Name: ジ- 8 - ANEPPSで誘起膜電位の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-19T20:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 学ぶ di-8-ANEPPSを用いた誘起膜電位測定法。電気パルス印加による細胞膜電位変化を蛍光顕微鏡で可視化し、膜ダイナミクスを非侵襲的に解析する手法を解説します。

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この作業は、プロジェクトZ2 - 9229とプログラムP2 - 0249とスロベニアの研究機関によってサポートされていました。このビデオでは、&quot;エレクトロポレーションベースの技術と治療&quot;リュブリャナ大学で電気工学の学部で一年おきに主催科学的なワークショップや大学院、、スロベニアの補助材料を表します。

パートI：予備的な手順<ol><li>この実験ではチャイニーズハムスター卵巣細胞株（CHO - K1）が使用されます。細胞は8％ウシ胎児血清を添加したHAM - F12培地中で〜0.7x10 5細胞/ ml、0.15 mg / mlの時のLab - Tek社IIチャンバー（2ウェルを、4cm 2のそれぞれ）（Nalge Nunc社、ドイツ）でメッキされていますL -グルタミン、16 mg / mlのゲンタマイシン（Sigma - Aldrich社、シュタインハイム、ドイツからのすべて）、および200ユニット/ mlのCrystacillin（Pliva、ザグレブ、クロアチア）、および37℃、5％CO 2でインキュベート℃のまた、細胞はまた、ポリリジンなどの細胞接着剤を塗布＃1ガラスカバースリップ（厚さ0.13〜0.16ミリメートル）、にめっきすることができる。 </li><li>それらの培地で細胞をインキュベートする。それでもほぼ球形であるが、しっかりとそれらの膜の小さな部分と表面に付着した2〜4時間の収量細胞続くインキュベーション。また、インキュベーションの16〜20時間後、細胞は完全に表面に付着し、より複雑な形を持っているが、それらのほとんどは、まだ割っていませんされています。 </li><li>元インビトロジェンバイアル中の染料の5mgにDMSOの843μL（シグマ - アルドリッチ、シュタインハイム、ドイツ）を追加することにより、ジ- 8 - ANEPPS（Invitrogen社、ユージン、オレゴン州、米国）の10 mMのストック溶液を調製。ストック溶液は、数ヶ月間、4℃の冷蔵庫に保管することができます。 DMSOの結晶が溶解するまで実験を開始する前に、ソリューションのウォームアップを行います。 </li><li>いくつかの細胞株は、細胞膜への色素の取り込みを容易にするために、プルロニックの使用が必要になる場合があります。プルロニックは、20％DMSO（F - 127、Invitrogen社、ユージン、オレゴン州、米国）のストック溶液、またはDMSO中でプルロニックを溶解して調製することができる、同じ濃度のストック溶液で購入することができます。プルロニックのストック溶液を室温で保存することができます。 </li></ol>パートII：ジ- 8 - ANEPPSを細胞にロード<ol><li> 10mMのジ- 8 - ANEPPSと最小必須培地のSMEMのスピナーの変更（カルシウム枯渇版）（ミディアムM8167またはM4767、Sigma - Aldrichは、シュタインハイム、ドイツの1 mlの20％プルロニック2.5μlの3μlを混ぜて1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに）。これは約30μMジ- 8 - ANEPPSとプルロニックの0.05％を含む&quot;ローディングソリューション&quot;を得られます。他の細胞型の場合は、それらのネイティブの培養培地は、SMEMの代わりに使用できます。 </li><li>ローディング溶液でのLab - Tek社チャンバー内の培養液を交換してください。 4℃で10分間冷蔵庫にチャンバーを転送℃にこの温度で​​は、形質膜を介して色素のインターナリゼーションが大きく阻害される。 </li><li>染色後、優しく純粋なSMEMに過剰な色素を2〜3回洗浄する。 </li><li>チャンバー内のSMEM 1.5mlを残す。 </li></ol>パートIII：実験と画像取得<ol><li>細胞は、油浸対物レンズ（X63、NA 1.4）、モノクロ（ポリクロームIV、Visitron、ドイツ）と冷却CCDカメラ（VisiCamを装備した蛍光顕微鏡を（我々の場合ツァイスAxioVert 200、ツァイス、ドイツ）を用いて観察される1280年、Visitron、ドイツ）。画像はMetaFluor 7.1.1で買収し、MetaMorph 7.1.1（両方Molecular Devices社、ダウニングタウン、ペンシルバニア州、米国）で処理されますが、他の同じような買収のソフトウェアも使用することができますされています。 490nmでの集録ソフトウェアの励起波長を設定し、例えばANEPPSに適した発光フィルター、605 nmの中心のバンドパスフィルタを（605/55m、ダイクロイック565 DCXR、クロマ、ロッキンガム、バーモント州、米国）を選択します。モノクロメータが使用できない場合は、490 nmの中心の励起フィルターを代わりに使用することができます。 </li><li>顕微鏡ステージ上に細胞をチャンバーを置く、チャンバーの下部に電極を配置し、パルス発生器に接続します。培地には、電極をカバーする必要があります。 </li><li>細胞の生存を維持し、発熱を低減するために、パルスが十分に低い振幅と持続時間が短いはずです。この実験では35 V振幅と50 msの持続時間（エレクトロポレーションを防ぐのに十分な低さ）の方形パルスは直流電圧の供給とカスタムメイドのマイクロプロセッサー制御のスイッチャーのデバイスを使用して生成されます。また、そのようなS88（グラス、ウェストワーウィ​​ック、ロードアイランド、米国）などのアンプや商業刺激装置に接続されている33210A（アジレント、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）などの商業パルスジェネレータは、、、使用することができます。パルスは、電極と誘導ΔΦの間に約88 V / cmの電場を作る、0.8mmの直径とそれらの間に4 mmの距離で2つの並列のPt / Irのワイヤ電極に配信されます。この実験で使用される電極間の正確な電界分布が他の場所[1]に記載されています。 </li><li>目的の細胞を見つける。単一の電気パルスまたはパルスのシーケンスを適用します。すぐにパルス（制御画像）1つ前とパルス（パルスの画像）中に1つ：各パルスの場合は、二つの蛍光画像を取得。ジ- 8 - ANEPPSの低い応答のために、蛍光の変化は、肉眼で識別し、明らかにONLになることは困難である処理の後にyを。パルスの配信は、買収のソフトウェアの特徴である画像取得、と同期する必要があります。加熱を退色し、可能な回避するために、照明は、パルスの持続時間に制限することができます。 </li></ol>第IV部：画像処理と解析<ol><li> MetaMorphソフトで画像を開きます。各パルスの場合、制御とパルスのイメージの両方でバックグラウンドを引く。 </li><li>セルを選択し、それが膜に対応するように関心領域を設定します。制御とパルス画像内のこの領域に沿って蛍光強度を測定し、スプレッドシートに値を転送する。 </li><li>各パルスは、パルスデータから制御データを減算し、相対的な蛍光の変化を得るための制御データで結果を割ります。パルスシーケンスが適用されている場合は、各パルスに決定相対的な蛍光の変化の値は、より信頼性の高い測定を得るために平均化することができます。 </li><li>検量線を使用してΔΦに相対的な蛍光の変化を変換します。この曲線の大まかな推定は、文献から得たものですが、より高い精度のために、それはそれぞれ特定のセットアップのために測定する必要がありますすることができます。細胞と本実験で使用したセットアップのために蛍光で6％の減少は、ΔΦ[2]で100 mVの増加に対応しています。 </li><li>最後に、このようなエクセル（マイクロソフト社、レドモンド、ワシントン州、米国）、シグマプロット（SYSTAT Software社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）などのグラフィック系ソフトウェアパッケージの相対的な弧の長さの関数として電圧をプロットする、または原点（OriginLabの（株）、ノーサンプトン、マサチューセッツ、米国）。曲線はまた、移動平均フィルタのような適切なフィルターを用いて平滑化することができます。 </li></ol>

