人間のDNA修復タンパク質の遺伝的研究は、モデルシステムとして酵母を使用

WRNプラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ細胞1およびMLUプラスミドで消化され、フラグメントはゲルから精製されます。細胞1からMLU1へWN断片で消化されたこれらの発現ベクターは、酵母ベクターの細胞1からMLUへ1部位にライゲーションされる。マルチコピープラスミドには、TRP 1つの選択可能なマーカーも含まれています。

W Rrnコンストラクトは、標準的なプロトコルに従って酵母に形質転換され、形質転換体は合成完全グルコース培地であるトリプトファンが不足している上で選択されます。次に、個々の形質転換体をトリプトファンを欠損した合成完全グルコース培地にストライクし、マスタープレートからプレートをインキュベートします。WRN形質転換SGSにおける成長の遅い表現型の回復を分析するために、上位3つの二重変異株形質転換体をグルコースまたはガラクトース含有プレート上に縞模様にします。

HUおよびMMSに対するWRN発現の影響を分析するために、感度スポッティングは、WRN発現酵母細胞の細胞周期分布を決定するために行われます。DAPI染色を行います。異種宿主におけるWRNの発現は、Western Blood Analysisによって分析されます。

こんにちは、国立衛生研究所(NIH)の研究所の一つである国立老化研究所の分子老年学研究室のDNAヘラ症例のセクションのロバート・ブロッホです。こんにちは、国立老化研究所の分子遺伝学研究室のDNAヘリケースのセクションから来たモニカ・アガルワルです。ヒトDNA修復タンパク質と遺伝的経路の役割を理解することは、多くの研究者にとって手頃な課題です。

哺乳類のシステムにおける遺伝学的研究は、変異遺伝子細胞株、調節発現システム、適切な選択マーカーなど、容易に利用できるツールがないため、制限されてきました。本日は、ヘリカーゼと呼ばれるDNA巻き戻し酵素の分子的および細胞的機能を調べるためのモデルシステムとして、酵母を用いた早期老化の予防に関する手順をご紹介します。当研究室では、これらの手順を用いて、早期老化障害におけるDNA修復やゲノム安定性の維持に欠陥のあるヒトバーナー遺伝子産物の役割を遺伝的に解明しています。

ヴェルナー症候群 ヴェルナーは、東部の5つのヒトリクチャーファミリーヘリケースの1つです。sgsという名前のものは1つだけで、1つは複製ストレス応答における人間のWernerの役割を研究するものです。我々は、東変異体の背景におけるWerner発現が様々な生物学的エンドポイントに及ぼす影響を調べた。

それでは、始めましょう。酵母を異種宿主として使用するため、最初のステップは、ヒトWerner遺伝子またはその分散を酵母ベクターにクローニングすることです。ヴェルナープラスミドは、エンドヌクレアーゼSal oneおよびMLU oneの制限付きで消化され、精製された断片を精製し、その後、ガロン誘導性プロモーターの調節下にある酵母発現ベクターのSal one MLU one部位にライゲーションするものとする。

マルチコピープラスミドには、TRP 1つの選択可能なマーカーも含まれています。次に、これらのWerner発現プラスミドを、この研究で使用した適切なトリプトファン熱帯酵母株に変換します。そして、形質転換体は、懸濁液を合成全グルコース培地に播種することによって選択されます。

トリプトファンが不足している場合は、コロニーが現れるまで3〜4日間、プレートを摂氏30度でインキュベートします。コロニーがストリークに成長したら、合成完全グルコース培地上の個々の形質転換体を完全グルコース培地に添加し、プレートを摂氏30度で2〜3日間インキュベートします。次に、ヒトweer遺伝子とその変異体を発現する変異ye株を、次のセクションで示す技術によって細胞表現型について調査します。

上位3つの変異体は、重度の成長障害を示しています。しかし、SGS 1遺伝子の変異は、上位3つの変異体の遅い成長表現型を抑制し、野生型S Gs oneまたはS Gs one 上位3株の増殖に対するWerner発現の影響を調べるために、トリプトファンを欠いているが、陽性対照として2%グルコースまたは2%ガララクトースのいずれかを含む合成完全培地プレート上に、ベクターまたはWerner発現プラスミドで対応する株を連鎖させます。SGSの1発現の効果が認められ、プレートを30°Cで2日間インキュベートしました。

