Name: マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: 学ぶマウス胚性幹細胞から造血幹細胞を導出する方法。エンブリオイドボディ形成、HoxB4レトロウイルス感染、OP9飼養層培養を経て、致死量照射マウスの造血系を再構成できる移植可能な細胞群を樹立する技術です。

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胚性幹細胞の分化<ol><li> ESCトリプシン処理によって胚性幹細胞（ESC）の近くにコンフルエントにフラスコを収集する。 </li><li>分化培地を5 mLで細胞を再懸濁し、非ゼラチンコートT25に転送する。 37℃を45分間。上清を取得し、遠心分離を介して細胞を集める。 注：ESC培養物からのマウス胚性繊維芽細胞（MEF）は、非ゼラチンコートT25に容易に接続するため、このめっき工程中に培養液から枯渇している。あなたのMEF上で培養してESCをされていない場合は、事前にプレートをスキップすることができます。 </li><li> 333333 cells/50 mLの分化のメディアで再懸濁し、MEF -枯渇ESC。この濃度は100 ESC/15 mLの結果。 </li><li>使用して、マルチチャンネルピ ​​ペッター、15 cm 2のペトリ皿に100 cells/15 mLのドロップでプレートESC。 8チャンネルピペッターを使用して、プレートあたりの滴の18から22行（プレートあたり5ミリリットル程度）について、合うものでなければなりません。 注：このプロトコルでは、滴の2-5 15センチメートル2皿は十分以上になると2-5 × 10 6 6日目EB由来細胞を得られるはず。 </li><li>ゆっくりと低下を反転させるためにプレートを反転させる。 ° C、5％CO 2で48時間37℃でインキュベートする。 </li><li>プールは、静かにプレートし、15 mLコニカルチューブへの転送を渦巻くことでドロップします。 PBSの4-6 mLでプレートをすすぎ、同じ15 mLコニカルに追加します。 注：最大5つのハンギングドロッププレートまでプールすることがあります。彼らは差別化を続け、彼らはあまりにも集中している場合、彼らは大きな塊を形成する傾向があるとして、EBは成長します。 </li><li>プールされたEBSは重力（約10分）によって沈殿することができます。 EBSを乱すことなく上清を吸引除去する。静かに10mLの分化のメディアと10 cmに転送非接着性のペトリ皿に再懸濁します。 </li><li> 37 50rpmのインキュベートでプレートシェーカー上に置いてペトリ皿° C、5％CO 2。 </li><li> 24時間後（分化4日目）、ペトリ皿の中央にEBSを集中するスワールプレート。慎重に交換5mLの新鮮な分化のメディアとメディアの50％（5mL）を。さらに2日間インキュベーターにプレートを返します。 </li></ol> MSCV - HoxB4 - IRES - GFPとEB解離と感染症<ol><li>分化の6日目に、15 mLコニカルチューブにEBSを転送する。重力によって解決することができます。 </li><li> 10mLのPBSでメディアを再懸濁しますを吸引除去する。 EBSは重力によって再定住することができます。 PBSを吸引除去する。 </li><li> 250mLの解離酵素ミックスし、1 mLのPBSを追加。時折酵素とEBSを混在させるチューブを渦巻いて、20分間37℃の水浴でインキュベートする。 </li><li> 8 mLの酵素を含まない解離緩衝液を追加します。 </li><li> EBSは完全に解離されるまで混合物が（;過度のピペッティングは、EB由来細胞調製物中で死を増加させる約10倍）を5 mLのピペットを使用してひいて粉にする。 <ol><li>混合物は、EBSが解離などの細胞と濁ってくるでしょう。 </li><li>粉砕中にコニカルチューブの底にピペットチップを配置することで大幅に解離を促進するせん断力を作成します。 </li></ol></li><li>遠心分離を介して細胞を集める。 </li><li>再懸濁し、10％IMDM 5mLに細胞をEB由来とトリパンブルー排除を用いてカウント 注：4日目と分化の6日間、EBSは上向きEB由来細胞の30％、6日目で、アポトーシスと細胞のdeath.Thusの大量のどの結果を空洞を作るには、トリパンブルーで染色することがあります。 </li><li>再懸濁し、EB由来の100,000個の細胞における細胞/ 2 mlの10％IMDM +ウイルス上清などそのMOI 5〜10が8 mg / mLの最終濃度に硫酸プロタミンをachieved.Addている。 注：プレート4つの6 -ウェルプレート（ウェル2 mLの/と仮定して）するのに十分なEB /ウイルス上清ミックスを調製する。 </li><li>プレート2 mLのEB /ウイルス上清ミックスウェルあたりのOP9ストローマ細胞（下記参照）で事前にメッキ4個の6ウェルプレート。 </li><li> 90分間室温で2500rpmでプレートを遠心分離します。 37℃インキュベーターにプレートを転送℃、5％CO 2。 </li><li>プレートから上清を4〜6時間後、収穫し、遠心分離を介して懸濁液中に残っている潜在的な細胞を集める。 </li><li> 48 mlの10％IMDM +サイトカインでペレットを再懸濁します（小さくなるかもしれない）。 2 mLの/ウェルの実行された、上清を回収した感染で元の4つの6ウェルプレートに再懸濁を分注する。 注：必ず、使用時に+サイトカイン新鮮な10％IMDMを準備。 </li><li> ° C、5％CO 2七日間37℃培養する。コロニーは4日後の感染と大と7日目では、整形式で明らかなはずである。健全な拡大には/よく7日目に40から60コロニーをもたらす必要があります。 </li><li> 7日目、感染後に、トリプシン処理によりすべてのウェルからのすべてのセルを（OP9間質を含む）の収集とプール。 注：上清またはトリプシンtreatment.Atこの時点文化の中に採用さPBS洗浄を廃棄しないで、いくつかのコロニーは緩く付着している可能性があり、多くの細胞がfloaがありますsuspension.Collectとプールのすべての洗浄上清中のティンは潜在的に価値のあるセルは廃棄されていないことを確認する。 </li><li> 8 mLの新鮮な10％​​IMDMで再懸濁し、細胞+サイトカイン。 four T75フラスコに2 MLS /フラスコを配布します。各フラスコに、13 MLS 10％IMDM +サイトカインを追加。 37 ° C 5％3日間CO 2（10日間の感染後の合計）。 </li></ol> OP9間質の文化とメッキ<ol><li> 20パーセント- MEMでの標準プロトコルにしたがってOP9間質を維持する。コンフルエントに増殖した場合にOP9細胞は、プロパティを変更します。常にそれ以上一時03分より、分割で80％コンフルエントで分割。 </li><li> 24時間前MSCV - HoxB4 - IRES - GFP、20％- MEMで25000 OP9細胞/ウェルのプレート4つの6 - ウェルプレートで6日目EB由来細胞の感染に。 </li></ol>収集、分別及び移植<ol><li>トリプシン処理を経由して十日間OP9ストロマに展開細胞を集めます。細胞を数える。 注意：トリプシン処理の間に用いられる上清またはPBS洗浄を破棄しないでください。文化のこの時点で、いくつかのコロニーは緩く付着している可能性があり、潜在的に価値のあるセルは廃棄されていないことを保証するためにsuspension.Collectとプール内のすべて洗浄し、上清を浮遊し、多くの細胞があります。 注：良い展開が160から200 × 10 6細胞の合計、40〜50 × 10 6細胞/感染オリジナル6穴プレートの間に得 ​​られるはず。 </li><li>細胞は、プロトコルのこの時点では標準的な技術に係る磁気ビーズを選択またはFACSを経由して分画することができる。 </li><li>移植のために、照射2.5時間の9.25 Gyの分割線量を受けるRag-2/gc欠損の受信者（15-22グラムの重さ）に眼窩または尾静脈注射を介して細胞を提供する。離れて。 注：これは動物の体重は、照射の時に15〜22グラムの間に落ちることが重要です。彼らは22グラムより大きい場合、9.25 GYは、適切なアブレーションを確保するために、細胞が致死照射および/ ​​または生着造血コンパートメントから救助を仲介することはできません照射の十分な投与量にはなりません。大型動物を移植する場合、適切な照射線量を実験的に決定する必要があります。 </li><li> 2月5日× 10 6細胞/動物の最低投与量は致死照射から救助を保証するために必要です。細胞を分画する場合、2-5 × 10 6細胞に相当する（ 例えば、関心の人口は、細胞の未分画プールの10％を表す場合は、2-5 × 10 5細胞/動物を注入）注入する。 注：&gt; 2 × 10 6細胞を注入した場合、常に細胞の高い数字が眼窩配信されたときに生じる可能性が、軌道上での奇形腫形成を避けるために、尾静脈を介して注入する。 </li><li>維持RAG - 2 - / - / GC - / -オートクレーブケージの欠乏の受信者。動物施設の&quot;清潔&quot;に応じて、移植後の動物は致死放射線は、次の5週間酸性の水またはTrimethiprim - Sulfasoxazole（Septra）の投与が必要な場合があります。 </li><li> 3週間後の移植では末梢血で&gt; 90％のGFP + ES由来の白血球を期待する。リンパ球がレトロウイルスHoxB4 - IRES - GFPを黙らせるために知られているが生着は、多系統にする必要があります。 </li></ol>

