変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）
2007年2月25日
こんにちは。私はハーバード大学のフェローで、微生物バイオフィルムコミュニティを研究しているセレステ・ピーターソンです。私は、16S rRNA配列と、その配列が時間的・空間的にどのように変化するかを調べることで、細菌コミュニティのプロファイリングを行っています。そのために、DGGEを用いています。
これは通常のゲル電気泳動ではありません。泳動中は60°Cに維持し、バッファーを連続的にポンプで供給する必要があります。そのため、バッファーが60°Cに達するまで約1時間温めてから、泳動を開始します。次に、このプレートを希釈した洗浄液で洗浄し、不純物を取り除いてから、ライトを点灯させます。
そのようなことが原因でムラが生じることがあります。すべての水分を拭き取ることが重要です。そのため、ゲルの組み立て時には、チップをゲルの外側に配置します。
このように、ゲルの両側を2枚のガラス板で挟み、チップを外側に配置することで、内部のゲルに影響を与えないようにします。それでは、これらのクランプを用いてゲルを組み立て、それらを押し合わせてから、右に回して締め付けます。他のゲルと同様に、底面が密着していることを確認することが重要です。
漏れを防ぐため、ここでゲルを裏返しにして、ガスケットで密閉するためにセットします。この際、プレートがガスケットと正確に揃っていることが重要です。次に、側面のノブを差し込み、下方向に押してシールを固定します。
これは 30 mL シリンジです。この部品とこの部品は Bio-Rad キットに付属しており、このように取り付けます。これは、チューブ内の余分な水を取り除くためのものです。
次に、ゲルに試料を注入するためにチューブをセットします。まず、チューブにアダプターを装着し、さらに針を接続します。その小型アダプターを用いて、底面のガラスのすぐ上の、ゲルのほぼ中央に針を刺します。その後、このワイヤーアダプターを長いチューブに装着し、高密度溶液と低密度溶液が入った2本のシリンジに接続します。
これらはあらかじめ調製した溶液です。青いものは、これが最も変性能の高い溶液であることを示すために染料を加えています。そして、もう一方は最も変性能の低い、低密度の溶液です。これらには必要な成分がすべて含まれています。
それでは、実際には週に2回分を作成します。温度を調整した後、カラムが上昇し始めるまでに、ゲルを充填するための時間は約5〜7分です。ここで、シリンジに溶液を満たします。
溶液を約15 µL充填します。次に、気泡を取り除くため、上下に反転させて、上部の気泡が消えるまでゆっくりと押し出します。ここで、この小さなネジをこの溝に挿入します。
このアダプターをこちらのクランプに合わせて、Cクランプで非常にしっかりと固定します。次に、このチューブをシリンジに取り付けます。反対側の高密度マトリックス側でも同様の操作を行い、注入できる状態にします。
そこで、このホイールを時計回りに一定の速度で回転させます。まず、最も密度が高い青色の溶液が最初に出て、ゲルの底部を形成します。その後しばらくすると、透明な溶液がゲルを満たし始め、グラジエントが形成されます。
角度を緩やかに付けます。ゲルの注入が終わったら、すぐにチューブを洗浄してください。そのままにしておくと重合してしまうためです。次に、そこにあるグループを押し下げます。この小さな部分を、そして反対側でも同様に行います。これで完了です。
こんにちは。私はハーバード大学のフェローで、微生物バイオコミュニティを研究しているセレスト・ピーターソンです。私は16S rRNA配列を解析し、その配列が時間的および空間的にどのように変化するかを調べることで、細菌コミュニティのプロファイリングを行っています。そのために、DGGEを用いています。
DGEとは変性ゲル電気泳動のことです。基本的には、グラジエントが存在し、DNAがそのグラジエントに沿って移動するにつれて変性するという原理に基づいています。そのため、異なる16の種は、グラジエント上の異なる位置で停止します。
これにより、コミュニティ内のさまざまなセクシネス種の指紋のようなパターンが得られます。したがって、私の実験の目的は、コミュニティにどのような種が存在し、それが時間的および空間的にどのように変化しているかを確認することです。セクシネスDDDゲルを走らせ、バンドを切り出すことで、各コミュニティに存在する種を同定することができます。
DDGゲルを作製する際の最大の課題の一つは、最適な勾配を決定することです。そのため、特定のコミュニティに対してどのタイプの勾配が適切か、試行錯誤して検討する必要があります。本日使用するのは35〜55% ureaの勾配です。
この手法で起こりうる大きな問題の一つは、レーンにスミアが現れることです。その対策として、理由はともあれ、ゲルを非常に長い時間走らせることでスミアが消失することがわかりました。本日は一般的な細菌コミュニティに使用していますが、この方法は特定の細菌科を用いて経時的な変化を確認する場合にも利用でき、その場合は非常にクリアなゲルが得られる傾向にあります。
DDGEを用いて、単一遺伝子の変異を調べることも可能です。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本研究では、16S rRNA配列の解析を通じて、微生物バイオフィルムコミュニティ内の細菌コミュニティのプロファイリングに焦点を当てています。また、専門的な手法を用いて、これらの配列が時間的および空間的にどのように変化するかを検討します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物生態学
- バイオフィルムコミュニティ
- 細菌プロファイリング
背景
- 微生物バイオフィルムは、微生物による複雑なコミュニティです。
- 細菌コミュニティのダイナミクスを理解することは、さまざまな生態学的研究において極めて重要です。
- 16S rRNAシーケンシングは、細菌種を同定するための一般的な手法です。
