Name: リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 学ぶリバーシブルビオチン化法による原形質膜タンパク質のエンドサイトーシス率測定手法。ドーパミントランスポーターなどの膜タンパク質動態を解析し、細胞内輸送メカニズムの理解に貢献する実験プロトコルです。

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この作品は、＃DA15169 HEMにNIHの助成金によって賄われていた

手順の概要： このアプローチを使用して、細胞表面のタンパク質が共有結合膜の透過性を使用して、使用可能な外リジン残基上のビオチンで標識され、人身売買制限された条件下でのジスルフィド結合のビオチン化試薬（スルホ- NHS - SS -ビオチン）（すなわち、低温）（図1参照説明のため）。細胞の1つのセットが人身売買許容条件にシフトし（37℃）とビオチン化タンパク質は、内面化される。細胞の他のセットは、時間= 0で1）の総表面タンパク質、および2）ストリッピングコントロールのコントロールとして、低温で保持されます。内在化の短い期間の後、細胞が内在化を停止するために低温へシフトされ、任意の残留表面のビオチンは、ジスルフィド結合のビオチンを切断する還元剤、細胞を処理することによって取り除かれる。細胞表面から生じたと内面化されたビオチン化タンパク質は、ストリッピング工程から保護されており、残る唯一のビオチン化タンパク質となります。細胞溶解後、ビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーによって分離されていると、目的のタンパク質を定量的イムノブロットによって検出されます。エンドサイトーシス率を決定するために、内部化されたタンパク質の量は、時間= 0で標識の総表面の制御と比較されます。我々は、正常に神経ノルエピネフリン1とドーパミン1月4日トランスポーターの内在化の速度を測定するためにこのアプローチを使用している。 詳細なプロトコル： 1日目： <ol><li>彼らは2日目〜80％コンフルエントになるように、6ウェルプレートに細胞をプレート。また、トランスフェクトされた細胞が使用されている場合、それらが内在化の速度が測定される時点で〜80％コンフルエントになるような密度でトランスフェクト。細胞は強く付着していない場合、組織培養のウェアは、広範な洗浄ステップの間に細胞の損失を防ぐために、細胞接着基質（例えば、ポリ- D -リジン）で治療されるべきである。 </li><li>それぞれのタンパク質はテストされているため、1枚のプレートにプレート2ウェルを全表面のタンパク質（T = 0）とストリッピングコントロールとして使用される。第二の板上に、テスト対象の各内面化の条件のためのウェルプレート1つ（すなわち基礎エンドサイトーシスのレートと薬剤処理された）。 </li><li> 2日目に使用するために指示された温度で、以下のソリューションとストアを準備します。 <ul><li> PBS 2 +：リン酸1.5mMのMgCl 2、0.2mMのCaCl 2で 、（4℃）を添加した液（pH7.4）緩衝生理食塩水</li><li> ビオチン化は解決策をクエンチ ：PBS 2 + 100 mMグリシン、（4℃）で補足</li><li> NTバッファー ：150mMのNaCl、1.0mMのEDTA、0.2％BSA、20 mMトリス、pH 8.6、（4 ° C） </li><li> RIPAバッファー ：10 mMトリス、pH 7.4、150mMのNaCl、1.0mMのEDTA、0.1％SDS、1.0％トリトンX 100、1.0％デオキシコール酸ナトリウム、（4℃） </li><li> スルホ- NHS - SS -ビオチンの原液 ：200 mg / mlの、（-20℃）に（DMSO）ジメチルスルホキシドに溶解</li><li> トリス（2 -カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）ストック溶液：H 2 O中の500mM、（-20 ° C、光を遮断するために箔で覆われて） </li></ul></li></ol> 2日目： <ol><li> PBS 2 + 0.18g/mlグルコースを補充した、0.2％のIgG /（PBS 2 + / G / BSA）プロテアーゼフリーウシ血清アルブミンを準備します。 ℃の水浴中で37に予熱するこのソリューション。 </li><li> DMSOを溶かすためにベンチの上にスルホ- NHS - SS -ビオチンの原液を解凍。使用直前に、新鮮なスルホ- NHS - SS -ビオチン溶液（0.75ミリリットル/ウェルのに十分な氷冷PBS 2で2.5 mg / mlの+を 、）準備。 DMSOを可溶化するために激しくボルテックスするソリューション。 