Name: 脊髄電気生理学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-18T16:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: 学ぶ新生マウスの脊髄電気生理学手法。腹側ラミネクトミーによる脊髄分離と電極への固定、神経活動記録の手順を解説。神経科学研究に応用可能な実験技術です。

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サミュエルL. Pfaffさんは、ソーク生物学研究所での遺伝子発現の研究​​室の教授、ハワードヒューズ医学研究所の研究者でもある。この作品は、クリフトファーリーブ麻痺財団によってサポートされていました。ジョーBelcovson、ソーク研究所のマルチメディアリソースのケントSchnoekerとマイクサリバンは写真撮影と編集との支援を行いました。

1。人工脳脊髄液（ACSF）1を準備します。まず、マグネシウムやカルシウムなしACSFの10X株式の2Lを用意。試薬はミリモルにリストされています。カタログ番号は、シグマ/アルドリッチを参照してください。 <table border="1" cellpadding="0"><tbody><tr><td colspan="4"> 2リットル10倍ACSF（マグネシウムまたはカルシウムなし） </td></tr><tr><td> 試薬 </td><td> mMの </td><td> g/2L </td><td> カタログ </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 40 </td><td> 5.96 </td><td> P - 9333 </td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 1280 </td><td> 149.61 </td><td> S - 7653 </td></tr><tr><td> NaHCO 3の </td><td> 210 </td><td> 35.28 </td><td> S - 6297 </td></tr><tr><td>のNaH 2 PO 4 </td><td> 5 </td><td> 1.38 </td><td> S - 9638 </td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 300 </td><td> 108.12 </td><td> D - 9434 </td></tr><tr><td colspan="4"> 2Lに蒸留水を追加します。 </td></tr></tbody></table>我々はまた、実験間のモル濃度の調整を可能にするために50mLの水にし、MgSO 4とCaCl 2の1M溶液を調製し、カルシウムの溶液中に残っている保証する。 <table border="1" cellpadding="0"><tbody><tr><td colspan="4"> 1Mカルシウムとマグネシウムの株式 </td></tr><tr><td> 試薬 </td><td> M </td><td> g/50mL </td><td> カタログ </td></tr><tr><td> CaCl 2の </td><td> 1 </td><td> 7.35 </td><td> C - 5080 </td></tr><tr><td> MgSO 4を </td><td> 1 </td><td> 12.33 </td><td> M - 5921 </td></tr></tbody></table> ACSF液が沈殿するカルシウムやカルシウムを加える前にpHを下げるためにcarbogen（95％O2 / 5％CO2）でガス処刑されている必要があります。 <table border="1" cellpadding="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1リットルのACSF </td></tr><tr><td> 試薬 </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td> 10X ACSF </td><td> 100mLの</td></tr><tr><td> 1MのCaCl 2 </td><td> 1 mLの（解剖）2mLの（記録） </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4を </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td colspan="2">カルシウムを添加する前に2分間carbogenと〜800 mLの蒸留水、ガスを追加</td></tr><tr><td colspan="2"> 1Lに蒸留水を追加。 </td></tr></tbody></table>ポンプとチューブと解剖皿は使用前と使用後に洗い流してください。 解剖解剖しながら、1mMのカルシウムACSFを連続してcarbogenでガス処刑されるべきである。 ACSFは、ボトルから解剖皿にサイフォンと解剖皿からボトルにポンプまたは無駄に送ることができます。我々は、エラストマー（Sylgard、ダウコーニング）解剖を行うためにコートしたディッシュを使用してください。 新生児マウスは、急速に鋭いはさみと腹側胸部と腹部を介してはさみで作られた切開で斬首されています。動物は、その後evisceratedている。 evisceratedマウスは、ACSFでリンスする。動物は、前肢を通って尾の基部に挿入された昆虫ピンと解剖皿に固定されます。 脊柱は、腹側椎弓切除を行うことにより除去される。脊柱は、小型の鉗子で保持され、小さなハサミの一方のブレードは骨性脊柱にすぐに背側に挿入されます。そっと骨脊柱を持ち上げながら、ラミナは、片側と他にカットされます。これは、脊柱の長さのために行われている。 脊髄は、脊髄神経根を切断し、脊髄を取り巻く髄膜をカットする脊髄の両側に沿って切断により除去される。私たちは、左右両側にカットし、我々はそれを解放するために脊髄の背側に接続されている髄膜をカット。分離されたコードは、追加の動物が解剖されていなくても、適切な酸素化を確実にするACSFの入口近くに皿に固定されます。 分離された脊髄は、小さなスプーンやヘラを使って録音皿に移している。ここでは、酸素2mMのカルシウムACSFで準備を灌流。脊髄は、エラストマーコーティングされた皿や根の近くで細胞外、全ルートの吸引電極を移動するために使用されるマイクロマニピュレータに固定されます。電極の先端がフリールートの終わり近くになると、穏​​やかな吸引は吸引電極にルートを描画に適用されます。このプロセスは、同時にいくつかの根を記録するために繰り返すことができます。 <img src="/files/ftp_upload/1660/1660fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。断頭と内臓摘出。A.急速に鋭いはさみでマウスを斬る。脳幹から多かれ少なかれ貢献カットのレベルに応じて達成することができます。断頭によって作成された胸腔の開口部にはさみのB.プレイスつのブレード。尾の付け根に腹胸部と腹部を開きます。内臓を取り出して、ACSFで洗い流してください。 <img src="/files/ftp_upload/1660/1660fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。脊柱の除去。A.コー​​ドに腹産卵の骨を介して脊髄やカットの右に脊柱と脊髄の間の空間にはさみの左のブレードを挿入します。その後、脊髄とカットの左に脊柱と脊髄の間の空間にはさみの右ブレードを挿入します。脊柱に穏やかなトラクションをかけながらB.はこのプロセスを繰り返します。低い角度でハサミを保持することによって穿刺脊髄にしないように注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/1660/1660fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。脊髄の除去。A.脊髄と脊髄への横方向敷設脊髄根と髄膜を介して脊髄やカットの右にある骨の間の空間にはさみの左のブレードを挿入します。その後、脊髄や脊髄への横方向敷設脊髄根と髄膜を介して脊髄やカットの左にある骨の間の空間にはさみの右のブレードを挿入します。 B.最後に、優しく吻側コードを持ち上げて、ラミナに背コードを接続する髄膜をカット。再び低角度でハサミを保持することによってではない穿刺に脊髄を注意してください。脊髄に近づきすぎて根を切断しないでください。

