マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

まず、コンフルエントなT 25フラスコで培養したumslを用います。PBSで洗浄し、Trypsinを数滴滴下して数分間静置します。細胞がプレートから剥がれてきているのが確認できるため、これで準備が整いました。

それでは、トリプシン処理した細胞を回収します。コロニーを分散させてからプレートに播種するために、トリプシン処理後の細胞を短時間撹拌しておくのが適切です。その後、インキュベーター内に30〜45分間静置します。ここで、細胞を回収するために遠心分離を行い、上清を吸引します。

数分後に再懸濁し、細胞数をカウントします。再懸濁し、カウントが完了したので、分注した液を 50 mL に希釈します。これにより、細胞の状態を確認するために、1滴あたり 100 個の細胞となる適切な濃度になります。これでリザーバーが準備できました。

もう一度軽く混ぜ合わせてから、リザーバーに注ぎ入れます。さて、こちらはすでにプログラム済みです。これで完了です。

これでほぼ均一になりました。裏返して、そのまま置いておきます。プレートを数枚処理するごとに、液が軽く混ざり合うよう、少しだけ傾けて揺らします。

これで5枚のプレートが完了しました。これらをインキュベーターに入れます。これらは2日前に準備した懸垂滴（ハンギングドロップ）です。

回収するために、プレートを振って液滴を集めます。ここではすべてを回収しますが、EVをあまり乱さないよう、慎重に行います。PBSを5〜6回加えてプレートを洗浄します。その後、少なくとも10分間放置し、重力によってEVを沈降させます。

EBSが沈降したことを視覚的に確認したら、上澄み液の大部分を取り除きます。ただし、完全にすべてを取り除くと、サンプルを乱してしまう可能性があるため、注意してください。さて、ここから6日目まで振盪させます。これらは、マウス胚性幹細胞から6日前に作製した胚様体です。通常、これらを回収する際は、プレートを軽く回します。

プレートを回転させると、EDSがディッシュの中央に集まるため、修正が少し容易になります。次に、重力によってEDSをチューブの底に沈殿させ、培地を除去し、10 mLから12 mLのPBSで1回洗浄します。それでは、しばらく待ちましょう。

それでは、Pを除去します。次に、酵素ミックスを250 µL加え、1ミリを加えます。そして、これらを37 °Cのウォーターバスに入れます。EDTAが沈殿するため、時々、2回ほどチューブを軽く叩いて混ぜ合わせます。現在、私たちはGibcoから入手した酵素不含の細胞解離バッファーを使用しています。

これを各チューブに約8 mLずつ加えます。次に、5 mLピペットを用いて繰り返し混ぜ合わせ、解離させます。混ぜ合わせて解離が進むにつれて、液が非常に白濁します。これは、細胞が培地に分散し、濁りが出ていることを示す視覚的な目安となります。ここから、トリパンブルー排除法で細胞数をカウントします。感染実験を行う場合やMOIを算出する場合、細胞数を正確にカウントすることが非常に重要です。

そこで、適切な濃度のウイルス、培地、細胞、および硫酸プロテインを混ぜ合わせた大量のバッチを準備します。そして、細胞の状態を確認します。繰り返しになりますが、細胞が懸濁状態から外れることを非常に懸念しているため、常に注意を払っています。また、飛沫が飛ばないよう細心の注意を払い、2,500 rpmで遠心分離を行います。

そこで、10日目の細胞を回収します。洗浄液はすべて保存しておきます。以前はPI（プロピジウムヨード）を使用していましたが、7-AADはそれほど明るくないため、他のチャンネルへの漏れ込みが少なく、よりクリーンな結果が得られます。

それでは、変数を取得します。これは、針の中での液量損失を防ぐための有効な方法です。私はシャノン・マッキニー・フリーマンです。ボストン小児病院のジョージ・ファミリーライフ・アトリウムでポストドクトラルフェローを務めています。

本日は、マウス胚性幹細胞から移植可能な細胞集団を誘導する方法について解説します。移植可能な造血系細胞についてです。なぜこの実験を行うのでしょうか。このシステムを用いることで、まず究極的なプロトコルの開発目的として、胚性幹細胞から造血幹細胞活性を持つ細胞集団を誘導することを目指しました。ここでの造血幹細胞活性とは、致死量放射線を照射されたマウスを救出し、個体の生涯にわたって、末梢血のあらゆる系統で造血系を再構築できる能力があることを意味します。