NHS -ビオチン試薬が水溶液中で容易に加水分解されることに注意してください。したがって、すべてのソリューションは、使用直前に準備する必要があります。 </li><li> ビオチン化：低温室で氷浴上に置いてプレートと氷冷PBS 2 +と3 × 2 mlをすすいでください。プレートをわずかに完全な排水及び緩衝液の除去を可能にするために角度していることを確認して。 /ウェルの各ウェルに新鮮スルホ- NHS - SS -ビオチン溶液0.75 mlを加え。インキュベート× 15"、4℃激しく振盪と氷浴上でC。インキュベーションが完了したら、別の新鮮なスルホ- NHS - SS -ビオチン溶液を調製。新鮮な溶液とインキュベート× 15"、4℃で古いソリューションを置き換える</li><li> 焼入れ：彼らはと反応し、細胞が溶解されると細胞内タンパク質のビオチニル化することのないよう、すべての非反応NHS -ビオチン分子が消光されていることが重要です。焼き入れ液で細胞を3 × 2 mlを洗浄し、2mlのクエンチの解x 15'、4℃穏やかに振盪しながらCで二回インキュベートする。 </li><li> 内部化：薬物治療がテストされている場合は、PBS 2 + / G / BSAに適切な薬物濃度を追加。 4℃で制御プレートを保持し、内在化プレートを低温室から引き出す。予め温めておいたPBS 2で3 × 2 mlを洗う+ / G / BSA（+ / - DRUGS）と同じ解（2ミリリットル/ウェル）に残す。プレート全体に均一な温度を確保するために予め温めておいたソリューションを持つ空の井戸を埋める。 10'、37℃のインキュベーターにセルを転送する。 37℃のインキュベーションを終了する直前に、氷の上でストリッピング工程とストアに使用するNTのバッファで新鮮なの50mM TCEP溶液を調製。 1.0ミリリットル/ウェルのために十分な量を準備します。 </li><li> ストリップ：氷浴と低温室へ復帰にすぐ転送プレート（S）。迅速にエンドサイトーシスを停止するために、氷冷NT緩衝液で3 × 2 mlを細胞を洗浄。また、NTバッファーでストリップコントロールウェルを3 × 2 mlを洗う。各ウェルに1.0 mlの新鮮な剥離液を追加。静かに振とうしながら、氷上で15'、4℃インキュベートする。新鮮な剥離液で井戸を交換し、氷上でさらに15'、4℃でインキュベートする。 </li><li> 溶解：剥離液、3 × 2ミリリットルNTバッファにさらされたすべてのウェルを洗う。その後、3 × 2 mlのPBS 2 +との（合計コントロールを含む）すべてのウェルを洗う。新鮮なプロテアーゼ阻害剤（1.0mMのPMSF、1.0μg/ mlの各ロイペプチン、アプロチニン及びペプスタチン）を含む300μl/wellRIPA緩衝液（または関心のあるタンパク質のための互換性のあるその他の溶解バッファー）に溶解する。 × 20"、4℃で振とうすることにより溶解18000 × gで、10'、4℃で遠心分離することによってマイクロチューブと明確な細胞の破片に転送する</li><li> タンパク質濃度測定：標準BSAの曲線と比較して溶解物のタンパク質濃度を決定するために溶解条件（例：DCプロテインアッセイ、Bio - Rad社）と互換性のあるタンパク質アッセイを使用してください。 </li><li> ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィー ：各サンプルのタンパク質に相当する量のマイクロチューブを準備します。 200μlの各サンプルの最終容量を持って来るために溶解バッファーを追加します。激しくボルテックスストレプトアビジンアガロースビーズをさらに懸濁液に持参する。先端で200μlのピペットを使用すると、各チューブに、ピペットのビーズを切断。 20μlのbeads/50μgのライセートをお勧めします。チューブローテーターで一晩、4℃でインキュベートする。 </li></ol> 3日目： <ol><li> ビーズの洗浄：遠心分離機のサンプルを、18,000 × gで、2'ビーズを収集する。アスピレーターでビーズペレットに接近しないように注意しながら、ライセートをオフに吸引除去する。よりよいコントロールのための吸引器の端にあるプラスチック製のピペットチップを使用してください。各試験管に0.75 mlの溶解バッファーを追加し、ビーズを洗浄する渦。遠心サンプル、18,000 × gで、2'ビーズと繰り返し吸引を収集し、（合計で3回洗浄）回洗浄する。最終洗浄後、ビーズペレットを乱すことなく、できるだけバッファをできるだけ多く吸引除去する。アスピレーターに向かってチューブを傾けることは、このステップを支援します。 </li><li> サンプルの溶出：各チューブに20 -25μlの2 × Laemmliサンプル緩衝液（還元）を追加。