ジ- 8 - ANEPPSで誘起膜電位の測定

生物学者にとって、細胞は生命の構成単位であり、内部にはそれぞれ特定の役割を担う数多くの異なる細胞小器官が含まれており、それらが共同して細胞に不可欠な機能を果たすことを可能にしています。しかし、電気的な視点からは内部構造はそれほど重要ではなく、細胞は絶縁性の膜に囲まれ、さらに導電性の外部環境に囲まれた導電性細胞質であると見なすことができます。イオン濃度のわずかな不均衡により、過剰なイオンが膜の近くに蓄積することで、静止膜電位が生じます。

細胞を電場の中に置くと、細胞膜の両側で局所的な電荷の再分布が起こります。その結果、誘導膜電位が生じ、これが静止電位に重畳し、電場を切ると消失します。単純な細胞形状の場合、球状細胞に対する誘導膜電位を解析的に算出することが可能です。

これはSchwanの式によって与えられ、電圧は電界強度と細胞サイズに比例し、細胞膜に沿ってコサイン関数に従うとされています。より複雑な細胞形状の場合、誘導電圧はコサイン関数から大きく逸脱する可能性があり、高性能コンピュータを用いた数値計算、または電位計染料を用いた実験的な手法で決定する必要があります。この目的で広く用いられている電位計染料の一つにdiBAC₄(3)があります。

膜電位に依存して励起および放出スペクトルが変化する高速染料であるAIPsは、膜に結合すると強い蛍光を発し、その蛍光強度の変化は膜電位の変化に比例します。このビデオでは、D AIPsを用いて誘起膜電位を測定するプロトコルを紹介します。本例では、チャイニーズハムスター卵巣細胞を使用し、1チャンバーあたり100,000個の細胞をチャンバー内に播種します。

胎児ウシ血清、L-グルタミン、および抗生物質を添加したHAMF 12培地を用いて、細胞を2〜4時間培養して球状の接着細胞を得るか、または16〜20時間培養してより複雑な形状の単一接着細胞を得ます。元のバイアル内でDiI-AAPSをDMSOに溶解し、10 mMのストック溶液を調製します。一部の細胞株では、膜への色素導入を容易にするために、追加のTriton X-100が必要な場合があります。1 mLのSpencer修正最小必須培地（SMEM）をEppendorfチューブに移し、2.5 µLの20% Triton X-100と3 µLの10 mM DiI-AAPSを加えます。

これにより、約30 µMのdiet aapsと0.05%のonicを含むローディング溶液が得られます。チャンバー内の培地をローディング溶液に交換します。その後、チャンバーを冷蔵庫に移し、4 °Cで10分間保持します。

染色後、細胞膜を介した染料の内部移行は大幅に抑制されるため、過剰な染料を純粋なSMEMで慎重に数回洗浄します。最後に、チャンバー内に1.5 millilitersのSMEMを残します。細胞は、油浸対物レンズ、モノクロメーター、およびCCDカメラを備えた蛍光顕微鏡を用いて観察します。

データ収集ソフトウェアで、励起波長を419 nanometersに設定し、約605 nanometersに設定されたバンドパスフィルターを選択します（本手順では適用していません）。Diet aapsでは、膜電位のレシオメトリック測定も可能です。細胞の入ったチャンバーを顕微鏡ステージに置き、電極をチャンバーの底部に配置してパルスジェネレーターに接続します。

この例では、振幅35 volts、持続時間50 millisecondの矩形パルスを生成します。DC電源とマイクロプロセッサ制御のスイッチャーを用いて、パルスを一対の電極に印加することで、電極間に電界を形成し、膜電位を誘導します。パルスの印加は、画像取得と同期させる必要があります。

目的の細胞を特定し、各パルスに対して単一の電気パルスまたは一連のパルスを印加します。染料の応答性が低いため、パルス直前のコントロール画像と、パルス印加中のパルス画像という2枚の蛍光画像を取得します。蛍光の変化は判別しにくいため、各パルスの画像を開いて処理を行った後にのみ明確になります。

コントロール画像とパルス画像の両方で背景減算を行います。細胞を1つ選択し、細胞膜に対応するように関心領域（ROI）を設定します。コントロール画像とパルス画像におけるこの領域に沿った蛍光強度を測定し、各パルスの値をスプレッドシートに転記します。

パルスデータからコントロールデータを引き、その結果をコントロールデータで除して、相対的な蛍光変化を求めます。一連のパルスを適用した場合は、各パルスで決定された相対変化の平均値を算出できます。より信頼性の高い測定値を得るために、相対的な蛍光変化を誘導膜電位に変換します。

検量線を用いることで、文献からこの曲線の概算を得ることができますが、より高い精度を得るためには、個別のセットアップごとに測定する必要があります。相対的なアーク長に対する電圧の関数としてプロットしてください。また、球状細胞に適したフィルターを使用することで、曲線を平滑化することも可能です。

得られたプロットは余弦関数に近く、Schwanの式と一致しています。より複雑な細胞形状の場合、同じ手順によって膜電位のより複雑な空間分布が得られます。