Name: アダルトゼブラフィッシュにおける眼窩インジェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-07T18:43:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: 学ぶアダルトゼブラフィッシュの眼窩インジェクション技術。造血幹細胞移植研究に用いられ、ドナー赤血球を採取して受容魚に注入し、蛍光顕微鏡で観察する方法です。血液細胞動態の研究に応用可能です。

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この作品はハワードヒューズ医学研究所と胚造血の研究のためのNIHからの助成金によってサポートされています。

パート1. 注入材料の調製
<ol>
 <li>Tg(globin:GFP)細胞：</li>
 <li>ヘパリン（1unit/ul）をコーティングした10ulピペットチップを用いて、鰓の後方を穿刺し、成体ドナー魚から採血する。</li>
 <li>赤血球を吸引し、細胞バッファー（0.9X PBS + 5% FBS + 1% Pen/Strep）に分注する。</li>
 <li>細胞懸濁液を40uMメッシュでろ過し、LeBlancらによって先に記載された方法に従い、血球計数器を用いて細胞濃度を測定する。</li>
 <li>遠心分離して回収し、最終注入量が5ulを超えないように、目的の濃度で細胞バッファーに再懸濁する。本法では、レシピエント1匹あたり1.5-2 million cellsを注入する。</li>
 <li>デキストラン（Texas Red®）については、色素をDPBSに溶解し、最終注入濃度を10-12 mg/mLにする。魚1匹あたり4 uLを注入する計画とする。</li>
</ol>
パート2. 注射
<ol>
 <li>トリカイン（4.2ml (4mg/ml) トリカイン/魚の水100ml）を用いて魚を麻酔します。</li>
 <li>注入前に、ハミルトンシリンジを70%エタノールで3〜4回洗浄します。その後、0.9X DPBSで3〜4回すすぎます。</li>
 <li>湿らせたスポンジの上に、魚を背面が上で右向きになるように置きます。</li>
 <li>右手でハミルトンシリンジを持ち、人差し指をプランジャーに置きます。左手で魚の体を軽く固定します。</li>
 <li>針の刃先を上に向け、魚の目を時計に見立てたとき、針が7時の方向を指し、魚に対して45度の角度になるように配置します（図1）。</li>
 <li>針を7時の方向に1〜2 mmゆっくりと挿入し、プランジャーをゆっくりと押し下げます。</li>
 <li>新鮮なE3水の中で魚を回復させます。</li>
 <li>異なる試薬を注入する際は、上述の手順に従って針を洗浄します。</li>
 <li>細胞の凝集を防ぐため、数分おきに細胞懸濁液を軽く弾いて細胞を再懸濁させます。</li>
 <li>感染を防ぐため、1週間はフローのない環境で飼育し、毎日換水を行います。この期間、魚はICU水（E3水38リットルあたり、Stress coat 10mL + pemafix 5mL + melafix 5mL）で飼育します。</li>
</ol>
パート3. 代表的な結果
正しく実施すれば、何らかの方法で標識された注入物質を可視化することが可能です。例えば、図2に示すように、Tg(globin:GFP)赤血球を注入した後すぐに、蛍光解剖顕微鏡下でレシピエントのcasper魚の血管系を循環している様子が観察されるはずです。同様に、Texas Red®を結合させた70kDaデキストランを後眼窩的に注入すると、透明な魚の血管系において直ちに可視化できます（図3）。また、Tg(β-actin:GFP)ドナー魚由来の蛍光腎細胞を、放射線照射したcasperレシピエント魚に後眼窩的に注入することも可能です。これらの細胞は最終的にレシピエントの骨髄へホーミングし（図4a）、その後数週間かけて腎臓を再構築することがあります（図4b）。
注入が浅すぎる場合、または針の角度が後眼窩静脈洞の腔を外れた場合、注入物質が目の周囲に溜まったり、外へ流れ出したりするのが観察されることがあります。逆に、注入が深すぎると、魚に組織損傷や過剰な出血が生じる可能性がありますが、それでも回復する場合もあります。正しく実施された場合、後眼窩注入後の死亡率は全注入魚の5%未満であり、血流への導入成功率は全注入魚の90%以上である必要があります。
<img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig1.jpg" alt="ゼブラフィッシュの概日リズム研究；時間注入法のイラスト" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図 1"> 図 1: 後眼窩注入法のイラスト。魚の右眼をアナログ時計に見立てており、7時の位置が正しい注入箇所に対応している。
<img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig2.jpg" alt="蛍光顕微鏡像、タンパク質の局在、細胞構造、顕微鏡実験。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図 2"> 図 2: 後眼窩注射から3日後の成体casper魚の尾部血管内を循環するTg(globin:GFP)赤血球。
<img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig3.jpg" alt="ゼブラフィッシュの顕微鏡写真。赤色蛍光により鰭の筋肉構造と身体形態が強調されている。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図 3"> 図 3: 色素として用いたTexas Red® 結合70kDaデキストランの注入に成功し、透明な成魚であるcasper において蛍光性の血管系が構築された。これは標準的な個体 whole-animal 蛍光顕微鏡を用いて容易に観察できる。
<img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4a.jpg" alt="蛍光放出検出、顕微鏡像、ハイライト領域、生物学的解析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 4a"> 図 4a: Tg(β-actin:GFP)ドナー魚から全腎髄細胞を後眼窩的に注入して3日後、照射した成体casperレシピエント魚の腎髄にホーミングする細胞を可視化できる。
<img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4b.jpg" alt="ゼブラフィッシュの蛍光顕微鏡像。神経組織におけるGFP発現を強調している。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図 4b"> 図 4b: Tg(β-actin:GFP)ドナー魚からの全腎髄細胞を後眼窩的に注入して4週間後、放射線照射した成体casperレシピエント魚において、緑色のドナー全腎髄細胞によるレシピエント腎臓への再定着が可視化される。

