人間のDNA修復タンパク質の遺伝的研究は、モデルシステムとして酵母を使用

WRNプラスミドを制限内切酵素Cel IおよびMlu Iで消化し、ゲルから断片を精製します。Cel IからMlu IまでのWRN断片で消化したこれらの発現ベクターを、酵母ベクターのCel IおよびMlu Iサイトにライゲーションします。このマルチコピープラスミドには、TRP1選択マーカーも含まれています。

W Rrn構築物を標準的なプロトコルに従って酵母に形質転換し、トリプトファン欠損合成完全グルコース培地で形質転換体を選抜します。次に、個々の形質転換体をトリプトファン欠損合成完全グルコース培地にストリークし、マスタープレートからプレートをインキュベートします。WRN形質転換SGS one top three二重変異株における緩慢増殖表現型の回復を解析するため、形質転換体をグルコースまたはガラクトース含有プレートにストリークします。

WRNの発現がHUおよびMMS感受性に及ぼす影響を解析するため、WRN発現酵母細胞の細胞周期分布を決定するスポッティング法を行います。次に、DAPI染色を実施します。異種宿主におけるWRNの発現は、ウェスタンブロット解析によって解析します。

こんにちは。私は国立衛生研究所（NIH）傘下の国立老化研究所、分子老年学研究室のDNAヘリカーゼセクションのロバート・ブローチです。こんにちは。私も同じく国立老化研究所、分子老年学研究室のDNAヘリカーゼセクションのモニカ・アガルワルです。ヒトDNA修復タンパク質および遺伝的経路の役割を理解することは、多くの研究者にとって困難な課題となっています。

哺乳類システムにおける遺伝学的研究は、変異遺伝子細胞株、調節発現システム、適切な選択マーカーなど、容易に利用可能なツールの不足により制限されてきました。本日は、早老症の予防におけるヘリカーゼとして知られるDNAアンワインディング酵素の分子および細胞機能を調査するための、モデルシステムとしての酵母を用いた手順について解説します。当研究室ではこれらの手順を用いて、早老症疾患においてDNA修復およびゲノム安定性の維持に欠陥があるヒトburner遺伝子産物の役割を遺伝学的に特徴づけています。

ウェルナー症候群のWernerは、酵母における5つのヒトRecQファミリーヘリカーゼの一つです。ヒトWernerの複製ストレス応答における役割を研究するために、sgs1欠損株を用いた研究が行われています。我々は、酵母の変異体背景におけるWerner発現が、さまざまな生物学的エンドポイントに及ぼす影響を検証しました。

それでは、始めていきましょう。ここでは異種宿主として酵母を使用するため、まず最初のステップとして、ヒトのWerner遺伝子またはその変異体を酵母ベクターにクローニングします。Wernerプラスミドを制限内切酵素Sal IおよびMlu Iで消化し、精製した断片を、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下にある酵母発現ベクターのSal IおよびMlu Iサイトにライゲーションさせます。

このマルチコピープラスミドには、選択マーカーとしてTRP1も含まれています。これらのWerner発現プラスミドを、本研究で使用した適切なトリプトファン要求性酵母株に形質転換させます。そして、懸濁液を合成完全グルコース培地に塗布し、形質転換体を選択します。

トリプトファン欠乏培地を用い、コロニーが出現するまで30°Cで3〜4日間培養します。コロニーが生長した後、個々の形質転換体を合成完全グルコース培地にストリークし、30°Cで2〜3日間培養します。その後、ヒトWEER遺伝子およびその変異体を発現する変異酵母株について、以降のセクションで説明する手法を用いて細胞表現型を解析します。

上位3つの変異体は深刻な増殖不全を示します。しかし、SGS1遺伝子の変異は、上位3つの変異体の増殖遅延表現型を抑制します。Wernerの発現が野生型SGS1株またはSGS1上位3つの変異株の増殖に及ぼす影響を調べるため、対応する各株を、ベクターまたはWerner発現プラスミドとともに、トリプトファンを欠き、2% glucoseまたは2% galactoseを含む合成完全培地プレートにストリークし、ポジティブコントロールとします。SGS1発現の効果を判定するため、プレートを30°Cで2日間インキュベートしました。