野生型とSGS 1変異株をベクターまたはヴェルナーで形質転換した変異株は、成長パターンに違いを示さない。しかし、Wernerは、S GSの1つのトップ3の二重変異株よりも大幅に遅く成長します 1つのトップ3の二重変異体 ベクターで変換して、ワーナーの機能要件を評価します 遅い成長表現型を回復するための。sgsでは、1つのトップ3バックグラウンドストリークsgsが、ワーナー触媒ドメイン変異体で2日後に2%グルコースまたは2%ガラクトースのいずれかを含むトリプトファンを欠く合成完全プレートに形質転換した1つのトップ3株です。

インキュベーション Werner エキソヌクレアーゼ変異体 E 84 A は、Werner と同様に低成長の表現型を回復させ、エキソヌクレアーゼ活性が高成長の表現型の回復に必要ではないことを示しています。Werner Helicase変異体はよく成長し、したがって、Werner Helicase活性が上位3つの遅成長表現型の回復に必要であることを示しています。Wernerがsgsの成長率に影響を与える能力を判断するため。

タンパク質発現線条のレベルが低い1つのトップ3株は、ベクターWernerまたはsgsで形質転換された1つのトップ3株を、トリプトファンを欠いているが、ガラクトースの濃度が増加する合成完全なプレートに1つ。すべてのプレートを摂氏30度で2日間インキュベートします。ワーナーとワーナーエキソヌクレアーゼ変異体は、ガラクトースのすべてのレベルで表現型を持つ上位3つの傾きを回復します。

しかし、ワーナー・ヘリカーゼの変異体はそうではありません。SGS one top three double mutantは、DNAアルキル化剤メチルメタンスルホン酸またはMMS、または複製阻害剤であるヒドロキシ尿素またはHUに対する上位3つの単一変異体よりも感度が低いことが示されており、SGS oneまたはS GS one top three株のMMSおよびHE感受性に対するワーナー発現の影響を決定します。ベクターまたはヴェルナーで変換された酵母株を、トリプトファンを摂氏30度で欠く合成完全ラフィノース培地にコントロールとして変換します。

ベクターで形質転換した野生型の親株を使用し、トリトファンを欠く合成完全ラフィノース培地ですべての培養物に再接種し、摂氏30度で早期の対数期まで成長させます。培養物が初期の対数段階にあるとき、10ミリモルHUまたは0.0025%MMSを含むトリプトファンプレートを欠くトリプトファンプレートを欠く合成完全GAL培地に各希釈のトリトファンスポット4マイクロリットルを欠く合成完全培地を使用して、これらの株の10倍までの10倍連続希釈を準備し、プレートを摂氏30度で4日間インキュベートします。野生型SGSで形質転換するSGSのワントップ3ダブルミュータント。

1つは、細胞周期のSG後期2期に遅延し、ダンベル型の形態になります。対照的に、野生型酵母は細胞分裂を完了し、Werner形質転換sgsの細胞周期分布を研究するためのダンベル形状の細胞を少なくします。まず、トリプトファンを欠く合成完全RAF培地で、以下の菌株の対数的に増殖する培養物を摂氏30度で一晩成長させます。

SGS 1 トップ 3 をベクター Werner または SGS 1 で変換し、ベクター変換したワイルドタイプの親株を OD 0.05 で培養に再接種します。再接種後、培養物をOD 0.5まで成長させ、遠心分離により収穫すると、次に2%濃度のガララクトースを添加することによりヴェルナー発現が誘導されます。培養物が摂氏30度で6時間成長するのを待ちます。

6時間後、培養物を回収し、遠心分離により細胞を採取します。遠心分離後、培養物をマイクロ遠心チューブに移し、細胞をPBSで一度洗浄します。次に、固定細胞をPBSで2回洗浄した後、室温で70%エタノールに細胞を20分間固定し、1つのXPBSで細胞を再懸濁します。

セル懸濁液をスライド上に置き、ベクターシールドを追加します。DAPIを含有する封入剤を1ミリリットルあたり1マイクログラムの濃度で調製します。XI Saxo vert顕微鏡でスライドを検査し、細胞周期のSG二期の酵母細胞の特徴であるダンベル型の核を持つ細胞を探します。

