちの標準はピアスBCAの文献を参照しているため、ピアスの事前に希釈されたアルブミンセットを使用して、お客様の状況に適したアッセイ標準を決定します。試薬を調製するには、まずすべての未知タンパク質とタンパク質標準試料を室温で平衡化し、穏やかなボルテックスで十分に混合します。流体にマイクロバブルが混入しないように、中間レベルのRPMを使用します。

気泡は読み取りに悪影響を与える可能性があるためです。この例 B.In、試薬Aの50対1の比率を使用して測定する標準とサンプルに十分な新鮮な作業試薬を準備し、参照5つの標準と6つのサンプルをカバーするために3ミリリットルの作業試薬を準備します。通常のBCAアッセイは、より広いダイナミックレンジをカバーし、試薬とタンパク質の比率を20対1で使用しますが、マイクロBCAアッセイは感度が高く、試薬とタンパク質の比率を1対1で使用することでダイナミックレンジが狭くなります。

通常のBCAアッセイを行っているため、サンプルに対して20対1の比率で作業試薬を調製します。各チューブに190マイクロリットルの作業試薬を追加し、すべてのサンプルと標準をカバーするのに十分なチューブを使用します。次に、試薬が入った各チューブに10マイクロリットルの標準またはサンプルを加えます。

穏やかなボルテックスでよく混ぜます。チューブを摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、反応を室温まで約10分間平衡化させます。

プロテインA two 80法とは異なり、プロテインBCA法では、サンプルのタンパク質濃度を測定する前に標準曲線を生成する必要があります。標準曲線を生成するには、まずメインメニューからタンパク質BCA法を選択します。波長確認ウィンドウが表示されたら、アームが下がっていることを確認します。

右側のペインテーブルに各標準濃度の値を入力します。このソフトウェアでは、参照と最大7つの追加標準が可能です。リファレンスおよび/または標準試料は、繰り返し測定できます。

適切なバッファーを使用してブランクを確定します。カラーメトリックアッセイ用のブランクは、通常、脱イオンされます。ウォーターピペットで2マイクロリットルの水を下部の台座に置き、アームを下げます。

空白をクリックします。リファレンスとスタンダードのその後のすべての測定をカバーするために必要なブランクは1つだけです。2マイクロリットルのEloqua(単品の試薬とバッファーのみ、タンパク質を含まない)を下段台座にピペッティングして、基準を確立します。

アームを下げて、[測定]をクリックします。[スタンダード]タブで、目的のスタンダードを強調表示し、目的のスタンダードの2マイクロリットルを下台の台座にピペットで移します。アームを下げて、[測定]をクリックします。

すべての標準に対してこのプロセスを繰り返します。標準カーブを表示するには、[標準カーブを表示] をクリックします。すべての標準物質が測定されたら、サンプルボタンをクリックします。

サンプルIDを入力し、2マイクロリットルのサンプルを下部台座にロードし、[測定]をクリックします。サンプルの新鮮な2マイクロリットルのアリコートは、各測定に使用する必要があります。測定が完了したら、ドライラボ用ワイプを使用して、下部と上部の台座からサンプルを拭きます。

その後、サンプルの最終濃度が標準曲線を使用して自動的に計算されるため、結果が得られます。タンパク質濃度を決定する2つの方法を示しました。これは、直接測定による2つの80°測定と、マイクロボリュームNanoDrop 2000 C分光光度計を使用した間接的なカラーメトリック法です。それだけです。

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