還元剤を切断するには、溶液中に単離されたタンパク質を放出、NHS - SS -ビオチンのジスルフィド結合なります。ほとんどの膜タンパク質は、沸騰時に凝集に対して非常に脆弱であり、SDS - PAGE用ゲルにロードする前に加熱してはいけません。これらの実験を実行する前に目的のタンパク質の熱感度を決定する。タンパク質が/沸騰加熱に耐えられない場合、SDS - PAGEによって分析する前にローテータ、30'、室温でインキュベートする。これは、開裂するジスルフィド結合に十分であるとタンパク質を溶出させる。 </li><li> SDS - PAGEとイムノブロッティング：SDS - PAGEにより分離タンパク質。各サンプルについて、次の順序でサンプルを実行するのが最も簡単です：あなたの蛋白質のための適切な抗体との合計面（時間= 0）、ストリップ、内在化の条件＃1、状態＃2、などイムノブロッティング用メンブレンに移しブロット興味のある。は飽和ピクセルが存在しないことが確実であること、CCDカメラのゲルドキュメンテーションシステムを使って免疫反応性バンドをキャプチャします。ゲル分析/デンシトメトリーのソフトウェアを使用して各バンドの密度を定量化する。 </li></ol>代表的な結果： 代表的なイムノブロットの結果は、図2Aに示されています。最も強い信号は、前のインターナリゼーションに表面のタンパク質の総量である"合計"レーン（T）、になります。 "ストリップ"制御（S）は、理想的にストリップが実験のために効率的であることを示す空白、に近い必要があります。ストリップの効率は、"合計"車線のように、"ストリップ"車線の密度を比較して算出されます（ストリップと平行してビオチン化された例えば、タンパク質が、どちらも37℃に加温しされず、剥離液にさらされていた）。次の式が使用されます。 [1 - （ストリップ/合計）] * 100％ この式を用いて、図2のストリップは、効率的な99.8％であった。最後に、内在化の車線の合計（秒）（I）よりも低い強度のバンドが表示されます。例（図2）においては、処理された細胞は、10時の最初のインターナリゼーションの時代"内在化し、ドーパミントランスポーターの内在化率は10で測定された"車両または1μMホルボールミリステートアセテート（PMA）のどちらかで処理した。内部化率は次のように計算されます次のとおりです。 合計/内部化* 100 図2Bに示すように、10.4％表面DATは、溶媒投与の条件下で10'を介して内面化。 PMA治療は、全表面のDATの23.2％にDATの内在化率を増加させた。 <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。プロトコルのイラスト。細胞は° Cが独占的に表面の人口にラベルを付けるために4でビオチン化されている、と℃の内部移行を開始するために37にシフトされます。内在化に続いて、細胞が急速にエンドサイトーシスプロセスを停止するには、冷却され、残りの表面のビオチンは、還元剤で細胞を処理することにより除去されます。残っている唯一のビオチン化タンパク質は、このようにストリッピング治療からそれらを保護し、t = 0で表面から生じたと内面化されたものです。ビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンビーズを使用してバッチアフィニティークロマトグラフィーによって分離されていると、目的のタンパク質は、イムノブロッティングにより検出される。 <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 PKC活性化はDATエンドサイトーシスの速度。内在化アッセイを増加させる 。安定的にDATの発現PC12細胞をビオチン化し、4℃などの"詳細なプロトコル"で説明されている。れました細胞は急速に37加温した℃± 1μMPMAとインキュベートさ10'、37℃残留ビオチンが低減することにより除去された、細胞を溶解し、ビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーにより単離した。 （A）代表のイムノブロットは、全体の表面のDATを示す時刻t = 0（T）、ストリップコントロール（S）、および指定された条件の下で内部化されたDAT（I）。 （B）バンドは、CCDカメラで捕捉し、数量データソフトウェア（Bio - Rad）を定量した。データは、％の合計DAT internalized/10の分として表現さ​​れています。 <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。例の免疫ブロット法は、貧しい人々ビオチンのストリップ。内在化アッセイを描いた 。安定的にDATの発現PC12細胞をビオチン化し、4℃などの" 詳細なプロトコル "で説明されている。れました細胞は急速に℃、インキュベーション10'、37℃37℃に温めていた残留ビオチンが低減することにより除去された、細胞を溶解し、ビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーにより単離した。免疫ブロットは、t = 0（T）、ストリップコントロール（S）、および内部化DAT（I）における総表面積DATを示しています。貧しいストリップの効率を示す、ストリップコントロールのレーンに表示されるバンドに注目してください。

