ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

pre mRNA上のリボ核タンパク質の結合部位をマッピングするには、まず、目的のprem NNAの指定領域を30のヌクレオチドウィンドウでタイリングし、タイル状に並べたオリゴをアレイ上に合成します。オリゴはアレイから煮沸され、目的のRNPで沈殿します。開始プールの合計には SCI 3 のラベルが付けられ、バインドされたプールには SCI 5 のラベルが付けられ、両方が検出アレイに適用されます。

次に、アレイがスキャンされ、特徴抽出ソフトウェアを使用して結果が解釈されます。塩類。こんにちは、ブラウン大学のMCB学部のウィル・フェア兄弟の研究室のケイト・ワトキンスです。今日は、ラボでプレムRA上のRNAタンパク質複合体の正確な位置を決定するための迅速で安価な手順を示し、重複するオリゴヌクレオチドのプールとしてプレムAを再合成します。

次に、このプールを共免疫沈降法によって結合画分と非結合画分に分離し、マイクロアレイで分析できます。この手順には多くの用途がありますが、私たちは複数のスプライシング因子とその役割、および選択的スプライシングを研究するために使用します。それでは始めましょう。

この手順を開始するには、uc SCゲノムブラウザを使用して、特定の遺伝子、スプライスジャンクション、またはprem Aプールを設計するためのその他の関心領域をダウンロードします。目的のウィンドウを選択し、読み取り長が 30 ヌクレオチド、読み取り時間が 20 ヌクレオチドでオーバーラップするように計算的にウィンドウを並べて、各オリゴが前のオリゴから 10 ヌクレオチドシフトされるようにします。これで、30ヌクレオチド長オリゴが定義され、それぞれがユニバーサルプライマー配列を持つ側面に定義されます。

オリゴをAgilentに提出し、カスタムオリゴヌクレオチドマイクロアレイに印刷します。マイクロアレイが到着したら、アレイカバースライドをアレイハイブリダイゼーションチャンバーに置き、500マイクロリットルの脱イオン水をスライド上に静かにピペッティングすることにより、その表面からDNAオリゴを回収し始めます。マイクロアレイスライドを下向きにしてカバースライドの上に置き、各スライドのラベルが互いに向き合うようにし、オリゴ回収プロセスを中断する可能性のある気泡を避けるように注意してください。

ハイブリダイゼーションチャンバーを閉じ、ハイブリダイゼーションオーブンで摂氏99度で一晩回転させます 翌日、チャンバーからアレイを慎重に取り外し、アレイ表面から遊離したオリゴを含む水を引き抜きます。放出されたオリゴのプールを1.5ミリリットルのeinorチューブに入れ、超音波処理して50%振幅で潜在的な塊を3回、毎回3〜5秒パルスで分解します。次に、末端にTプロモーターを付加したユニバーサルプライマーを用いた低サイクルPCRにより、プールを増幅します。

必要なサイクル数は、オリゴ回収の効率によって異なる場合があります。アクリルアミドゲルに汚れたバンドとして見える過度の増幅は避けてください。最後に、Amonのメガショートスクリプトキットを使用してRNAを転写します。

RNAのフェニルクロロホルム抽出により転写反応を終了し、続いて酢酸ナトリウムとグリコブルーを担体として使用してエタノール沈殿を行います。Resusは、RNAペレットを105マイクロリットルのTEバッファーに懸濁します。RNAの濃度を正確に決定するため。

リボグリーンを使用して標準曲線を生成します。次に、蛍光プレートリーダーを使用して測定します。これで、RNAプールはプルダウンを開始するための共免疫沈降の準備が整いました。

まず、プロテインAとプロテインGダイナビーズを1対1の比率で組み合わせて、反応あたりの最終容量を50マイクロリットルにして磁気ビーズを調製します。上清を取り除くために、磁気分離スタンドを使用してビーズを一箇所に濃縮します。次に、2回目の洗浄後、等量の冷たい1つのXPBSで2回洗浄します。

同様に、ビーズを等量の冷たい1つのXPBSに懸濁し、抗体ペリオンの2ナノグラムを追加します。この量は抗体によって異なるため、抗体をビーズに結合する最適な条件を見つけるために実験が必要になる場合があります。回転するプラットフォーム上で、混合物を摂氏4度で一晩インキュベートします。

午前中に、超音波処理した酵母全RNAの反応ごとに2マイクログラムを加えて非特異的結合をブロックし、摂氏4度でさらに30分間回転させます。ブロッキング手順が完了したら、再度、磁気ラックを使用して上清を取り除きます。次に、ビーズを冷たい1つのXPBSで2回洗浄し、2回目の洗浄からPBSを残し、ビーズ混合物の50マイクロリットルを新しいチューブに分注します。

co IP反応ごとに1本のチューブ。これで、ビーズはcoipの準備が整いました。次に、RNAオリゴプールと核細胞抽出物を組み合わせてマスターミックスを調製します。

RNPソースとして、マスターミックスの50マイクロリットルのアリコートを総サンプル保護プライマーとして取ります。これは、プライマー配列へのタンパク質の結合またはRNAへの二次構造の導入を防ぐために、ユニバーサルプライマーのRNAバージョンを添加することができます。共免疫沈降を開始するには、ビーズアリコートから上清を取り除き、残りのマスターミックスの120マイクロリットルにビーズを再懸濁します。摂氏4度で反応を1〜2時間揺さ

インキュベーションの終わりに、ビーズを含む小さなEloquaを各co IPから取り出すことができます。結合効率または特異性をさらに試験するには、残りの反応を磁石に置き、上清を除去します。その後、冷たい1つのXPDSで1〜2回の洗浄を行います。