<ol><li>Myers, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+input+is+required+during+embryonic+development+to+mediate+proper+assembly+of+spinal+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits.</a> Neuron. 46, 37-49 (2005).</li>
<li>Goulding, M., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+circuits+that+generate+simple+rhythmic+behaviors+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates.</a> Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).</li>
<li>Gallarda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+axial+motor+and+sensory+pathways+via+heterotypic+trans-axonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling.</a> Science. 320, (2008).</li>
<li>Gosgnach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V1+spinal+neurons+regulate+the+speed+of+vertebrate+locomotor+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs.</a> Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).</li>
<li>Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+spinal+interneurons+that+coordinate+left-right+locomotor+activity+necessary+for+walking+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements.</a> Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).</li>
<li>Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+functionally+mature+mouse+spinal+cord+preparation+for+the+study+of+spinal+motor+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks.</a> Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).</li>
<li>Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+dual+modulatory+actions+on+spontaneous+postsynaptic+currents+in+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons.</a> J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).</li>
<li>Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+activity-dependent+network+depression+in+the+expression+and+self-regulation+of+spontaneous+activity+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord.</a> J Neurosci. 21 (22), 8966-8978 (2001).</li>
<li>Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride-sensitive+MEQ+fluorescence+in+chick+embryo+motoneurons+following+manipulations+of+chloride+and+during+spontaneous+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity.</a> J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).</li>
</ol>

