アダルトゼブラフィッシュにおける眼窩インジェクション
December 7th, 2009
ここでは、成人のゼブラフィッシュで眼窩の注入を行う方法を示しています。
ドナー赤血球は、まずトランスジェニックグロビンGFPフィッシュから、ドナー動物の心臓に穴を開けて赤血球を吸引することにより採取されます。細胞を注射用に準備すると、レシピエントの魚は眼窩後から注射され、その後、標準的な全動物蛍光顕微鏡を使用して画像化され、蛍光標識細胞の注射が成功します。同様に、テキサスレッドに結合した着色染料デキストリンを調製し、眼窩後方に注射し、注射された動物が成功した注射について画像化されます。
こんにちは、ボストン小児病院の血液腫瘍科のレナード・ザン研究室のエミリー・アッチです。今日は、成体のゼブラフィッシュに眼窩後退注射をする手順をご紹介します。当研究室では、この手技を用いて造血幹細胞移植の研究を行っています。
それでは始めましょう。トランスジェニックグロビンGFP細胞とテキサスレッドに結合した赤色蛍光染料デキストリンの眼窩後後注射を、成体のキャスパー魚、トランスジェニックロービンを調製するための透明なシブラフィッシュの品種にデモンストレーションします。GFP細胞は、ヘパリンでコーティングされた10マイクロリットルのピペットチップを使用して鰓の後ろの魚に穴を開け、赤血球を吸引し、それらを細胞緩衝液に分注することにより、成魚のドナー魚を出血させます。
次に、細胞懸濁液を40マイクロメートルメッシュでろ過します。LeBlancらが以前に説明したように、ヘモサイトメーターを使用して細胞の濃度を決定した後、1500 RPMで5分間細胞に費やします。Reusは、細胞バッファー中の細胞を所望の濃度で懸濁し、最終注入量が5マイクロリットル以下
になるようにします。このデモンストレーションでは、レシピエントあたり150万〜200万個の細胞を注入して赤色蛍光色素を調製し、DPBSに溶解して、1ミリリットルあたり10〜12ミリグラムの最終注入濃度にします。注入手順は同じであるため、魚1匹あたり4マイクロリットルを注入します。注入材料に関係なく、赤色蛍光色素の注入のみを実演します。
魚を注入する前に、70%エタノールを使用してハミルトンシリンジを3〜4回洗浄します。.0.9 XDPSで3〜4回すすぎます。トリカで魚に麻酔をかけた後、魚の背側を上にして、湿らせたスポンジの上に右に向けて置きます。
ロードされたハミルトンシリンジを右手で持ち、人差し指で左手でプランジャーに置き、魚の体をやさしく安定させます。魚の目が時計の場合、針が7時の位置を指すように、斜角を上にして針を配置します。そして、魚に対して45度の角度で、針を7時の位置に1〜2ミリメートルゆっくりと挿入し、プランジャーをゆっくりと押し下げます。
魚が新鮮なE3水で回復するのを待ちます。感染を避けるために、毎日水を入れ替えて1週間魚を流さないようにし、この期間中はICUの水に魚を保管します。眼窩後注入が正しく行われると、ラベル付けされた注入された材料を視覚化することができます。
例えば、トランスジェニックグロビンGFP赤血球は、注射の3日後にレシピエント成魚のキャスパー魚の尾の血管系を循環する蛍光解剖顕微鏡の下で見ることができ、同様に、テキサスレッドに結合した70キロダルトンのデキストリンの成功した注射は、すぐに蛍光血管系を生成する。透明な成体キャスパー魚では、標準的な全動物蛍光顕微鏡法で容易に視覚化でき、トランスジェニックベータアクチンGFPドナー魚由来の蛍光穴腎髄細胞を、放射されたキャスパーレシピエント魚にレトロ経口注射することもできます。これらの細胞は、ここに示すように、注射の3日後、4週間後には、最終的にレシピエントの骨髄に帰宅し、これらの緑色のドナー細胞はレシピエントの腎臓に再増殖し続けます。
今回は、成魚のゼブラフィッシュに眼窩後注射を行う方法を紹介しました。この手順を行うときは、魚の平面に対して45度の角度で針で注射することを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この記事では、造血幹細胞移植研究で使用される成体ゼブラフィッシュへの後眼窩注射の方法を説明します。このプロセスは、ドナーの赤血球を採取し、イメージングのために受容体フィッシュに注射することを含みます。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 血液学
- トランスジェニックモデル
背景
- 後眼窩注射は、ゼブラフィッシュの血流に物質を送達する方法です。
- トランスジェニックグロビンGFPフィッシュが赤血球のドナーとして使用されます。
- この技術により、造血幹細胞のダイナミクスの研究が可能になります。
- 蛍光顕微鏡は、注射の成功を視覚化するために使用されます。
研究の目的
- ゼブラフィッシュへの後眼窩注射の詳細なプロトコルを提供すること。
- 造血幹細胞移植の研究を促進すること。
- 生きたモデル生物における血球ダイナミクスの理解を深めること。
使用された方法
- ドナーゼブラフィッシュからの赤血球の採取。
- 注射のための細胞の準備。
- 受容体ゼブラフィッシュへの後眼窩注射。
- 全身蛍光顕微鏡を用いたイメージング。
主な結果
- 蛍光標識された赤血球の注射に成功しました。
- イメージングによって注射された細胞の分布が確認されました。
- この手順は実験室環境で効果的に実証されました。
- 色付き染料の注射も成功裏に視覚化されました。
結論
- 後眼窩注射は、ゼブラフィッシュの血球ダイナミクスを研究するための実行可能な方法です。
- この技術は、血液学の様々な研究分野に適用できます。
- 蛍光顕微鏡は、注射の成功をモニタリングするための効果的なツールです。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient systemic delivery of compounds and cells in adult zebrafish is critical for translational pharmacology and hematopoietic research. The retro-orbital injection technique enables reproducible intravenous administration with reduced mortality, supporting robust in vivo modeling and compound evaluation. This method enhances predictive confidence at early discovery and preclinical inflection points for biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in whole-animal vertebrate models.
- Supports functional validation of hematopoietic and vascular targets via systemic delivery.
- Facilitates biological de-risking by minimizing procedural mortality and off-target effects.
- Improves predictive confidence for compound and cell-based interventions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated zebrafish models for downstream compound screening and cell tracking.
- Standardizes intravenous administration for reproducible pharmacological studies.
- Enables quantitative imaging outputs for assay development and optimization.
- Supports scalable workflows for evaluating multiple agents or cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant hematopoietic and vascular models for translational studies.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of systemic delivery.
- Enables risk-adjusted advancement of candidate compounds and cell therapies.
- Supports mechanistic de-risking by allowing direct observation of cell homing and distribution.
Pipeline & Workflow Integration
This technique integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling reliable systemic administration in adult zebrafish models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through in vivo delivery and imaging.
- Screening: Provides assay-ready models with reproducible intravenous access for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative fluorescence imaging outputs for comparing delivery efficiency and distribution.
- Translational Research: Bridges early discovery with preclinical validation in disease-relevant vertebrate systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, low-mortality method applicable across diverse zebrafish studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation in systemic delivery studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of in vivo workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds and cell therapies for advancement.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in zebrafish handling and microinjection.
- Needs fluorescence microscopy infrastructure for post-injection validation.
- Demands cross-team standardization of injection parameters and imaging protocols.
- Adaptable to various cell types and compounds with appropriate optimization.
- Limited to transparent or semi-transparent adult zebrafish strains for optimal imaging.