RNPを介してビーズ上の抗体に結合したRNAがIPサンプルです。0.1 XTEバッファー中の50マイクロリットルの1%SDSにIPビーズを再懸濁し、サンプルを摂氏65度で15分間加熱します。RNAを溶出するには、以前にビーズに結合していたRNAを含む上清を除去し、フェニルクロロホルム抽出によって洗浄した後、エタノール沈殿を行い、ペレットを50マイクロリットルの0.1XTバッファーに再懸濁します。

次に、リバースユニバーサルプライマーを使用してサンプルを逆転写します。次に、ユニバーサルプライマーでサンプルをPCR増幅し、そのうちの1つにTセブンプロモーターが含まれている必要があります。プールを増幅するために必要なサイクル数は、co IPの効率によって異なります。

ambionのmega shortsスクリプトキットを使用して、サンプルを再度転記しますが、今回はキットに付属のT seven UTPの代わりに2マイクロリットルのアミノ対立遺伝子UTPを追加します。アミノ対立遺伝子UTPは、後でサイドアイでRNAを標識するために使用されます。文字起こしが完了したら。

フェニルクロロホルム抽出物とエタノールがサンプルを沈殿させます。グリコブルーや酢酸アンモニウムは、サンプルのアレイへのハイブリダイゼーションを妨げる可能性があるため、使用しないでください。Resusは、ペレットを4.5マイクロリットルの0.1モル炭酸ナトリウムに懸濁します。

最初にサンプルを標識するには、2.5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を全サンプルに加えます。3マイクロリットルのS3を追加し、3マイクロリットルのSCI 5でIPサンプルに追加します。暗闇の中で1時間インキュベートします。

室温で、各サンプルに6マイクロリットルの4モルヒドロキシルラミンHCLを加えて反応を終了し、十分に混合して遠心します。室温で、標識されたサンプルをフェニルクロロホルム抽出で精製し、続いてエタノール沈殿します。ほとんどの色は遊離ヌクレオチドとともに有機相に引き下げられるため、ペレットは目に見えて着色しない場合があります。

Resusは、各ペレットを50マイクロリットルの0.1 XTEに懸濁します。Agilentアレイハイブリダイゼーションキットの指示に従って、マイクロアレイサンプルを調製しますが、次の例外があります。RNAをフラグメント化しないでください:フラグメンテーションバッファーを追加した後、すぐにハイブリダイゼーションバッファーを追加してフラグメンテーションを停止します。

サンプルをアレイに置き、アレイが回転している間に摂氏50度で3時間ハイブリダイズします。次の50ミリリットル溶液を50ミリリットルの円錐管に調製します。2つの過剰なSCバッファーの1つのチューブ、1つの過剰な海のバッファーの2つのチューブ、および脱イオン水の1つのチューブ。

3時間のインキュベーション後、アレイスライドサンドイッチを慎重にクランプ解除し、2つのXSSCバッファーに入れます。ピンセットを使用します。アレイをカバースライドからそっと離します。

アレイに触れないように注意しながら、カバースライドをそっと取り外します。スライドが引き出されたら、円錐形を閉じ、60秒間静かに反転させます。ピンセットを使用して、アレイを1つのXSSCソリューションに移します。

チューブにキャップをし、1分間静かに反転させます。次に、アレイを2番目のXSSCソリューションに移し、再度、さらに1分間静かに反転します。最後に、アレイを脱イオン水のチューブに移し、30秒間静かに反転させます。

スライドの端をキムワイプの上に置いて、アレイを乾かします。ワイプでアレイを回転させ続け、オリゴを含む側を乱さないように注意してください。アレイを空の円錐形のチューブに入れ、アレイのスキャンに進みます。

アレイのスキャンに進みます。以下は代表的な配列です。各フィーチャーまたはオリゴは、未濃縮プールの合計を示す緑色、またはIP濃縮プールを示す赤色で表示されます。

各フィーチャの信号は、そのチャネルの合計強度に正規化されます。最終的な出力は、赤チャンネルと緑チャンネルの対数比です。配列上の各特徴で、各ゲノム座標の平均スコアが指定された位置にマップされます。

この平均化ステップの図は、スコアが2、4、および0.5の3つの重なり合う30ヌクレオチドオリゴについて示されており、各10ヌクレオチドウィンドウの平均濃縮スコアが示されています。これは、CLTA遺伝子遺伝子の特徴が下部に沿って与えられ、PTP結合Sの対数平均濃縮スコアが暗赤色の垂直バーで表されているCLTA遺伝子追跡結合タンパク質PTBの結合スキームの例です。明るい赤色のバーは、PTP バインディングでエンリッチされていない領域を示します。

私はちょうど、代替的にスライスされた軸索のような関心のある領域間でタイリングするオリゴヌクレオチドプールを迅速かつ効率的に作成する方法を示しました。私たちはマイクロアレイでプールを解析しますが、イルミナス、Lexiシーケンシング、またはより伝統的なサンガーシーケンシングのいずれかでシーケンシングすることも可能です。この手順を実行するときは、プールの作成がRNAレベルまたはタンパク質レベルのいずれかで修飾される可能性があることを覚えておくことが重要です。

RNAレベルでは、オリゴヌクレオチド配列に自家領域、疾患変異、多型、またはランダム変異を導入できます。タンパク質レベルでは、RNA結合因子はリン酸化またはその他の翻訳後修飾によって修飾できます。また、結合環境を操作して、目的のRNA結合タンパク質と競合または相互作用する追加の因子のレベルを増加または減少

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。