<ol><li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li>
<li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li>
<li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+transporter+endocytic+determinants%3A+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li>
<li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li>
</ol>

一般的な問題 ：これらの実験で発生する最も一般的な問題は、貧しいストリップ効率です。ストリップの効率は、結果を解釈できることに非常に重要です。ストリップは非常に効率的でない限り、それは内面化の車線内の任意のビオチン化タンパク質は、実際には、表面から内部化されたと結論することはできません。ストリップ≥90％の効率が最適であり、そしてストリップがこのレベルを下回る場合に我々は何も結果を破棄する。貧しいストリップの例を図3に示されています。ストリップの車線のバンドがかなり見えていて、34％のストリップの効率に相当することに注意してください。貧しいストリップ効率が発生した場合は、新鮮なTCEPは、細胞に加える直前に調製されていない可能性があります。また、TCEPが低下する可能性がありますし、新しい試薬は購入する必要があります。 TCEP粉末の使用は、むしろ解決策はなく、この問題を回避することがあります。 実行可能な変更：現行のレポートでは、我々は内在化の最初の10分かけて撮影した相対的なDATの内在化率を、測定、およびPKCの活性化中にDATの内在化の速度に...

リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

細胞膜タンパク質は、受容体、イオンチャネル、トランスポーターとポンプで構成されるタンパク質の大規模、多様なグループです。これらのタンパク質の活性は栄養デリバリー、細胞の興奮、および化学的シグナル伝達を含む主要な携帯電話のイベント、様々な責任があります。多くの細胞膜タンパク質は、動的にタンパク質の表面発現を変化させることによってタンパク質の機能を調節するエンドサイトーシスの人身売買、によって規制されている。タンパク質のエンドサイトーシスを促進するメカニズムは複雑であり、完全に多くの膜蛋白質のために理解されていません。完全に与えられたタンパク質のエンドサイトーシス売買を制御するメカニズムを理解するためには、それはタンパク質のエンドサイトーシスの速度を正確に測定することが重要です。多くの受容体の場合は、直接エンドサイトーシスの速度の測定は、頻繁に標識された受容体リガンドを利用して実現されています。しかし、そのようなトランスポーター、ポンプ、イオンチャネルなど膜タンパク質の多くのクラスに対して、エンドサイトーシス速度を測定するために使用できる便利なリガンドはありません。本報告では、我々はドーパミントランスポーター（DAT）エンドサイトーシス率を測定するために採用することを可逆的ビオチン化の方法を説明します。このメソッドは、内在化率を測定するための直接的なアプローチを提供し、容易にほとんどの膜タンパク質の人身売買の研究に用いることができる。

規制エンドサイトーシスは、膜タンパク質の大部分の細胞表面発現レベルを制御します。ここでは、ドーパミントランスポーター（DAT）、ポリトープ膜​​タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するために還元、膜非透過性ビオチン化試薬を利用する。メソッドは、ほとんどの細胞膜タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するための直接的なアプローチを促進する。

細胞膜タンパク質は、受容体、イオンチャネル、トランスポーター、およびポンプから構成される、大きく多様なタンパク質のグループです。これらのタンパク質の活性は...

