リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

本プロトコルでは、還元可能な膜透過性試薬を用いて、ほとんどの細胞膜タンパク質のエンドサイトーシス速度を測定する一般的な方法を提供します。この手順では、細胞表面の細胞外リシンを含むタンパク質、または4 °Cでsulfo-NHS-SS-biotin（ここでは緑色で表示）を用いて共有結合的に標識されたタンパク質を標的とします。次に、細胞を37 °Cに温めて表面タンパク質のエンドサイトーシスを誘導します。その後、細胞を再び4 °Cに戻して膜輸送を停止させ、ジスルフィド結合を切断する還元剤を用いて、表面に残存するビオチンを除去（ストリッピング）します。

これにより、細胞表面に由来し、内部に取り込まれたことでストリッピング処理から保護されたビオチン化タンパク質のみが残ります。最後に、細胞を可溶化し、ストレップアビジンおよびアフィニティクロマトグラフィーによってビオチン化タンパク質を単離します。こんにちは、マサチューセッツ大学医学部精神医学科のHeli Milkian研究室のLuke Gabrielです。

本日は、可逆的ビオチン除去法を用いてエンドサイトーシスまたは内在化速度を測定する方法について解説します。本手順では、ドーパミントランスポーターの内在化速度を測定します。それでは始めていきましょう。

実験の前日に、翌日使用するための細胞と基質を準備します。細胞の種類と培地は異なりますが、実験に使用する細胞の接着性が低い場合は、ポリリシンコート組織培養プレートなどの適切な細胞接着基質を各6ウェルプレートに使用してください。2枚の別々のプレートを使用して、合計4つのウェルにラベルを貼ります。

テストする各タンパク質について、コントロールプレートの2ウェルを全表面タンパク質およびストリッピングコントロールに使用します。テストする各内部移行条件に対して、実験プレートにウェルを準備します。翌日までに細胞が約80%コンフルエントになるように、2 mLの細胞培養液に1×10⁶個の細胞を播種します。

細胞の培養後、以下の溶液を調製し、2日目に使用できるよう4 °Cで保存します。PBS 2+は、pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水に1.5 mMの塩化マグネシウムと0.2 mMの塩化カルシウムを添加して調製します。Tonationクエンチ溶液は、PBS 2+に100 mMのグリシンを添加して調製します。NTバッファーは、150 mMの塩化ナトリウム、1 mMのEDTA、0.2% BSA、および20 mMのTris（pH 8.6）を用いて調製します。Ripaバッファーは、10 mMのTris（pH 7.4）、150 mMの塩化ナトリウム、1 mMのEDTA、0.1% SDS、1% Triton X-100、および0.1%のデオキシコール酸ナトリウムを用いて調製します。

次に、SULF N-H-S-S-S biotinストック溶液を、SULFOXIDEまたはDMSOに溶解して200 mg/mLの濃度で調製します。500 µLずつ分注し、-20 °Cで保存してください。分注した溶液は、この後数回の凍結融解サイクルを繰り返しても問題ありません。

50 mM Trisに溶解し、pHを7.4に調整して、500 mM濃度の2-カルボキシエチルホスフィン塩酸塩（TCEP）ストック溶液を調製します。TCEPは強い酸性であるため、溶液のpHを7.4に調整する必要があります。TCEPをアルミホイルで遮光し、-20 °Cで保存します。2日目に、0.18%グルコースおよび0.2%IgGプロテアーゼフリーウシ血清アルブミンを添加したPBS 2+、またはPBS 2+ GBSAを調製し、ウォーターバスで37 °Cに予熱します。

SFO N-H-S-S-S biotinストック溶液を室温で解凍します。使用直前に、ボルテックスを用いて激しく攪拌し、DMSOを溶解させ、新鮮な硫黄 N-H-S-S-S biotin溶液を調製します。

2枚のプレートを低温室の氷上に置き、各ウェルを2 mLの氷冷PBS 2+で3回洗浄します。その際、バッファーを完全に排出させるため、プレートをわずかに傾けて保持してください。最後の洗浄後、各ウェルに0.75 mLの新鮮なsulfo-NHS-SS-biotin溶液を添加します。氷上、4 °Cで15分間インキュベートし、インキュベーション終了直前までプラットフォームシェーカーで激しく振盪させます。

別の新鮮なSUHO N-H-S-S-S biotin溶液を調製し、15分後に古い溶液を新鮮な溶液に交換します。2回目のインキュベーション後、プラットフォームシェーカーを用いて激しく振盪しながら、4°Cでさらに15分間インキュベートします。その後、2 mLのクエンチング溶液を用いて細胞を迅速に3回洗浄し、反応していないすべてのNHS biotin分子をクエンチします。次に、2 mLのクエンチング溶液中で15分間インキュベートします。

15分後に新しい停止液と交換し、さらに15分間インキュベートします。各インキュベーションの間、プレートはプラットフォームシェーカーを用いて4°Cで緩やかに振盪させ、対照プレートは冷暗室のベンチトップ上の停止液内に保持します。この時点で、実験用プレートを氷浴とともに冷暗室から取り出します。

薬剤処理の試験を行う場合は、あらかじめ温めておいたPBS 2 + GBSAに適切な濃度の薬剤を添加します。本手順では、PKCパスウェイを活性化させるために、エタノール溶媒、または1 µMの PMA（フォールボイル・ミリストエート・アセテート）のいずれかを使用します。実験プレートの各ウェルを、あらかじめ温めておいたPBS 2 + GBSAで3回、2 mLずつ洗浄し、最後の洗浄後に適切な薬剤処理を添加します。