<ol><li>Mazères, S., Šel, D., Golzio, M., Pucihar, G., Tamzali, Y., Miklavčič, D., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+invasive+contact+electrodes+for+in+vivo+localized+cutaneous+electropulsation+and+associated+drug+and+nucleic+acid+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Non invasive contact electrodes for in vivo localized cutaneous electropulsation and associated drug and nucleic acid delivery.</a> J. Control. Release. 134, 125-131 (2009).</li>
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</ol>

誘導膜（膜貫通）電圧、ΔΦ、の測定値は、電位依存性膜チャネル、活動電位の伝播、心筋細胞の刺激、または細胞膜のエレクトロポレーション[3、4、5、6の研究など、様々な実験の設定、に重要になることがあります、7]。単純細胞の形状で、ΔΦ解析的に計算することができます。例えば、球状の細胞のために、ΔΦは、電圧が電界強度とセルのサイズに比例であることを示すと膜に沿って余弦関数を次シュの方程式、で与えられる[8、9]。より複雑な細胞の形状の場合は、ΔΦ余弦から大幅に逸脱することができ、電位差染料[12、13、14、15]を使用して、[2、10、11]、または実験的にコンピュータを使用して、どちらかの数値的に決定する必要があります。 広くこの目的で使用される電位差染料の一つは、ジ- 8 - ANEPPS（ジ- 8 -ブチル - アミノ-ナフチル-ピリジニウム-プロピルスルホン酸エチレン）、励起と発光の膜電位に依存するスペクトルを持つ高速な色素であり、その細胞膜上にΔΦのバリエーションの非侵襲的観察を可能にし、その値を測定する。このビデオでは、我々は、ジ- 8 - ANEPPSを使用して、ΔΦの決定のための実験的なアプローチを示しています。 染料は、コネチカット大学の教授レスリーロウズら[13、14]によって開発され、高速応答色素のクラスに属していた。ジ- 8 - ANEPPSは水に非蛍光であり、それは細胞膜の脂質二重層に組み込まれてときに強く蛍光性になる。分子内電荷分布と色素の蛍光のスペクトルプロファイルと強度の対応する変化の変化ΔΦの結果の変化。ジ- 8 - ANEPPSの蛍光強度は、ΔΦの変化に比例して変化する。色素の反応は、-280 mVから250までmVの[4、16]電圧に対して線形である。このような努力にも[17]が報告されたが染料、不均一な膜染色の蛍光は比較的小さな変化、および染料内在化は、膜電位、例えば、その休憩成分の絶対測定のためのジ- 8 - ANEPPSはあまり適していません。それは、しかしながら、そのような興奮性細胞[4,5]で外部電界にさ​​らされる非興奮性の細胞の誘導膜電位の発症[12、13]、または活動電位のような膜電位の大きな変化を、測定に適しています。ここで適用されていないものの、ジ- 8 - ANEPPSも[18]または応答の感度を増加させると上記の効果を軽減発光[19]、蛍光励起のレシオメトリック測定によりΔΦの決定を可能にする。ジ- 8 - ANEPPSの汚れ膜として、それはまた、細胞膜マーカー[2]としてはっきりと使用することができます。 染料の欠点の一つは、それが退色する傾向があることですので、強い光に長時間暴露は避けるべきであること。染料のキャリブレーションは、外部媒体のいずれか（I）カリウムイオノフォアバリノマイシンと異なるカリウム濃度のセットで実行される[2,18]、または（ii）パッチクランプ電圧クランプモードで[17]。 最後に、より複雑な形状の球状の細胞と細胞のΔΦの測定と、ビデオは、セルの振幅の図形とΔΦの空間分布の影響を示しています。したがって、球状の細胞のためのΔΦより複雑な細胞の形状のためにΔΦの空間分布がより複雑である一方、シュヴァン方程式との合意で、コサインに近い[20] ...

<table><tbody><tr><td>di-8-ANEPPS</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td>電位計量型蛍光色素</td></tr><tr><td>プルロニック</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td>カリウムイオン担体</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>SMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8167またはM4767</td><td>最小必須培地のスピナー用改変</td></tr><tr><td>Ham-F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4888</td><td>培地</td></tr><tr><td>胎児牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>クリスタシリン</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>Lab-Tek II</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td>チャンバー</td></tr><tr><td>DC電源装置</td><td>Elektro-Automatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロプロセッサ制御スイッチャー</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電極</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

ジ- 8 - aneppsで誘起膜電位の測定

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

外部電場にセルの配置は、膜を通過する電圧で、その結果、細胞膜の近傍に細胞の局所電荷の再分配の内側と外側を引き起こします。この電圧は、誘起膜電位（も誘導される膜貫通電圧、または誘導膜電位の差）と呼ばれるとΔΦで表されるが、唯一の外部磁界が存在する限り存在する。安静時の電圧が膜上に存在する場合、誘起電圧は、その上に（追加）重ね書きします。例えばジ- 8 - ANEPPSとして電位差蛍光色素、のいずれかを使用して、それは細胞膜上にΔΦの変動を観察し、非侵襲的にその値を測定することが可能です。 ΔΦの変化に比例した蛍光強度の変化と、細胞膜の脂質二重層に結合するとジ- 8 - ANEPPSは、強い蛍光となります。このビデオでは、測定するためのプロトコルΔΦ用いたジ- 8 - ANEPPSを示し、また、振幅とΔΦの空間分布に及ぼすセル形状の影響を示しています。