本プロトコルでは、還元可能な膜透過性試薬を用いて、ほとんどの細胞膜タンパク質のエンドサイトーシス速度を測定する一般的な方法を提供します。この手順では、細胞表面の細胞外リシンを含むタンパク質、または4 °Cでsulfo-NHS-SS-biotin（ここでは緑色で表示）を用いて共有結合的に標識されたタンパク質を標的とします。次に、細胞を37 °Cに温めて表面タンパク質のエンドサイトーシスを誘導します。その後、細胞を再び4 °Cに戻して膜輸送を停止させ、ジスルフィド結合を切断する還元剤を用いて、表面に残存するビオチンを除去（ストリッピング）します。これにより、細胞表面に由来し、内部に取り込まれたことでストリッピング処理から保護されたビオチン化タンパク質のみが残ります。最後に、細胞を可溶化し、ストレップアビジンおよびアフィニティクロマトグラフィーによってビオチン化タンパク質を単離します。こんにちは、マサチューセッツ大学医学部精神医学科のHeli Milkian研究室のLuke Gabrielです。本日は、可逆的ビオチン除去法を用いてエンドサイトーシスまたは内在化速度を測定する方法について解説します。本手順では、ドーパミントランスポーターの内在化速度を測定します。それでは始めていきましょう。実験の前日に、翌日使用するための細胞と基質を準備します。細胞の種類と培地は異なりますが、実験に使用する細胞の接着性が低い場合は、ポリリシンコート組織培養プレートなどの適切な細胞接着基質を各6ウェルプレートに使用してください。2枚の別々のプレートを使用して、合計4つのウェルにラベルを貼ります。テストする各タンパク質について、コントロールプレートの2ウェルを全表面タンパク質およびストリッピングコントロールに使用します。テストする各内部移行条件に対して、実験プレートにウェルを準備します。翌日までに細胞が約80%コンフルエントになるように、2 mLの細胞培養液に1×10⁶個の細胞を播種します。細胞の培養後、以下の溶液を調製し、2日目に使用できるよう4 °Cで保存します。PBS 2+は、pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水に1.5 mMの塩化マグネシウムと0.2 mMの塩化カルシウムを添加して調製します。Tonationクエンチ溶液は、PBS 2+に100 mMのグリシンを添加して調製します。NTバッファーは、150 mMの塩化ナトリウム、1 mMのEDTA、0.2% BSA、および20 mMのTris（pH 8.6）を用いて調製します。Ripaバッファーは、10 mMのTris（pH 7.4）、150 mMの塩化ナトリウム、1 mMのEDTA、0.1% SDS、1% Triton X-100、および0.1%のデオキシコール酸ナトリウムを用いて調製します。次に、SULF N-H-S-S-S biotinストック溶液を、SULFOXIDEまたはDMSOに溶解して200 mg/mLの濃度で調製します。500 µLずつ分注し、-20 °Cで保存してください。分注した溶液は、この後数回の凍結融解サイクルを繰り返しても問題ありません。50 mM Trisに溶解し、pHを7.4に調整して、500 mM濃度の2-カルボキシエチルホスフィン塩酸塩（TCEP）ストック溶液を調製します。TCEPは強い酸性であるため、溶液のpHを7.4に調整する必要があります。TCEPをアルミホイルで遮光し、-20 °Cで保存します。2日目に、0.18%グルコースおよび0.2%IgGプロテアーゼフリーウシ血清アルブミンを添加したPBS 2+、またはPBS 2+ GBSAを調製し、ウォーターバスで37 °Cに予熱します。SFO N-H-S-S-S biotinストック溶液を室温で解凍します。使用直前に、ボルテックスを用いて激しく攪拌し、DMSOを溶解させ、新鮮な硫黄 N-H-S-S-S biotin溶液を調製します。2枚のプレートを低温室の氷上に置き、各ウェルを2 mLの氷冷PBS 2+で3回洗浄します。