- DDGE（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）は、遺伝的多様性を分析するために使用されます。
研究の目的
- バイオフィルムにおける細菌コミュニティのプロファイリングを行う。
- 時間的および空間的な細菌配列の変化を観察する。
- これらのコミュニティを効果的に分析するためにDDGEを利用する。
使用された手法
- 専用のDDGE装置の準備。
- プロセス中の温度を60℃に一定に維持する。
- 緩衝液を連続的にポンプで送液する。
- 希釈溶液でプレートを洗浄し、不純物を除去する。
主な結果
- 細菌叢のプロファイリングに成功した。
- 16S rRNA配列の時間的変化を記録した。
- 微生物バイオフィルムコミュニティのダイナミクスに関する知見を得た。
- この種の解析において、DDGEが有効であることが証明された。
結論
- 本研究は、微生物コミュニティのダイナミクスに対する理解を深めるものである。
- DDGEは、細菌コミュニティのプロファイリングにおいて有用なツールである。
- 今後の研究では、これらの知見に基づき、生態学的影響を探索することが可能である。
よくある質問
産業界における重要性
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）は、配列依存的な融解挙動に基づいて16S rRNA遺伝子のバリアントを分離することで、微生物コミュニティ組成の高解像度プロファイリングを可能にします。このアプローチは、バイオフィルムやその他の疾患関連システムにおける細菌集団の再現性のある遺伝的フィンガープリントを提供し、抗菌薬探索におけるターゲットバリデーションを支援します。本手法は、コミュニティの変動を機能的な表現型に関連付けることでメカニズム的なリスク低減に寄与し、マイクロバイオーム調節治療薬のリード化合物同定戦略に有用な情報を提供します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： 複雑なコミュニティ内の個々の細菌株を解明することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値： 微生物エコシステムにおける機能的ターゲット検証のための、標準化され再現可能なアウトプットを提供する。
- 予測的価値： 前臨床モデルにおけるコミュニティダイナミクスと表現型のアウトカムを相関させることで、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの即応性： 化合物スクリーニングキャンペーンにおいて信頼性の高いリードアウトとなる、定量可能なバンディングパターンを生成します。
- スケーラビリティ： 制御された勾配および温度条件下で、複数のサンプルの並列処理を可能にします。
- プラットフォームの再利用性： 治療的介入に対する微生物反応の長期的なモニタリングのための、転用可能な手法を確立します。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- 疾患との関連性：微生物コミュニティの構造が病原性や薬剤耐性に影響を与える、バイオフィルム関連感染症の解析を促進します。
- トランスレーショナルな連続性：モデルシステム間で保存された遺伝的マーカーを追跡することにより、探索段階のプロファイリングと前臨床検証を橋渡しします。
- リスク調整後の進展：探索パイプラインの早期段階でマイクロバイオームへのオフターゲット効果を特定することで、Go/No-go判断に根拠を与えます。
パイプラインおよびワークフローの統合
DGGEは、初期のターゲット同定からリード最適化に至るディスカバリー・コンティニュアム（創薬の連続的なプロセス）に適合しており、特にコミュニティレベルの影響が不可欠となる抗微生物薬やマイクロバイオーム標的治療において有用です。
- 探索生物学：環境的または治療的摂動に応答した株レベルの変化を解明することで、仮説検証とパスウェイの明確化を支援します。
- スクリーニング：抗菌剤スクリーニングにおけるアッセイの標準化とヒット化合物の確認に不可欠な、再現性のある定量的アウトプットを提供します。
- 分析：異なる条件下での微生物多様性の比較を可能にする電気泳動プロファイルを生成し、データに基づいた優先順位付けを支援します。
- トランスレーショナルリサーチ：機能的アウトカムに関連する保存された16S rRNAシグネチャーをモニタリングすることにより、in vitroでの知見を前臨床モデルへと結びつけます。
- 企業内での再利用：複数のプロジェクトや治療領域にわたる縦断的研究のための、再利用可能な分析プラットフォームとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ホストと微生物の相互作用におけるメカニズム的な曖昧さを軽減し、予測の信頼性を向上させます。
- 運用の価値：制御された変性勾配および温度調節電泳により、標準化と再現性を確保します。
- 戦略的価値：マイクロバイオームへの悪影響を早期に検出することを可能にし、後期段階での脱落を減らすことで、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：薬効や安全性に影響を与える微生物コミュニティの変化に関する実行可能な洞察を提供し、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- 分子生物学および核酸電気泳動技術に関する専門知識が必要です。
- 精密な温度制御と連続的なバッファーフローを維持できる専用装置に依存します。
- ゲルの調製、勾配の作成、およびイメージングプロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 臨床分離株や環境サンプルなど、異なるサンプルタイプに本手法を適用する際は、適応に関する検討が必要となります。
- 標的とする微生物コミュニティで最適な解像度を得るためには、配列特異的な変性勾配の最適化が必要であるという制約があります。