外部電界が細胞の膜上に電圧を誘導する、誘起膜電位は（ΔΦ）と呼ばれる。電位差染料ジ- 8 - ANEPPSを使用して、それは非侵襲的にΔΦを測定することが可能です。このビデオは、di - 8 - ANEPPSを使用してΔΦを測定するためのプロトコルを示しています。

ジ- 8 - ANEPPSで誘起膜電位の測定

細胞を外部電場に置くと、細胞内外の細胞近傍において局所的な電荷の再分布が生じます。

生物学者にとって、細胞は生命の構成単位であり、内部にはそれぞれ特定の役割を担う数多くの異なる細胞小器官が含まれており、それらが共同して細胞に不可欠な機能を果たすことを可能にしています。しかし、電気的な視点からは内部構造はそれほど重要ではなく、細胞は絶縁性の膜に囲まれ、さらに導電性の外部環境に囲まれた導電性細胞質であると見なすことができます。イオン濃度のわずかな不均衡により、過剰なイオンが膜の近くに蓄積することで、静止膜電位が生じます。細胞を電場の中に置くと、細胞膜の両側で局所的な電荷の再分布が起こります。その結果、誘導膜電位が生じ、これが静止電位に重畳し、電場を切ると消失します。単純な細胞形状の場合、球状細胞に対する誘導膜電位を解析的に算出することが可能です。これはSchwanの式によって与えられ、電圧は電界強度と細胞サイズに比例し、細胞膜に沿ってコサイン関数に従うとされています。より複雑な細胞形状の場合、誘導電圧はコサイン関数から大きく逸脱する可能性があり、高性能コンピュータを用いた数値計算、または電位計染料を用いた実験的な手法で決定する必要があります。この目的で広く用いられている電位計染料の一つにdiBAC₄(3)があります。膜電位に依存して励起および放出スペクトルが変化する高速染料であるAIPsは、膜に結合すると強い蛍光を発し、その蛍光強度の変化は膜電位の変化に比例します。このビデオでは、D AIPsを用いて誘起膜電位を測定するプロトコルを紹介します。本例では、チャイニーズハムスター卵巣細胞を使用し、1チャンバーあたり100,000個の細胞をチャンバー内に播種します。胎児ウシ血清、L-グルタミン、および抗生物質を添加したHAMF 12培地を用いて、細胞を2〜4時間培養して球状の接着細胞を得るか、または16〜20時間培養してより複雑な形状の単一接着細胞を得ます。元のバイアル内でDiI-AAPSをDMSOに溶解し、10 mMのストック溶液を調製します。一部の細胞株では、膜への色素導入を容易にするために、追加のTriton X-100が必要な場合があります。1 mLのSpencer修正最小必須培地（SMEM）をEppendorfチューブに移し、2.5 µLの20% Triton X-100と3 µLの10 mM DiI-AAPSを加えます。これにより、約30 µMのdiet aapsと0.05%のonicを含むローディング溶液が得られます。チャンバー内の培地をローディング溶液に交換します。その後、チャンバーを冷蔵庫に移し、4 °Cで10分間保持します。染色後、細胞膜を介した染料の内部移行は大幅に抑制されるため、過剰な染料を純粋なSMEMで慎重に数回洗浄します。最後に、チャンバー内に1.5 millilitersのSMEMを残します。細胞は、油浸対物レンズ、モノクロメーター、およびCCDカメラを備えた蛍光顕微鏡を用いて観察します。データ収集ソフトウェアで、励起波長を419 nanometersに設定し、約605 nanometersに設定されたバンドパスフィルターを選択します（本手順では適用していません）。Diet aapsでは、膜電位のレシオメトリック測定も可能です。細胞の入ったチャンバーを顕微鏡ステージに置き、電極をチャンバーの底部に配置してパルスジェネレーターに接続します。この例では、振幅35 volts、持続時間50 millisecondの矩形パルスを生成します。DC電源とマイクロプロセッサ制御のスイッチャーを用いて、パルスを一対の電極に印加することで、電極間に電界を形成し、膜電位を誘導します。パルスの印加は、画像取得と同期させる必要があります。目的の細胞を特定し、各パルスに対して単一の電気パルスまたは一連のパルスを印加します。染料の応答性が低いため、パルス直前のコントロール画像と、パルス印加中のパルス画像という2枚の蛍光画像を取得します。蛍光の変化は判別しにくいため、各パルスの画像を開いて処理を行った後にのみ明確になります。コントロール画像とパルス画像の両方で背景減算を行います。細胞を1つ選択し、細胞膜に対応するように関心領域（ROI）を設定します。コントロール画像とパルス画像におけるこの領域に沿った蛍光強度を測定し、各パルスの値をスプレッドシートに転記します。パルスデータからコントロールデータを引き、その結果をコントロールデータで除して、相対的な蛍光変化を求めます。一連のパルスを適用した場合は、各パルスで決定された相対変化の平均値を算出できます。より信頼性の高い測定値を得るために、相対的な蛍光変化を誘導膜電位に変換します。検量線を用いることで、文献からこの曲線の概算を得ることができますが、より高い精度を得るためには、個別のセットアップごとに測定する必要があります。相対的なアーク長に対する電圧の関数としてプロットしてください。また、球状細胞に適したフィルターを使用することで、曲線を平滑化することも可能です。得られたプロットは余弦関数に近く、Schwanの式と一致しています。より複雑な細胞形状の場合、同じ手順によって膜電位のより複雑な空間分布が得られます。