<ol><li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+route+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Pinkerton, W., Webber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+injecting+small+laboratory+animals+by+the+ophthalmic+plexus+route%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Bio.+Med%22%5BJournal%5D)">A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route.</a> Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).</li>
<li>White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+whole+kidney+marrow+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
</ol>

成人ゼブラフィッシュにおける眼窩注入は死亡率の最も低い発生率と血流に注入された材料の納入の最高効率が得られます。ために注射スポットの性質上、穿刺は感染症と失血の量の発生を減少させる、迅速に治癒に表示されます。サイトであっても繰り返して、例えば、薬物の毎日注射するための短い時間の間に注入されることがあります。 薬物の大量は、単純に浸漬し、関心の薬物を含む水に浸漬されている魚で、成魚の伝統的な治療法を購入する必要があります。薬剤が動物の血流に直接注入されている場合には、はるかに小さい量はそれによって、実験コストを削減し、治療が必要です。浸漬によって魚の循環を入力するには大きすぎる特定の化合物の場合は、特定のペプチドの場合には、眼窩の注入も有利かもしれない。 さらに、RO注射は成魚で心腔内注射の技術よりも高速かつ容易なので、RO注射の別のアプリケーションでは、成人の化学遺伝学的スクリーニングが含まれる場合があります。このように、眼窩の注入は非常に化学的または化学的配信を必要とゼブラフィッシュの研究を促進するかもしれない。

<table><tbody><tr><td>豚腸粘膜由来ヘパリンナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>あらかじめ計量された300 USPユニットのバイアル</td></tr><tr><td>トリカイン-S</td><td>Western Chemical</td><td></td><td>MS-222</td></tr><tr><td>ダルベッコ&amp;rsquo;リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン、テキサスレッド&amp;#174;</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td></td><td></td><td>5mM NaCl&lt;br/&gt;0.17 mM KCl&lt;br/&gt;0.33 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;0.33 mM MgSO₄&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>マイクロリッターシリンジ</td><td>Hamilton社</td><td>80300</td><td>701N 10uL SYR (26s/2&amp;#8221;/2)</td></tr></tbody></table>

アダルトゼブラフィッシュにおける眼窩インジェクション

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

動物全体の薬物治療は、薬理学的および化学的遺伝学的研究の任意のモデルシステムに不可欠なツールです。静脈内（IV）注射は、多くの場合、関心のエージェントの配信の最も効果的かつ非侵襲的なフォームです。ゼブラフィッシュの（<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;）、薬物の静脈内注入は長いので、小血管の直径の課題でした。これはまた、造血幹細胞移植時の細胞の注入のための重要なハードルを証明している。歴史的に、血流への注射は、心臓から直接行われた。心がしばしば感染、大量の失血または致命的な臓器の損傷を受けやすい魚を残して注入時の穿刺しかし、この内心臓手術は、非常に高い死亡率を持っています。マウスを使って私たちの経験を生かし、我々は、注射部位は、目の後ろと後眼窩静脈洞になっているゼブラフィッシュの新しい注入の手順を開発しました。この眼窩（RO）の注入法は、正常に成魚の薬の注入だけでなく、全体の腎臓の骨髄細胞の移植の両方で採用されている。 ROの注入は、従来の内心臓注射よりもはるかに低い死亡率を持っています。眼窩に注入されている魚は少なく、次の注入を出血する傾向があり、心臓などの主要な臓器に傷害の非常に低い危険にさらされている。さらに、適切に実行したとき、注入された細胞および/または薬物を迅速化合物は、そのニッチに簡単にホームに全体の魚と腎臓の細胞に対する効果を発揮できるように血流に入る。大人の魚の血流に材料の効率的な配信を可能にしながらこのように、この新しい注入法は、死亡率を最小限に抑えます。ここでは、Tgの眼窩注入することにより、この手法を例示する（<em&gt;グロビン</em&gt;：大人にGFP）細胞<em&gt;キャスパー</em&gt;魚だけでなく、赤色蛍光色素の注入（デキストラン、テキサスレッド<em&gt;</em&gt;）成人に<em&gt;キャスパー</em&gt;魚。私たちは、その後、全体の動物の蛍光顕微鏡で成功した注射を可視化する。