動物ケア<br /&gt;<br /動物の&gt;実験はAIACUCソーク生物学研究所が定めたガイドラインと規則に従って行った。

孤立した新生児脊髄は神経系のdevelopment1、2を勉強の扱いやすい方法が用意されています。新生児げっ歯類の腰部脊髄の中で、中枢パターン発生回路は、神経伝達物質の存在下で虚構の歩行運動を生成することができます。この架空の運動は、0.2から0.5 Hzで生成される活動のリズムが増加する、バースト、で構成されています。これらのバーストは、コードと屈筋 - 伸交替（同側のL2 L5からの相対パス）の長さに沿って左右交互に生成するために編成されています。マウスのいくつかの遺伝的変異は、異常な挙動3-5有することが示されている。脊髄の神経回路が発達し、遺伝的摂動中に変更されている方法を理解することが他の中枢神経系における神経回路の研究を通知します。 それは、通常の使用中のいくつかの標準のACSFのソリューションがあることは注目に値する。以下一般的に使用されるACSF製剤のテーブルです。 表1：一般的なACSFの組成<table border="1" cellspacing="0"><tbody><tr><td> ...

<table><tbody><tr><td>KCl</td><td></td><td>P-9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>S-7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>S-6297</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td></td><td>D-9434</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>大型はさみ</td><td>Fine Science Tools</td><td>14070-12</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>精密はさみ</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>昆虫ピン</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 (Dow-Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1L メスフラスコ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100mL メスフラスコ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

脊髄電気生理学

Spinal Cord Electrophysiology

新生児マウスの脊髄には神経回路をして歩行運動の発展を研究するためのモデルです。我々は、脊髄の解剖と運動研究のために使用される記録のバスの人工脳脊髄液の準備を示しています。一度解剖、脊髄腹側神経根は、腰髄内の回路を生成する中枢パターンの電気生理学的信号を記録する記録電極に接続することができます。

電気生理学的研究のための新生児マウス脊髄の分離のデモンストレーション。

新生仔マウスの脊髄は、神経回路の発達および随意運動を研究するためのモデルです。本研究では、脊髄の…を実演します。

こんにちは。私はアラン・メイヤーです。ソーク研究所のfafラボでリサーチアシスタントを務めています。今日は、マウスの脊髄を単離するための腹側椎弓切除術の方法と、神経活動を記録するために脊髄を電極に固定する方法について説明します。脊髄用に、解剖用と記録浴用の2種類の溶液を準備する必要があります。2つの溶液の唯一の違いは、塩化カルシウムの濃度です。まず、10 X-A-C-S-F溶液を調製する必要があります。これには、以下に記載する試薬が必要です。まず、10 X-A-C-S-F 100 millilitersを1リットルのメスフラスコに加えます。次に、あふれないように余裕を持たせて、フラスコを水で満たします。ガス充填時は、5%CO2および95%O2のガス濃度の溶液を使用します。pHを下げて溶液に酸素を供給するため、1 M 硫酸マグネシウムを 1 mL 加えます。次に、解剖液に 1 M 塩化カルシウム溶液を 1 mL 加え、記録液に 1 M 塩化カルシウムを 2 mL 加えます。これらの実験には、胎生 E 16.5 から生後 P 4 までのマウスを使用できます。まず、鋭いハサミで迅速に断頭し、マウスの解剖を開始します。次に、腹側正中線に沿って尾まで切り開きます。その後、ピンセットを用いてマウスを摘出（内臓除去）し、A CSF溶液で洗浄します。1 mM 塩化カルシウム含有 A CSF を使用して解剖を行います。マウスを解剖皿に置き、4つの肢と尾の付け根にピンを刺して固定します。この工程の目的は、赤色の点線に沿って切開し、脊柱を脊髄を包む椎板から分離させることで、脊髄を単離することです。これにより、脊髄を露出させることができます。次に、ラインに沿って髄膜と脊髄神経根を切り出し、脊髄を遊離させます。脊柱の位置を確認し、片手でピンセットを用いて脊柱をしっかりと固定し、もう一方の手で小はさみを操作します。脊髄を取り出す際は、ハサミを低い角度に保ちます。ハサミの先端で脊髄を傷つけないよう、ここから脊髄の剥離を行います。赤線に沿って、髄膜と脊髄神経根を切断します。脊髄を摘出するには、脊髄の両側を切り、次に腹側正中線を沿って切断します。脊髄を穿孔しないよう、ハサミを低い角度で保持することが重要です。また、脊髄に近すぎない位置で神経根を切断するようにしてください。次に、脊髄を記録槽に移し、電極を脊髄根に接続します。電極を神経根の近くに配置します。その後、吸引を用いて神経を電極内にゆっくりと引き込みます。ご視聴ありがとうございました。このビデオが今後の実験のお役に立てば幸いです。

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

新生児げっ歯類の脊髄の電気生理学的記録を測定するために使用される細胞外吸引電極の製造と使用のデモンストレーション...