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6 Rag-2/gamma-c 欠損マウス</td><td>動物</td><td>Taconic Farm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレートシェーカー</td><td>器具</td><td>VWR international</td><td>33998-360</td><td>Ikaworks製オービタルシェーカー</td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット</td><td>器具</td><td>VWR international</td><td>15000-174</td><td>BioHit製ePet</td></tr><tr><td>ESトリプシン</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td>0.25% PBS含有トリプシン</td></tr><tr><td>標準トリプシン</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>0.05% Trypsin-EDTA</td></tr><tr><td>PBS</td><td>緩衝液</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>酵素フリー解離緩衝液</td><td>緩衝液</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>解離酵素ミックス</td><td>緩衝液</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>500 mg コラゲナーゼ IV</td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2126</td><td>500 &amp;mu;L ずつ分注して凍結保存し、凍結融解の繰り返しを避けること。</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>10-017CV</td><td></td></tr><tr><td>プロタミン硫酸塩</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3369</td><td>8 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>EB分化培地</td><td>培地</td><td></td><td></td><td>添付のProtocol.docのレシピを参照してください</td></tr><tr><td>10% IMDM</td><td>培地</td><td></td><td></td><td>添付のProtocol.docのレシピを参照してください</td></tr><tr><td>10% IMDM + সাইトカイン</td><td>培地</td><td></td><td></td><td>添付のProtocol.docのレシピを参照してください</td></tr><tr><td>20% anti-MEM</td><td></td><td></td><td></td><td>添付のProtocol.docのレシピを参照してください</td></tr></tbody></table>

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

幹細胞は、両方の自己複製と生成する複数の分化した子孫の能力を持つ細胞として定義されています。胚性幹細胞（ESC）は、初期胚の胚盤胞に由来し、分化能力に多能性がありますされています。その広大な分化の可能性はそれらの臨床的に有用な細胞型を生成するために、それらを同軸にする方法推理を中心に多くの研究の焦点を行っています。マウスESCからの造血幹細胞（HSC）の成功導出は、最近行われており、このビデオのプロトコルで可視化することができます。 HSC、間違いなく最も臨床的に利用された細胞集団は、造血悪性腫瘍や疾患の無数の治療に使用されています。しかし、HSC治療の恩恵を受ける可能性がある多くの患者は、適切なドナーへのアクセスを欠いている。 ESCは、これらの患者のためのHSCの代替ソースを提供することができます。以下のプロトコルは、ESC - HSCの検討や人間のESCからHSCを分離するための努力を知らせることができるベースラインを確立します。このプロトコルでは、ESCは、市販の血清に対して事前にスクリーニングに最適な造血分化の6日間胚様体（EB）として区別されます。 EBはその後解離し、レトロウイルスHoxB4に感染している。マウス、および10日間のサイトカインを促進する造血の存在下で共培養 - 感染したEB由来細胞はOP9ストローマ、M - CSF - /の頭蓋冠由来する骨髄間質細胞株上にプレーされています。この共培養時には、感染細胞は、世代内のセルの数百万数百の異種プールを結果として、大幅に拡大する。これらの細胞は、致死量放射線照射したマウスを救出して再構成するために使用することができます。