ここでは、成人のゼブラフィッシュで眼窩の注入を行う方法を示しています。

個体全体への薬剤投与は、薬理学的および化学遺伝学的研究におけるあらゆるモデルシステムにおいて不可欠なツールである。静脈内（IV）注射は…

まず、ドナー動物の心臓を穿刺して赤血球を吸引し、トランスジェニックglobin GFP魚からドナー赤血球を採取します。細胞の注入準備が整った後、レシピエント魚の眼窩後静脈に注入し、その後、標準的な個体全層蛍光顕微鏡を用いて、蛍光標識細胞が正常に注入されたかを確認するためのイメージングを行います。同様に、Texas redを結合させた着色色素デキストリンを調製して眼窩後静脈に注入し、注入した動物をイメージングして注入の成功を確認します。こんにちは。ボストン子供病院、血液学・腫瘍科のLeonard Zan研究室のEmily Atchです。本日は、成体ゼブラフィッシュにおける後眼窩静脈注射の手順をご紹介します。当研究室では、造血幹細胞移植の研究にこの手法を用いています。それでは始めていきましょう。ここでは、成体Casper魚（透明なゼブラフィッシュの系統）への、トランスジェニックglobin GFP細胞およびTexas Red結合赤色蛍光デキストリンの眼窩後注入法を実演します。トランスジェニックglobin GFP細胞を調製するため、ヘパリンをコーティングした10 µLピペットチップを用いて、ドナー成魚のエラ後方を穿刺して採血し、赤血球を吸引して細胞バッファー中に分注します。次に、細胞懸濁液を40 µmのメッシュでろ過します。 previously described by LeBlanc et alに記載されている通り、ヘモサイトメーターを用いて細胞濃度を決定した後、細胞を1500 RPMで5分間遠心分離します。最終注入量が5 µL以下となるように、目的の濃度で細胞バッファーを用いて細胞を再懸濁します。このデモンストレーションでは、受容個体あたり1.5〜200万個の細胞を注入します。赤色蛍光染料を準備し、最終注入濃度が10〜12 mg/mLとなるようにDPBSで溶解させます。注入の手順は同一であるため、魚1匹あたり4 µLを注入します。注入する物質に関わらず、ここでは赤色蛍光染料の注入のみを実演します。魚に注射する前に、ハミルトンシリンジを70% ethanolで3〜4回洗浄します。その後、0.9 XDPSで3〜4回すすぎます。Tricaで魚を麻酔した後、魚を背面にし、右側を向かせた状態で湿ったスポンジの上に置きます。充填したハミルトンシリンジを右手で持ち、左手の人差し指をプランジャーに添えて、魚の体を軽く固定します。針の刃（ベベル）を上に向け、魚の目を時計に見立てたとき、針が7時の方向を指すように配置します。魚に対して45度の角度で、7時の位置に針を1〜2 mmゆっくりと刺入し、プランジャーをゆっくりと押し下げます。魚を新鮮なE3水で回復させます。感染を防ぐため、1週間は水流のない状態で飼育し、毎日換水を行います。この期間、魚はICU水で管理します。後眼窩注入が正しく行われれば、ラベル化された注入物質を可視化することが可能です。例えば、導入遺伝子としてglobin GFPを持つ赤血球が、注入から3日後の成体Casper魚の受容個体の尾部血管内を循環している様子が蛍光解剖顕微鏡下で観察できます。同様に、Texas redを結合させた70 kilodaltonのデキストリンを正常に注入すると、直ちに血管が蛍光色に染まります。標準的な個体全体の蛍光顕微鏡観察が容易な透明な成体Casper魚において、transgenic beta actin GFPドナー魚由来の蛍光標識された全腎髄細胞を、放射線照射したCasper受容魚に経口的に注入することも可能です。これらの細胞は、ここに示したように、注入から3日後には最終的に受容個体の髄質へと遊走し、4週間後には、これらの緑色のドナー細胞が受容個体の腎臓に再定着します。以上で、成体ゼブラフィッシュにおける後眼窩静脈注射の方法を説明しました。この手順を行う際は、針を魚の平面に対して45度の角度で刺入することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

retro-orbital-injection-in-adult-zebrafish

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