対応するPBS 2 + GBSA溶液を2 mL加え、プレート全体の温度を均一にするため、空いているウェルにはあらかじめ温めておいた培地を満たします。インキュベーション終了の直前に、細胞を37 °Cのインキュベーターに10分間移します。NTバッファーを用いた50 mM TCEP溶液を使用して新鮮なストリッピング溶液を調製し、氷上に保存します。

1ウェルあたり1 mLとなる十分な量を調製します。10分間のインキュベーション後、速やかに実験プレートを氷上のバスに移し、コールドルームに戻します。エンドサイトーシスを停止させるため、1ウェルあたり2 mLの氷冷NTバッファーを用いて、実験ウェルを3回迅速に洗浄します。

次に、ストリッピングコントロールウェルを2 mLの氷冷NT緩衝液で3回洗浄します。トータルコントロールウェルはクエンチ溶液に入れたままにします。各実験ウェルおよびストリッピングコントロールウェルに1 mLのストリッピング溶液を加え、氷上で15分間インキュベートします。

インキュベーションが終了するまで、4°Cで緩やかに振盪します。再び、前回と同様に同量の新鮮なストリッピング溶液を準備します。15分後、古いストリッピング溶液を新鮮な溶液に交換し、細胞をあらかじめ溶解させるため、4°Cで緩やかに振盪しながらさらに15分間インキュベートします。

ストリッピング溶液にさらしたすべてのウェルを、2 mLのNTバッファーで3回洗浄します。次に、トータルコントロールを含むすべてのウェルを、2 mLの冷PBSで3回洗浄します。最後の洗浄後、新鮮なプロテアーゼ阻害剤を含むRIPPAバッファー300 µLを各ウェルに加え、4 °Cで20分間振盪して細胞を溶解させます。

溶解液を1.5 milliliterマイクロチューブに移し、18, 000 GS、4 °Cで10分間遠心分離して細胞残渣を除去します。溶解条件に適したタンパク質定量法（例えばPierce社のBCA protein assayなど）を用いて、ウシ血清アルブミンの標準曲線と比較し、溶解液中のタンパク質濃度を測定します。その後、strepおよびアフィニティークロマトグラフィー用に溶解液を調製します。

1.5 mL マイクロ遠心チューブに、各サンプルから同量のタンパク質を分注します。本実験では、50 µg の細胞溶解液からビオチン化タンパク質を単離します。各サンプルに、プロテアーゼ阻害剤を含む RIPA バッファーを加え、最終容量を 200 µL とします。

次に、strep avidビーズとagroビーズを使用前に激しくボルテックスし、チップを切断した200 µLピペッターを用いて、各チューブにstripping済みのavidビーズとビーズを20 µLずつ分注します。チューブをボルテックスし、チューブローテーターを用いて4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、室温で18,000 Gで2分間遠心分離してビーズを回収します。アスピレーターでビーズペレットに近づけないよう注意しながら、ライセートを吸引除去し、室温の0.75 mLを添加します。

各チューブにRipバッファーを加え、最高速度でボルテックスしてビーズを洗浄します。18,000 GSで2分間遠心分離します。室温でビーズを回収し、この洗浄・ボルテックス・遠心分離のサイクルをさらに2回繰り返し、計3回の洗浄を行います。

ビーズのペレットを乱さないように、可能な限りバッファーを吸引して除去します。次に、各チューブに20〜25 µLの2×還元ラメル bufferを添加します。還元剤がN-H-S-S-Sビオチンジスルフィド結合を切断し、単離されたタンパク質が溶液中に放出されます。

ほとんどの膜タンパク質は加熱に耐えられないため、還元および変性後、チューブをローターにかけ、室温で30分間インキュベートしてタンパク質を分離します。標準的なSDS-PAGEを用いて、タンパク質を膜に転写して免疫ブロッティングを行い、適切な抗体でブロットします。本実験では、Checon社のラット抗DAT抗体（製品番号3609）を1:2000に希釈して使用します。飽和ピクセルが出ないように注意しながら、CCDカメラ搭載のゲルドキュメンテーションシステムを用いて免疫反応性のバンドをキャプチャします。本実験では、Bio-Rad社のVersaDocイメージングシステムとQuantity Oneソフトウェアを使用して、各バンドの密度を定量化しています。

ドパミントランスポーター的可逆的標識の手順における代表的なイムノブロットをここに示します。最も強いシグナルは、Totalレーン（T）に見られるインターナリゼーション前の表面タンパク質の総量です。ストリップコントロール（S）は、理想的にはブランクに近く、高いストリップ効率を示すべきです。ストリップ効率は、以下の計算式を用いてバンド密度測定値から算出します。

本実験におけるこのストリップの効率は99.8%でした。効率が90%以上のストリップが最適であり、このレベルを下回る結果は破棄する必要があります。このポアストリップの例では、ストリップレーンに可視的なバンドが認められますが、ストリップ効率は34%です。ここでは、強度の低いバンドが実験プレートからのインターナリゼーションレーンとなります。細胞をビヒクル溶液または1 µMのPMAで10分間インターナリゼーション処理し、ドーパミントランスポーターのインターナリゼーション率を測定しました。

内部移行率は、バンド密度の測定を用いて次のように算出されます。このグラフに見られるように、ビークル処理条件下では、10分間で表面DATの10.4%が内部移行しました。一方、PMA処理により、DATの内部移行率は全表面DATの23.2%まで増加しました。以上で、可逆的ビオチン化法を用いて細胞膜タンパク質の内部移行率を測定する方法について解説しました。

バイオトネーション試薬およびTCPは、使用直前に調製することが重要であるという2つの点を覚えておいてください。プロトコルの途中で細胞の脱落が多く見られる場合は、プレートに細胞接着基質を使用してください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。