脊髄電気生理学II：細胞外吸引電極の作製

このビデオは、多電極アレイ(MEA)ベースのアッセイを使用して、固有脊髄接続の機能再生を示しています。脊髄スライスはMEA上に配置され、融合することができます。融合したスライスは、病変を作成することによって機械的に分離され、固有脊髄ニューロンが病変上で成長し、スライスを結合するように誘導されます。スライスの電気的活動を評価して、機能的な接続の再生を特定します。...

多電極アレイを用いた脊髄切片間の機能的接続の再生の研究

このビデオは、多電極アレイまたはMEAデバイスを使用してキャプチャされた、脊髄切片の器官型共培養からの電気生理学的記録を示しています。これらの記録は、スライス間のニューロン再生を評価します。観察された同期した電気的活動は、神経再生の成功を裏付けています。...

共培養脊髄切片におけるニューロン再生を評価するための電気生理学的記録

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中枢呼吸ドライブは脳幹にあります。孤立した脳幹-脊髄からの自発的な呼吸運動出力は、4番目の腹側ルートに電極を配置することによって記録されます。この実験的アプローチは、薬理学的研究や呼吸器の課題の評価、およびリズミカルな運動行動に対する遺伝子操作に有用です。...

新生児げっ歯類から単離された脳幹・脊髄調製物の電気生理学は、ニューラルネットワーク呼吸器の出力の記録を可能にします

ここでは、in vitroでの脊髄固有の接続の機能的再生を研究するために、マルチ電極アレイ上で培養脊髄スライスに基づいてされているプロトコルを提示します。...

マルチ電極アレイ上に成長させた器官脊髄共培養における機能的再生の調査

若いマウスで脊髄の斜めスライスを準備する方法を示します。この調製により、腹根の刺激が可能になります。...

前根刺激のための斜め脊髄スライスの調製

この原稿は、ゼブラフィッシュの胚および幼生の脊髄神経細胞からの電気生理学的記録のための方法を説明します。準備は、 その場で神経細胞を維持し、多くの場合、最小の切開を必要とします。これらのメソッドは、最初の電気的興奮の買収からの早期の幼虫の段階を経て、脊髄神経細胞の様々な電気生理学的研究が可能になります。...

ゼブラフィッシュ<em&gt;その場での</em&gt;脊髄脊髄感覚運動ニューロンからの電気生理学的記録のための準備

脊髄後角におけるネットワークレベルの侵害受容活性を調査するための微小電極アレイ技術と4-アミノピリジン誘発化学刺激の併用が概説される。...

微小電極アレイを用いた脊髄侵害受容回路におけるネットワーク活動の記録

このプロトコルは研究者が脊髄を分け、細胞生存率を同時に維持することの彼らの技術を改善するのを助けることができる高い時空間決断の脊髄の刺激(SCS)への運動ニューロンの電気応答を調査するのにパッチ・クランプを使用して方法を記述する。...

脊髄刺激時の運動ニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録のための脊髄スライスの ex vivo 調製

心機能の記録と心臓にロックされた脊髄後角ニューロンの分析と並行して、脊椎マルチチャネル細胞外記録のプロトコルについて説明します。この方法は、鍼治療によって誘発される胸部内臓機能変化の根底にある脊椎メカニズムを研究するための時間的に同期したフレームワークを提供します。...

ラット脊髄背角における心臓ロックニューロン応答に対する体細胞刺激のコードプロファイルの研究

学ぶ新生マウスの脊髄電気生理学手法。腹側ラミネクトミーによる脊髄分離と電極への固定、神経活動記録の手順を解説。神経科学研究に応用可能な実験技術です。

脊髄電気生理学

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