野生型およびベクターまたはWernerを導入したSGS1変異株では、増殖パターンに差は見られません。しかし、SGS1 top 3二重変異株において、Werner導入株はベクター導入株よりも増殖が著しく遅く、遅延増殖表現型の回復におけるWernerの機能的要件を評価することができました。sgs1 top 3背景において、Werner触媒ドメイン変異体を導入したsgs1 top 3株を、2% glucoseまたは2% galactoseを含むトリプトファン欠損合成完全培地にストリークし、2日間培養しました。

E 84 Aと表記されるWerner Exonuclease変異体におけるインキュベーションでは、Wernerと同様に低成長表現型が回復した。これにより、上位3つの低成長表現型の回復にエキソヌクレアーゼ活性は必要ないことが示された。一方で、Werner Helicase変異体は良好に増殖したため、上位3つの低成長表現型の回復にはWernerヘリカーゼ活性が必要であることが実証された。次に、sgsの増殖速度に影響を及ぼすWernerの能力を決定する。

タンパク質発現レベルが低い top three 株 1 つと、ベクター Werner または sgs1 で形質転換した top three 株 3 つを、トリプトファンを欠き、ガラクトース濃度を段階的に上げた合成完全培地プレートにストリークします。すべてのプレートを 30 °C で 2 日間インキュベートします。Warner および Warner エキソヌクレアーゼ変異体は、すべてのガラクトースレベルで top three slope 表型を回復させます。

しかしながら、Werner Helicase変異体ではそうではありません。SGS1 top three二重変異体は、DNAアルキル化剤であるメチルメタンスルホネート（MMS）または複製阻害剤であるヒドロキシウレア（HU）に対し、top three単一変異体よりも感受性が低いことが示されています。SGS1またはSGS1 top three株のMMSおよびHU感受性に対するWerner発現の影響を調べるため、コントロールとして、ベクターまたはWernerを導入した酵母株を、トリプトファン欠損の合成完全ラフィノース培地にて30 °Cで培養します。

ベクターで形質転換した野生型親株を用い、トリプトファン欠損合成完全ラフィノース培地ですべての培養物を再接種し、30 °Cで対数増殖期早期まで培養します。培養物が対数増殖期早期に達したら、トリプトファン欠損合成完全培地を用いて、これらの菌株を10,000倍まで10倍段階希釈します。各希釈液を4 µLずつ、10 mM HUまたは0.0025% MMSを含むトリプトファン欠損合成完全GAL培地プレートにスポットし、プレートを30 °Cで4日間インキュベートします。野生型sgsで形質転換したSGS1-TOP3二重変異体。

一方は細胞周期の後期SG2期で遅延し、その結果、ダンベル状の形態を呈します。対照的に、野生型酵母は細胞分裂を完了するため、ダンベル状の細胞が少なくなります。Werner形質転換sgs1-top3株の細胞周期分布を調べるため、まず、トリプトファン欠損合成完全RAF培地を用いて、以下の株を30 °Cで一晩対数増殖させます。

ベクターWernerで形質転換したSGS one top three、またはSGS oneおよびベクターで形質転換した野生型親株を用い、OD 0.05で培養物を再接種します。再接種後、OD 0.5まで培養し、遠心分離により回収します。次に、2%濃度のガラクトースを添加してWernerの発現を誘導します。その後、培養物を30 °Cで6時間培養します。

6時間後、培養物を回収し、遠心分離によって細胞を回収します。遠心分離後、培養物をマイクロ遠心チューブに移し、PBSで一度細胞を洗浄します。その後、細胞を70% ethanolで室温にて20分間固定します。固定した細胞をPBSで2回洗浄した後、1 XPBSに細胞を再懸濁します。

細胞懸濁液をスライドガラス上に載せ、DAPIを1 µg/mLの濃度で含むVector Shield封入剤を添加します。XI Saxo vert顕微鏡を用いてスライドを観察し、細胞周期のSG2相にある酵母細胞の特徴である、ダンベル型の核を持つ細胞を確認します。

形質転換されたSGS oneまたはSGS one top three酵母株におけるWernerタンパク質またはその変異体の発現を決定します。まず、Wernerタンパク質の発現を誘導するため、ガラクトース含有培地で6時間、菌株を培養します。遠心分離によって細胞を回収した後、PBSで洗浄し、再懸濁します。