その際、バッファーを完全に排出させるため、プレートをわずかに傾けて保持してください。最後の洗浄後、各ウェルに0.75 mLの新鮮なsulfo-NHS-SS-biotin溶液を添加します。氷上、4 °Cで15分間インキュベートし、インキュベーション終了直前までプラットフォームシェーカーで激しく振盪させます。別の新鮮なSUHO N-H-S-S-S biotin溶液を調製し、15分後に古い溶液を新鮮な溶液に交換します。2回目のインキュベーション後、プラットフォームシェーカーを用いて激しく振盪しながら、4°Cでさらに15分間インキュベートします。その後、2 mLのクエンチング溶液を用いて細胞を迅速に3回洗浄し、反応していないすべてのNHS biotin分子をクエンチします。次に、2 mLのクエンチング溶液中で15分間インキュベートします。15分後に新しい停止液と交換し、さらに15分間インキュベートします。各インキュベーションの間、プレートはプラットフォームシェーカーを用いて4°Cで緩やかに振盪させ、対照プレートは冷暗室のベンチトップ上の停止液内に保持します。この時点で、実験用プレートを氷浴とともに冷暗室から取り出します。薬剤処理の試験を行う場合は、あらかじめ温めておいたPBS 2 + GBSAに適切な濃度の薬剤を添加します。本手順では、PKCパスウェイを活性化させるために、エタノール溶媒、または1 µMの PMA（フォールボイル・ミリストエート・アセテート）のいずれかを使用します。実験プレートの各ウェルを、あらかじめ温めておいたPBS 2 + GBSAで3回、2 mLずつ洗浄し、最後の洗浄後に適切な薬剤処理を添加します。対応するPBS 2 + GBSA溶液を2 mL加え、プレート全体の温度を均一にするため、空いているウェルにはあらかじめ温めておいた培地を満たします。インキュベーション終了の直前に、細胞を37 °Cのインキュベーターに10分間移します。NTバッファーを用いた50 mM TCEP溶液を使用して新鮮なストリッピング溶液を調製し、氷上に保存します。1ウェルあたり1 mLとなる十分な量を調製します。10分間のインキュベーション後、速やかに実験プレートを氷上のバスに移し、コールドルームに戻します。エンドサイトーシスを停止させるため、1ウェルあたり2 mLの氷冷NTバッファーを用いて、実験ウェルを3回迅速に洗浄します。次に、ストリッピングコントロールウェルを2 mLの氷冷NT緩衝液で3回洗浄します。トータルコントロールウェルはクエンチ溶液に入れたままにします。各実験ウェルおよびストリッピングコントロールウェルに1 mLのストリッピング溶液を加え、氷上で15分間インキュベートします。インキュベーションが終了するまで、4°Cで緩やかに振盪します。再び、前回と同様に同量の新鮮なストリッピング溶液を準備します。15分後、古いストリッピング溶液を新鮮な溶液に交換し、細胞をあらかじめ溶解させるため、4°Cで緩やかに振盪しながらさらに15分間インキュベートします。ストリッピング溶液にさらしたすべてのウェルを、2 mLのNTバッファーで3回洗浄します。次に、トータルコントロールを含むすべてのウェルを、2 mLの冷PBSで3回洗浄します。最後の洗浄後、新鮮なプロテアーゼ阻害剤を含むRIPPAバッファー300 µLを各ウェルに加え、4 °Cで20分間振盪して細胞を溶解させます。溶解液を1.5 milliliterマイクロチューブに移し、18, 000 GS、4 °Cで10分間遠心分離して細胞残渣を除去します。溶解条件に適したタンパク質定量法（例えばPierce社のBCA protein assayなど）を用いて、ウシ血清アルブミンの標準曲線と比較し、溶解液中のタンパク質濃度を測定します。その後、strepおよびアフィニティークロマトグラフィー用に溶解液を調製します。1.5 mL マイクロ遠心チューブに、各サンプルから同量のタンパク質を分注します。