形質転換SGS oneまたはSGS one top 3酵母株におけるWernerタンパク質の発現またはその分散を決定すること。まず、ガラクトース含有培地で菌株を6時間増殖させ、Wernerタンパク質の発現を誘導します。遠心分離により細胞を採取した後、PBSで洗浄し、再懸濁してください。

アルカリ性溶解バッファー。細胞を5分間煮沸した後、遠心分離により清澄化し、1モル塩酸で中和します。これらのライセートは、8〜16%ポリアクリルアミドSDSゲルで電気泳動する準備ができており、さまざまな濃度のガラクトースの影響下でのワーナータンパク質の発現レベルを決定します。

まず、さまざまなガラクトース濃度の培養物を6時間誘導します。次に、遠心分離によって細胞を回収し、プロテアーゼ阻害剤を含むフグに再懸濁します。混合物に425〜600ミクロンのガラスビーズを加え、高速でボルテックスを1分間ボルテックスし、続いて1分間アイシングすることにより細胞を切断します。

合計8回繰り返します。次に、得られたホモジネートを15, 000Gで5分間遠心分離し、上清画分を収集します。ブラッドフォード法によりライセート画分中のタンパク質量を測定した後、8〜16%のポリアクリルアミドSDSゲル上の等濃度のタンパク質を分離し、Wernerの発現をsgs中のウェスタンブロットWernerの発現により決定します。

トップ3が1つあると、これらの写真に示すように、トップ3のゆっくりとした成長の表現型が回復します。sgs 1つの上位3株をベクターWernerで形質転換するか、2%グルコースまたは2%ガラクトースのいずれかを含むSCトリプトファンプレート上に1つのストリークをsgsすると。Wernerのガラクトース誘導発現により、SGS one top three 株の増殖が遅くなります。

対照的に、野生型の親株またはWernerで形質転換されたSGS One株は、その成長に影響を受けず、Wernerによって付与されるゆっくりとした成長がsgsに特異的であることを示しています。1つのトップ3の背景。SGSでは、Wernerの変異体で形質転換した上位3株の1つを、2%グルコースまたは2%ガラクトースのみを含むSCトリプトファンプレート上にスリークしました。

エキソヌクレアーゼで死んだヴェルナーは、まだ成長の遅い表現型を回復することができました。これは、Werner ATPaseヘリカーゼ活性が必要であり、エキソヌクレアーゼ活性は必要ではないことを示しています。SGSの1つのトップ3の背景で、WernerはGAL濃度範囲全体でSGSの1つのトップ3の遅い成長表現型を復元しました。

これらの結果は、sgs one top three 変異体バックグラウンドにおける低成長表現型の回復が、低いWernerタンパク質発現レベルで起こることを示しています。sgsの培養物を対数的に増殖させると、Wernerまたはその変異体で形質転換した上位3つの菌株が、グルコースまたはガラクトース、およびMMSまたはHUを含むSCトリトファンプレートに10倍の段階希釈で発見されました。Wernerの発現は、MMSとSGSの2つの感度、1つのトップ3株を増加させることを観察しました。さらに、SGSの1つのトップ3バックグラウンドのMMSおよびHU感度に対するこの影響は、ヴェルナーATPのヘリカーゼを必要としますが、エクソンクリーズ活性は必要ありません。

最後に、Wernerの発現は、大きなバテッドセルの集団の増加によって示されるように、トップ3の特徴的なSG2遅延も回復します。sgsでは、Wernerを発現する上位3つの変異細胞があります。sgsと比較すると、ベクター細胞で形質転換された上位3つの細胞をDabiで染色しました。

原子核を視覚化すると、矢印は未分割の原子核ヴェルナー表現を示しています。形質転換されたsgsでは、示されたガラクトース濃度を添加することにより、上位3つの細胞を1つ誘導し、誘導の6時間後に細胞を回収しました。8〜16%ポリアクリルアミドSDSゲルに等量の全細胞ライセートをロードした後、抗ワーナー抗体を用いたウェスタン血液検出を行いました。

私たちは、定義された酵母変異体の背景に関連する細胞表現型を調査し、その触媒活性とタンパク質相互作用によって媒介されるヒト学習者遺伝子の細胞および分子機能を明らかにする方法を示しました。酵母は、定義された経路における遺伝子の機能を研究するためのモデル生物として使用できます。これらの手順を行う際には、定義された経路で調査中の遺伝子の役割を識別するために、適切な酵母変異体の背景を選択することが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。