アルカリ溶解バッファーを用いて溶解させます。細胞を5分間煮沸し、遠心分離によって清澄化した後、1 M 塩酸で中和します。これらの溶解物は、異なる濃度のガラクトースの影響下におけるWarnerタンパク質の発現レベルを決定するため、8～16%ポリアクリルアミドSDSゲルによる電気泳動に供することができます。

まず、さまざまな濃度のガラクトースを用いて、6時間にわたり培養物を誘導します。次に、遠心分離により細胞を回収し、プロテアーゼ阻害剤を含むバッファーに再懸濁します。この混合液に425〜600 µmのガラスビーズを加え、高速で1分間ボルテックスして細胞を破砕し、その後1分間氷上で冷却します。

これを合計8回繰り返します。次に、得られたホモジネートを15,000 Gで5分間遠心分離し、上清画分を回収します。ブラッドフォード法によりライセート画分のタンパク質量を測定した後、同濃度のタンパク質を8〜16%ポリアクリルアミドSDSゲルで分離します。その後、ウェスタンブロット法により、sgsにおけるWernerの発現量を決定します。

これらの写真に示されているように、One top threeはtop threeの緩慢な増殖表現型を復元します。vector Wernerで形質転換したsgs one top three株またはsgs one株を、2%glucoseまたは2%galactoseを含むSCトリプトファンプレートにストリークします。galactoseによるWernerの誘導発現により、SGS one top three株の増殖速度が低下します。

対照的に、野生型親株またはWernerを導入したSGS one株の増殖には影響が見られず、Wernerによってもたらされる増殖遅延がsgs one top three背景に特異的であることが示されました。Wernerの変異体を導入したSGS one top three株を、2% glucoseまたは2% galactoseのみを含むSCトリプトファンプレートにストリークしました。

エキソヌクレアーゼ活性を欠損したWernerは、依然として遅延成長表現型を回復させることができました。これは、top threeの遅延成長表現型を回復させるには、WernerのATPaseヘリカーゼ活性が必要であり、エキソヌクレアーゼ活性は必要ないことを示しています。SGS one top three背景において、WernerはGAL濃度範囲全体にわたってSGS one top threeの遅延成長表現型を回復させました。

これらの結果は、sgs 1-3変異体背景における緩徐増殖表現型の回復が、低レベルのWernerタンパク質発現量で起こることを示しています。Wernerまたはその変異体を導入したsgs 1-3株の対数増殖培養物を、グルコースまたはガラクトース、およびMMSまたはHUを含むSCトリプトファンプレート上に10倍段階希釈してスポットしました。その結果、Wernerの発現によりsgs 1-3株のMMSおよびHUに対する感受性が増大することが観察されました。さらに、sgs 1-3背景におけるこのMMSおよびHU感受性への影響には、WernerのATP依存性ヘリカーゼ活性が必要であり、エキソヌクレアーゼ活性は不要であることが分かりました。

最後に、Wernerの発現は、大型のボタン状細胞の集団が増加していることからわかるように、top threeにおける特徴的なSG two遅延をも回復させます。Wernerを発現しているsgs one top three変異細胞を、ベクターのみで形質転換したsgs one top three細胞と比較し、Dapiで染色しました。

核を可視化し、矢印で未分裂核におけるWernerの発現を示しています。形質転換したsgsにおいて、上位3つの細胞に規定のガラクトース濃度を添加して誘導し、誘導から6時間後に細胞を回収しました。等量の全細胞溶解液を8〜16%ポリアクリルアミドSDSゲルにロードし、抗Werner抗体を用いたウェスタンブロット法で検出しました。

本動画では、ヒトの学習遺伝子がその触媒活性およびタンパク質相互作用を介して果たす細胞内および分子レベルの機能を解明するために、特定の酵母変異体背景に関連する細胞表現型を調べる方法を説明しました。酵母は、特定の経路における遺伝子の機能を研究するためのモデル生物として利用可能です。これらの手順を行う際は、調査対象である遺伝子が特定の経路で果たす役割を識別するために、適切な酵母変異体背景を選択することが重要です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。