このプロトコルの詳細マウス胚性幹細胞（ESC）と致死量の放射線照射、レシピエントマウスへの彼らのその後の注射から移植造血幹細胞の派生。簡単に言うと、ESCは、レトロウイルスHoxB4とOP9ストローマ細胞と造血サイトカインとの共培養に感染している胚様体、として区別されます。

幹細胞とは、自己複製能と複数の分化した後代細胞を生成する能力の両方を備えた細胞と定義されます。胚性幹細胞（ESC）は…

まず、コンフルエントなT 25フラスコで培養したumslを用います。PBSで洗浄し、Trypsinを数滴滴下して数分間静置します。細胞がプレートから剥がれてきているのが確認できるため、これで準備が整いました。それでは、トリプシン処理した細胞を回収します。コロニーを分散させてからプレートに播種するために、トリプシン処理後の細胞を短時間撹拌しておくのが適切です。その後、インキュベーター内に30〜45分間静置します。ここで、細胞を回収するために遠心分離を行い、上清を吸引します。数分後に再懸濁し、細胞数をカウントします。再懸濁し、カウントが完了したので、分注した液を 50 mL に希釈します。これにより、細胞の状態を確認するために、1滴あたり 100 個の細胞となる適切な濃度になります。これでリザーバーが準備できました。もう一度軽く混ぜ合わせてから、リザーバーに注ぎ入れます。さて、こちらはすでにプログラム済みです。これで完了です。これでほぼ均一になりました。裏返して、そのまま置いておきます。プレートを数枚処理するごとに、液が軽く混ざり合うよう、少しだけ傾けて揺らします。これで5枚のプレートが完了しました。これらをインキュベーターに入れます。これらは2日前に準備した懸垂滴（ハンギングドロップ）です。回収するために、プレートを振って液滴を集めます。ここではすべてを回収しますが、EVをあまり乱さないよう、慎重に行います。PBSを5〜6回加えてプレートを洗浄します。その後、少なくとも10分間放置し、重力によってEVを沈降させます。EBSが沈降したことを視覚的に確認したら、上澄み液の大部分を取り除きます。ただし、完全にすべてを取り除くと、サンプルを乱してしまう可能性があるため、注意してください。さて、ここから6日目まで振盪させます。これらは、マウス胚性幹細胞から6日前に作製した胚様体です。通常、これらを回収する際は、プレートを軽く回します。プレートを回転させると、EDSがディッシュの中央に集まるため、修正が少し容易になります。次に、重力によってEDSをチューブの底に沈殿させ、培地を除去し、10 mLから12 mLのPBSで1回洗浄します。それでは、しばらく待ちましょう。それでは、Pを除去します。次に、酵素ミックスを250 µL加え、1ミリを加えます。そして、これらを37 °Cのウォーターバスに入れます。EDTAが沈殿するため、時々、2回ほどチューブを軽く叩いて混ぜ合わせます。現在、私たちはGibcoから入手した酵素不含の細胞解離バッファーを使用しています。これを各チューブに約8 mLずつ加えます。次に、5 mLピペットを用いて繰り返し混ぜ合わせ、解離させます。混ぜ合わせて解離が進むにつれて、液が非常に白濁します。これは、細胞が培地に分散し、濁りが出ていることを示す視覚的な目安となります。ここから、トリパンブルー排除法で細胞数をカウントします。感染実験を行う場合やMOIを算出する場合、細胞数を正確にカウントすることが非常に重要です。そこで、適切な濃度のウイルス、培地、細胞、および硫酸プロテインを混ぜ合わせた大量のバッチを準備します。そして、細胞の状態を確認します。繰り返しになりますが、細胞が懸濁状態から外れることを非常に懸念しているため、常に注意を払っています。また、飛沫が飛ばないよう細心の注意を払い、2,500 rpmで遠心分離を行います。そこで、10日目の細胞を回収します。洗浄液はすべて保存しておきます。以前はPI（プロピジウムヨード）を使用していましたが、7-AADはそれほど明るくないため、他のチャンネルへの漏れ込みが少なく、よりクリーンな結果が得られます。それでは、変数を取得します。これは、針の中での液量損失を防ぐための有効な方法です。私はシャノン・マッキニー・フリーマンです。ボストン小児病院のジョージ・ファミリーライフ・アトリウムでポストドクトラルフェローを務めています。本日は、マウス胚性幹細胞から移植可能な細胞集団を誘導する方法について解説します。移植可能な造血系細胞についてです。なぜこの実験を行うのでしょうか。