電位感受性色素を用いてモルモット腸ネットワークにおける電気活動の光学的記録

このビデオでは、電位感受性色素D-4ANEPPDHQを用い、電気刺激を与えた腸管神経系標本の解剖およびその後のイメージングについて解説します。安楽死させたモルモットから腸管の一部を採取し、光学記録を行うために、まず粘膜下層を、最終的に筋層間神経叢を露出させる解剖を行います。高解像度の初期画像を撮影した後、D-4ANEPPDHQで染色し、固定した組織に電極を配置します。

電気活動を示す光学的な変化を高速度カメラで記録します。高速度撮影中に電気刺激を印加します。その後、高解像度画像を高速度カメラのピクセルマップに重ね合わせ、neuro plexを用いて解析します。

こんにちは、私はブライアン・サルズバーグです。ペンシルベニア大学神経科学科にある細胞光学研究室（Laboratory of Cellular Optics）、通称 loco のディレクターを務めています。私はアナリア・オビデです。私も細胞光学研究室のメンバーです。

本日は、電圧感受性色素を用いて、無傷の哺乳類神経ネットワークから電気活動を記録する手順をご紹介します。この手法を用いて、「第二の脳」または「腸の脳」とも呼ばれる腸管神経系を構成する2つのネットワーク内およびネットワーク間の神経接続性を研究します。それでは始めましょう。

isof fluorineの吸入麻酔を施し、頚椎脱臼させた150～200 g（または2～3週齢）のHartley guinea pigから小腸を摘出し、粘膜下および腸管神経叢調製液の準備を開始します。次に、温めて酸素飽和させたM1 99 DM溶液で管腔内を洗浄し、腸の内容物を除去します。極性を保持していることを確認しながら、8～10 cmの長さで腸管セグメントを切断します。

室温のM1 99 DMが入った、sardコーティング済みの10 centimeterガラス皿に移します。皿を暗視野照明を備えた解剖顕微鏡に設置します。次に、はさみを用いて腸間膜縁を切開し、昆虫ピンを使用して腸管セグメントの粘膜側を上にして固定します。

ピン留めした後に組織が長方形になり、粘膜下神経叢（vii）の列が規則的に並ぶよう、均一なテンションを維持することが極めて重要です。ストレートチップの微細デュモンピンセットをほぼ水平に保持します。腸管セグメントの一端でviiを掴み、組織の長軸方向に沿って引いて粘膜を剥離します。粘膜下神経節と粘膜下血管を含む粘膜下層を露出させるため、粘膜のリボン状組織を分離し続けます。

次に、非常に精細な剪刀を用いて、輪状筋線維の走行に沿って粘膜下層に切開を加えます。その後、精細鉗子で粘膜下層を非常に慎重に持ち上げながら、輪状筋を押し下げます。剪刀を層に沿って挿入し、縦方向の端に沿って切断します。

分離が進むにつれて、粘膜下層を準備物の残りの部分から切り離します。次に、円形筋線維の方向に従い、1回目から1.5〜3 cm離れた位置で2回目の切断を行い、粘膜下層準備物の最終的なサイズを決定します。得られた粘膜下層セグメントは厚さが 30〜50 µm であり、薄い膜のような外観を呈しています。これを、新鮮なM1 99 DMを入れた別のSylgardディッシュに移し、張力がかからないように静かにピンで固定します。

その後、ディッシュを室温の酸素供給チャンバー内に置き、後で使用します。この時点で、元の腸管セグメントからは粘膜および粘膜下層が除去され、環状筋が露出しているはずです。このセグメントを用いて、筋層間神経叢を露出させるための筋層間神経叢標本を作成します。

ストレートチップの微細ピンセットを使用して、プレパレーションの両側から繊維束を剥離させ、環状筋層を可能な限り除去します。露出した筋間神経叢は、縦走筋層およびその下のCIから分離することはできません。筋間神経叢のプレパレーションを、酸素飽和M1 99 Mを含む新しいサルガードコートディッシュに移します。次に、生存筋を含むサンプルを軽くピンで固定します。光学実験の数分前に、筋収縮を防ぐため2 µMのnefeを含むM1 99 DMが満たされた、より小さい新しいサルガードコートディッシュにプレパレーションを移し、周囲に複数の極細ピンを慎重に配置してしっかりと固定します。

張力が均一に分散し、組織がシルガードの底面に完全に密着していることを確認します。これで、組織標本の生理学的実験の準備が整いました。ガラスバイアルに、2 µMのニフェジピンを含むM1 99 M溶液を用いて、5～50 µg/mLのDAI four A-N-E-P-P-D HQ保持溶液を調製し、アルミホイルで遮光します。

ストック溶液由来のエタノールは、調製物を満たしているニフェジピン含有M1 99 DM溶液に対して0.5%未満となるようにし、これを調製した染色液に置換します。組織を完全に覆う十分な量のラダーを用い、インキュベーション後、室温で10～30分間インキュベートします。チャンバーの内容物をすべて入れ替えることで、酸素供給されたNEFE含有M1 99 Mで調製物を洗浄します。

電気刺激標本における神経活動の光学的な記録は、イメージスプリッターを搭載した正立エピ蛍光顕微鏡、低解像度精密高速カメラ、高解像度白黒カメラ、コンピュータ制御の刺激発生装置、およびマイクロマニピュレーターで構成されるシステムを用いて行われます。装置全体はアクティブ制振台の上に設置され、空気伝播振動を最小限に抑えるため、厚手の遮音カーテンとマイラー製の屋根で囲まれています。2台のカメラからの画像取得は、neuro plexとGlobal Lab image two、またはその他の画像取得ソフトウェアを同時に実行する1台のコンピュータで可能ですが、本構成では、光学実験を開始するために、それぞれ独立したカメラを制御する2台のコンピュータを使用しています。