本実験では、50 µg の細胞溶解液からビオチン化タンパク質を単離します。各サンプルに、プロテアーゼ阻害剤を含む RIPA バッファーを加え、最終容量を 200 µL とします。次に、strep avidビーズとagroビーズを使用前に激しくボルテックスし、チップを切断した200 µLピペッターを用いて、各チューブにstripping済みのavidビーズとビーズを20 µLずつ分注します。チューブをボルテックスし、チューブローテーターを用いて4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、室温で18,000 Gで2分間遠心分離してビーズを回収します。アスピレーターでビーズペレットに近づけないよう注意しながら、ライセートを吸引除去し、室温の0.75 mLを添加します。各チューブにRipバッファーを加え、最高速度でボルテックスしてビーズを洗浄します。18,000 GSで2分間遠心分離します。室温でビーズを回収し、この洗浄・ボルテックス・遠心分離のサイクルをさらに2回繰り返し、計3回の洗浄を行います。ビーズのペレットを乱さないように、可能な限りバッファーを吸引して除去します。次に、各チューブに20〜25 µLの2×還元ラメル bufferを添加します。還元剤がN-H-S-S-Sビオチンジスルフィド結合を切断し、単離されたタンパク質が溶液中に放出されます。ほとんどの膜タンパク質は加熱に耐えられないため、還元および変性後、チューブをローターにかけ、室温で30分間インキュベートしてタンパク質を分離します。標準的なSDS-PAGEを用いて、タンパク質を膜に転写して免疫ブロッティングを行い、適切な抗体でブロットします。本実験では、Checon社のラット抗DAT抗体（製品番号3609）を1:2000に希釈して使用します。飽和ピクセルが出ないように注意しながら、CCDカメラ搭載のゲルドキュメンテーションシステムを用いて免疫反応性のバンドをキャプチャします。本実験では、Bio-Rad社のVersaDocイメージングシステムとQuantity Oneソフトウェアを使用して、各バンドの密度を定量化しています。ドパミントランスポーター的可逆的標識の手順における代表的なイムノブロットをここに示します。最も強いシグナルは、Totalレーン（T）に見られるインターナリゼーション前の表面タンパク質の総量です。ストリップコントロール（S）は、理想的にはブランクに近く、高いストリップ効率を示すべきです。ストリップ効率は、以下の計算式を用いてバンド密度測定値から算出します。本実験におけるこのストリップの効率は99.8%でした。効率が90%以上のストリップが最適であり、このレベルを下回る結果は破棄する必要があります。このポアストリップの例では、ストリップレーンに可視的なバンドが認められますが、ストリップ効率は34%です。ここでは、強度の低いバンドが実験プレートからのインターナリゼーションレーンとなります。細胞をビヒクル溶液または1 µMのPMAで10分間インターナリゼーション処理し、ドーパミントランスポーターのインターナリゼーション率を測定しました。内部移行率は、バンド密度の測定を用いて次のように算出されます。このグラフに見られるように、ビークル処理条件下では、10分間で表面DATの10.4%が内部移行しました。一方、PMA処理により、DATの内部移行率は全表面DATの23.2%まで増加しました。以上で、可逆的ビオチン化法を用いて細胞膜タンパク質の内部移行率を測定する方法について解説しました。バイオトネーション試薬およびTCPは、使用直前に調製することが重要であるという2つの点を覚えておいてください。プロトコルの途中で細胞の脱落が多く見られる場合は、プレートに細胞接着基質を使用してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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