以上の理由から、このプロトコルが開発されました。現在は、得られた拡張集団の中で、実際に造血幹細胞活性を媒介している細胞集団の表現型を理解するために、さらなる実験を行っています。なぜなら、この集団が非常に不均一であり、マウスを実際に救済する細胞は、この細胞集団の中で極めて稀であることがわかっているからです。

そのため、基本的にはその表現型を定義し、非常に不均一な細胞群からこれを精製できるようにしています。そして、骨髄全体から得られる本物の造血幹細胞と、機能的にどのように比較されるかを理解することに最も関心があります。発達過程において同等の再構築能を有しているのか、また、成人の骨髄造血幹細胞を反映しているように見えるのかを検討しています。

あるいは、造血幹細胞に近い性質を持っているのかもしれません。例えば、GMや胎児肝などの初期発生段階で見られる可能性があります。最終的に私たちが理解しようとしているのはこうした点であり、これらの疑問を解明したいと考えています。なぜなら、最終的にはこのプロトコルを、私たちが関心を持っているヒト胚性幹細胞を用いた同様の研究に活用したいと考えているからです。

そして、この数学的システムを通じて得られる知見は、今後の実験に大きく寄与すると考えています。理由はいくつかあります。まず第一に、これがin vitroにおける優れたモデルであり、発生過程における優れたin featureモデルであるということです。

まず、造血幹細胞の発達について理解しようとしています。このシステムは、異所性遺伝子発現を導入しても影響をほとんど受けないため、これらの因子が造血幹細胞の発達にどのように影響するかを調べるのに非常に適しています。したがって、基礎科学の観点から非常に有用です。

しかし、最終的な目標は、ヒト細胞から移植可能な代謝幹細胞を誘導し、臨床に応用できる細胞治療法を導き出すことです。とはいえ、それはおそらくかなり先の未来の話になるでしょう。実際、私たちが気づいたのは、最も困難な部分は細胞自体の誘導ではなく、入念な実験を通じて、細胞に受容動物を再構成させるのに苦労した時期があったということでした。

そして最終的に分かったことは、レシピエントのアブレーションに細心の注意を払う必要があるということでした。なぜなら、これらの細胞にはその能力がないためです。通常、マウスに骨髄由来の造血幹細胞を移植する場合、マウスを照射するために10または11 Gyの放射線照射を行いますが、骨髄の造血幹細胞は十分な能力を持っており、動物を救出させることができます。しかし、私たちが拡大させたこの細胞集団は、このような高線量の放射線照射から動物を救出させる能力を持っていないことが判明しました。

したがって、動物のサイズに注意しながら、照射量を非常に慎重に調整する必要がありました。というのも、動物が大きすぎた場合に同じ線量を使用しようとすると、効果的なアブレーションが行われないことがわかったためです。しかし、一方で照射が不十分であると、細胞はより耐性の強いホストと競争することができなくなります。

実のところ、これが主要な変数であり、これらの細胞のab活性の観察を困難にしていたことが判明し、照射量を調整した結果、動物の週齢と体重が非常に重要であることに気づいたことで、我々の実験は非常に再現性高く機能し始めました。そこで分かったのは、体重が15～20 g程度の動物を用い、9.25 grayでアブレーションを行うことが、これらの細胞がマウスを再構成させるために必要な優位性を得られる最適な線量であるということでした。ええ、それが最も重要な変数のひとつであったと考えています。

もう一つ、非常に重要な点は、注入する細胞数です。私たちは、モデル生物に放射線を照射するためのこれらの特定の条件を用いて、タイター（力価測定）を行いました。また、マウスに注入した、分画されていないこれらの不均一な細胞集団の数についてもタイターを確認しました。

基本的に、動物を救済するには最低投与量として約200万個から500万個の細胞が必要であることが分かりました。これより少ない量を注入しても、動物は救済されません。これはおそらく、この不均一なコンパートメント内で救済を実際に媒介している細胞が希少であることを示唆していると考えられます。

したがって、最も重要な変数は、注入する細胞数であると考えられます。また、使用している移植モデルが何であれ、細胞が再構成に必要な優位性を得られる程度には十分に処置し、一方で細胞が救済不能になるほど過剰に処置しないようにすることが重要です。これらの点が、主要な変動要因となってきました。