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回路基板と生体膜のモデル化と軸索の電気信号の測定：学生研究室の演習を

様々な生物学的システムにおける生体電流を測定する非侵襲的な振動プローブの製造、キャリブレーションおよび使用が記載されている。...

振動プローブによる生体電気の電流の測定

アンペロメトリック技術は自発的ドーパミンの酸化によって生成される酸化電流を検出することにより、単一細胞からのドーパミン放出を測定します。同時電圧クランプとアンペロメトリー方法論はドーパミントランスポーターおよびドーパミンの逆輸送上のこの活動の調節の役割の全体的な...

同時に電圧クランプとアンペロとドーパミン放出の単一細胞計測

ここでは、起電膜輸送体の特性評価への応用を中心とした固体担持膜に基づいて電気生理学的手法を提案する。...

電気生理学基づき固体支持された膜の概要

細胞膜のトランスポーターは、細胞膜または細胞層間でイオンを異なる分離することを可能にし、組織の生理学、修復、病理学において重要な役割を果たします。ここでは、in...

イオン選択自己参照微小電極法を用いた細胞外イオンフラックスの測定

細菌機械受容チャネル​​は、生体分子デバイスでmechanoelectricalトランスデューサとして使用することができます。そのようなデバイスへの液滴のインタフェース二重層（DIBを）、セル風のビルディングブロックは、機械受容チャネル​​を組み込むと刺激する新しいプラットフォームを表します。ここでは、機械的な刺激の下で機械受容チャネル​​の研究を可能にする、のDIBを形成する新しいマイクロピペットベースの方法を示しています。...

液滴界面二重層中に細菌機械受容イオンチャネルの取り込みおよび刺激のための多機能、マイクロピペットベースの方法

遺伝的にコード化された電圧指標を使用して膜電位の変化をイメージングする方法が説明されています。...

遺伝的にコードされた蛍光電圧センサーの2種類のイメージング膜電位

2段階の酵素手順を用いたヒト尿膀胱標本からの単一の単一の単離されたデトルザス平滑筋細胞の調製方法を記載する。得られた生存可能なDSM細胞は、生理学的および薬理学的特性を明らかにするために記載されたアンホテリシン-Bパッチクランプ電気生理学を含む様々な単一細胞技術によって研究することができる。...

9-フェナントロル感受性カチオン電流の特性評価のための新たに分離されたヒトデトルサトール平滑筋細胞の調製と利用

ここでは、市販の箸電極で使用できるプログラム可能な出力周波数を備えた安価なボルトアンペメーターを設定する方法を示します。...

プログラマブル出力周波数を備えた自作ボルトアンペメーターを用いてTEER測定を行う簡単なアプローチ

このプロトコルは、持続可能な金属有機フレームワーク/ポリマー混合マトリックス膜の製造と、電気化学的インピーダンス分光法を用いて、温度と湿度が変動する際の面内プロトン伝導率を正確に測定するための再現可能な方法論を説明しており、これは陽子交換膜燃料電池(PEMFC)に有用です。...

電気化学インピーダンス分光法によるMOF系混合マトリックス膜におけるプロトン伝導率の測定

学ぶ di-8-ANEPPSを用いた誘起膜電位測定法。電気パルス印加による細胞膜電位変化を蛍光顕微鏡で可視化し、膜ダイナミクスを非侵襲的に解析する手法を解説します。

ジ- 8 - ANEPPSで誘起膜電位の測定

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