このシステムを用いることで、まず究極的なプロトコルの開発目的として、胚性幹細胞から造血幹細胞活性を持つ細胞集団を誘導することを目指しました。ここでの造血幹細胞活性とは、致死量放射線を照射されたマウスを救出し、個体の生涯にわたって、末梢血のあらゆる系統で造血系を再構築できる能力があることを意味します。以上の理由から、このプロトコルが開発されました。現在は、得られた拡張集団の中で、実際に造血幹細胞活性を媒介している細胞集団の表現型を理解するために、さらなる実験を行っています。なぜなら、この集団が非常に不均一であり、マウスを実際に救済する細胞は、この細胞集団の中で極めて稀であることがわかっているからです。そのため、基本的にはその表現型を定義し、非常に不均一な細胞群からこれを精製できるようにしています。そして、骨髄全体から得られる本物の造血幹細胞と、機能的にどのように比較されるかを理解することに最も関心があります。発達過程において同等の再構築能を有しているのか、また、成人の骨髄造血幹細胞を反映しているように見えるのかを検討しています。あるいは、造血幹細胞に近い性質を持っているのかもしれません。例えば、GMや胎児肝などの初期発生段階で見られる可能性があります。最終的に私たちが理解しようとしているのはこうした点であり、これらの疑問を解明したいと考えています。なぜなら、最終的にはこのプロトコルを、私たちが関心を持っているヒト胚性幹細胞を用いた同様の研究に活用したいと考えているからです。そして、この数学的システムを通じて得られる知見は、今後の実験に大きく寄与すると考えています。理由はいくつかあります。まず第一に、これがin vitroにおける優れたモデルであり、発生過程における優れたin featureモデルであるということです。まず、造血幹細胞の発達について理解しようとしています。このシステムは、異所性遺伝子発現を導入しても影響をほとんど受けないため、これらの因子が造血幹細胞の発達にどのように影響するかを調べるのに非常に適しています。したがって、基礎科学の観点から非常に有用です。しかし、最終的な目標は、ヒト細胞から移植可能な代謝幹細胞を誘導し、臨床に応用できる細胞治療法を導き出すことです。とはいえ、それはおそらくかなり先の未来の話になるでしょう。実際、私たちが気づいたのは、最も困難な部分は細胞自体の誘導ではなく、入念な実験を通じて、細胞に受容動物を再構成させるのに苦労した時期があったということでした。そして最終的に分かったことは、レシピエントのアブレーションに細心の注意を払う必要があるということでした。なぜなら、これらの細胞にはその能力がないためです。通常、マウスに骨髄由来の造血幹細胞を移植する場合、マウスを照射するために10または11 Gyの放射線照射を行いますが、骨髄の造血幹細胞は十分な能力を持っており、動物を救出させることができます。しかし、私たちが拡大させたこの細胞集団は、このような高線量の放射線照射から動物を救出させる能力を持っていないことが判明しました。したがって、動物のサイズに注意しながら、照射量を非常に慎重に調整する必要がありました。というのも、動物が大きすぎた場合に同じ線量を使用しようとすると、効果的なアブレーションが行われないことがわかったためです。しかし、一方で照射が不十分であると、細胞はより耐性の強いホストと競争することができなくなります。実のところ、これが主要な変数であり、これらの細胞のab活性の観察を困難にしていたことが判明し、照射量を調整した結果、動物の週齢と体重が非常に重要であることに気づいたことで、我々の実験は非常に再現性高く機能し始めました。そこで分かったのは、体重が15～20 g程度の動物を用い、9.25 grayでアブレーションを行うことが、これらの細胞がマウスを再構成させるために必要な優位性を得られる最適な線量であるということでした。ええ、それが最も重要な変数のひとつであったと考えています。もう一つ、非常に重要な点は、注入する細胞数です。私たちは、モデル生物に放射線を照射するためのこれらの特定の条件を用いて、タイター（力価測定）を行いました。また、マウスに注入した、分画されていないこれらの不均一な細胞集団の数についてもタイターを確認しました。基本的に、動物を救済するには最低投与量として約200万個から500万個の細胞が必要であることが分かりました。これより少ない量を注入しても、動物は救済されません。これはおそらく、この不均一なコンパートメント内で救済を実際に媒介している細胞が希少であることを示唆していると考えられます。したがって、最も重要な変数は、注入する細胞数であると考えられます。また、使用している移植モデルが何であれ、細胞が再構成に必要な優位性を得られる程度には十分に処置し、一方で細胞が救済不能になるほど過剰に処置しないようにすることが重要です。これらの点が、主要な変動要因となってきました。

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