染色済みのパンニングサンプルが入ったチャンバーを顕微鏡ステージ上に置きます。D four A および EPPD HQ は、脂質環境下でのみ蛍光を発する膜不透過性染料であるため、染色した腸管組織標本中の健全なニューロンは、20 x 以上の倍率で観察した際に、空の風船のような外観を呈します。励起には HQ 5 35 50 フィルター、蛍光には HQ 5 72 LP フィルター、および 5 65 nanometer ダイクロイックミラーを使用します。

次に、マイクロマニピュレーターを用いて、組織の口側端にマルチバレル線形マトリックスアレイ電極を配置します。この際、電極が顕微鏡対物レンズに接触しないように注意してください。1 cmの範囲に10本のタングステン電極が配置された線形マトリックスアレイは、複数の独立した神経経路を刺激することが可能であり、相互接続された神経節回路の研究に適しています。ただし、代表的なデータについては、自作の2リード刺激電極を使用しました。

機能的な記録を行う前に、タッキーワックスを用いてチャンバーの反対端に接地電極を配置します。可視化を容易にするため、電気活動を記録する領域の高解像度白黒画像を取得してください。蛍光が暗く表示されるように、グレースケールを反転させても構いません。コンピュータ制御の刺激発生装置を用いて電流刺激を適用するには、まず適切な強度、持続時間、周波数、刺激回数、および光学データ取得開始からの遅延時間を設定して、デバイスをプログラムしてください。

刺激が光学データ収集の範囲内で行われるように、刺激発生器をneuro plex制御デバイスとして構成します。次に、フレームレート、フレーム数、およびカメラゲインを指定して、neuro plex内で収集パラメータを設定します。活動電位のアクションを完全に定義するには、フレームレートを最低1 kHzに設定する必要があります。

D four AおよびE-P-P-G-H-Qは、脱分極に伴い電圧変化に線形に相関して蛍光強度が減少するため、NeuroPlex内で光学信号の表示を反転させ、活動電位が上下逆さまに表示されないようにしてください。データ収集を開始します。各機能的記録を行う前に、各視野の高解像度白黒画像を新たに取得することを忘れないでください。

データ取得が完了したら、NeuroPlexを使用してオフラインで結果を解析します。「ページディスプレイ」と呼ばれる画面領域に、80×80高速カメラで撮影されたプレパラートの粗い画像が個々のフレームとして表示されます。ページモードを「絶対フレーム（absolute frame）」に設定すると、NeuroPlexのディスプレイコマンドにより、2台目のカメラで取得した高解像度画像が粗い画像のピクセルマップ上に重ねて表示されます。

これには、ページモードを absolute trace から traces に変更し、display コマンド内で superimposed image を選択する必要があります。マウスを使用して、ページディスプレイに表示されている画像から個々のピクセルまたはピクセルグループを選択します。これらの関心領域（ROI）の出力は、トレースディスプレイウィンドウ内にトレースとして表示され、それらのピクセルによって記録された光学的変化の大きさが時間の関数として明らかになります。

高解像度画像のグレースケールを反転させることで、トレースモードページの表示における視認性が向上します。また、スティミュレーターからのアナログ出力を表示することを強く推奨します。トレース表示ウィンドウに含めるためのアナログ出力チャンネルを選択してください。この出力により、実験中に適用された刺激の正確なタイミングが示されます。

データを動画として閲覧するには、neuro plex内のムービーコマンドを使用し、蛍光強度の最大変化量および最小変化量に合わせて調整された擬似カラースケールを用いて、データセット内の連続フレームを表示します。DIA four A-N-E-P-P-D-H-Qで染色した筋層間神経叢プレパレーションから採取した神経節を、高解像度カメラと60 x 対物レンズで撮影しました。データ取得中、プレパレーションには40 hertzで5回のパルス列による刺激を与えました。

各パルスの振幅を15 milliamps、持続時間を0.5 millisecondsとして、4つの関心領域（ROI）を特定し、選択した領域で平均化した光学データを表示するためのトレースを作成しました。擬似カラーフレームシーケンスにおいて、膜脱分極を示す最初の光学応答領域は黄色から赤色として現れ、神経活動を示しています。これらのデータは、刺激によって誘発された活動が各神経節の離散的な領域で発生しており、その大部分が通過軸索によるものであることを示しています。ROI 2、3、および4は、ROI 1から様々な距離にある個々のニューロンを特定しています。

図2は、情報が伝播する解剖学的経路を10倍の倍率で示したものです。矢印は、特定された筋層間神経節を活性化させる刺激の方向を示しています。ここでは、電位感受性色素を用いて電気活動を記録するための光学系の構成要素と、この技術を内臓神経系に適用することで、顕微鏡下で2つの無傷の哺乳類ネットワーク内およびネットワーク間の機能的結合性を研究できる可能性について説明しました。光学的な記録技術を使用する際は、細部に細心の注意を払うことが非常に重要です。

光学的、機械的、および電気的なノイズ源を慎重に制御し、プレパレーションの状態を細心の注意を払って維持する必要があります。したがって、光学記録を成功させるには、本プロトコルの個々の全ステップを完全に習得することが不可欠です。以上になります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を心より願っております。