植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

植物材料から、特定の種​​類の細胞を単離する方法が示されている。この手法は、特定の細胞型、細胞の解離と蛍光活性化細胞選別に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマーカーラインを採用しています。さらに、成長のセットアップがの治療を容易にするここで確立されている

この手順は、植物が特定の細胞タイプでGFPを発現することに依存しており、蛍光活性化細胞ソーティングまたはファクトを使用して、他の植物細胞からGFPを単離できます。この例では、シロイヌナズナの特定の細胞タイプで発現する2本のマーカーラインを使用しています。アリアナの根の苗は、植物トレイまたは寒天プレートで育てられます。

それらの根は収穫され、細胞壁消化酵素で処理されます。1時間後、溶液をろ過して大きな破片を取り除きます。次に、溶液を遠心分離し、上清を除去します。

GFP陽性プロトプラストは、その後、ファックスで分離されます。選別された材料は、ゲノムワイドな転写プロファイルなどの細胞種特異的な解析に使用することができます。こんにちは、ニューヨーク大学生物学部ケン・バーンバウム研究室のバシアン・バーマンです。

本日は、植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別手順をご紹介します。この例では、シロイヌナズナルートで2つの特定の細胞タイプをソートします。私たちの研究室では、この手順を使用して、細胞タイプ固有の転写プロファイルを研究しています。

それでは始めましょう。この手順を開始するには、野生型の苗木と、細胞型特異的にGFPが発現する苗木を育てます。GFPを駆動するかかしプロモーターは、1つの苗のグループの根の内皮と静止中心をマークします。

また、別のグループでは、根の静止中心は、GFPを駆動するウォークファイブプロモーターによってマークされています。苗木は水耕栽培で育てられ、ナイロンフィルターの上にFIAトレイが置かれ、根が成長培地に成長します。あるいは、ナイロンメッシュの上に植物を育て、1%寒天プレートを垂直に配置することもできます。

根の収穫を助けるだけでなく、フィルターは苗木を新しい植物トレイまたは寒天プレートに大量に移し、そこで関心のある触媒を補充することができます。これは、栄養素、ホルモン、またはストレス治療に対する細胞型特異的な転写応答を研究するために行われる場合があります。蛍光顕微鏡で観察し、蛍光マーカーが期待どおりに発現していることを確認します。

マーカーの発現パターンは、治療の結果として変化する可能性があるため、適用した治療条件下で一貫していることを確認してください。収穫に進み、プロトプラストを準備します。まず、プロトプラスト溶液を調製します。

1.25%重量/体積セルラーゼ0.3%重量/体積、メーザーザザイム0.4モルDマンニトール20ミリモル、MES、および20ミリモルKCLを脱塩水に組み合わせ、pH7.5の1モルトリスHCLでpHを5.7に調整します。この溶液はわずかに濁ります。次に、溶液を摂氏55度に10分間加熱します。

溶液は透明になり、室温まで冷ましてから、体積あたり0.1%の重量BSA 10ミリモル塩化カルシウムと、1週間前の苗木を1つの植物トレイから収穫する5ミリモルベータミーキャプトエタノールを加えます。かかしの場合、GFPラインまたは4日齢の8枚のプレートは5G FPの苗を歩きます。メスでナイロンメッシュから根をこすり落とし、プロトプラスト溶液の入った容器に入れます。

1500本の苗木あたり約10ミリリットルのプロトプラスト溶液を使用してください。フラスコを75 RPMで室温で1時間静かに振ってください。インキュベーション時間が長くなると、プロトプラストの収量が増加する可能性がありますが、遺伝子発現に対するプロトプラスト自体の影響も増大します。

プロトプラストが放出されたら、40マイクロメートルのセルストレーナーを使用して溶液をろ過し、プロトプラスト懸濁液を円錐形の15ミルチューブに分割します。事実の詰まりを防ぎ、細胞の選別に必要な時間を最小限に抑えるために、破片が多すぎず、きれいなプロトプラスト懸濁液を生成することが重要です。スイングバケット遠心分離機でチューブを500 Gで室温で10分間遠心分離します。

遠心分離速度は、プロトプラストを生成する植物切片の構成と、酵素処理中に生成される細胞破片の量に依存することに注意してください。遠心分離後、上清の大部分を取り除き、プロトプラストを含むペレットを少量の残りのプロトプラスト溶液に穏やかに再懸濁します。最後に、ヘモサイトメーターを使用してプロトプラストをカウントし、その密度を決定して収量を計算し、ファクトランパラメータを決定します。

カウント後、プロトプラストを検査します。それらの完全性、GFP発現レベル、および汚染された細胞破片の含有量を確認してください。次に、FAXに進みます。

そうでない場合は、直接ファックスに進みます。プロトプラストは、酵素を添加せずにプロトプレーティング溶液やW 5溶液などのインキュベーション溶液で洗浄、再懸濁、保存することができます。セルソーターとワークステーションコンピュータの電源を入れます。

ここでは、ベクトン・ディクソン・アンド・カンパニー製のフリアを使用しています。1つのXPBSをシース液として使用し、流体の起動手順を実行します。100マイクロメートルのノズルを取り付け、20PSIのシース圧力を設定します。

安定したフローストリームを設定し、ドロップ遅延を校正します。この手順では、キャリブレーションは示されていないことに注意してください。1milあたり1,000万細胞という高い密度のProtoplasts懸濁液をうまく選別できます。

プロトプラストの沈降を防ぐために、事実に基づいてサンプル攪拌オプションを使用してください。事実の詰まりが問題になる場合、3つの可能な撮影ステップがあります。まず、サンプルラインのバックフラッシュを実行します。

次に、プロトプラスト懸濁液を希釈して密度を下げます。第三に、遠心分離と懸濁液の濾過ステップを繰り返すことにより、プロトプラスト溶液をクリーンアップします。488ナノメートルのレーザー前方散乱光が粒子サイズの指標であり、粒子粒度の指標として、側面散乱光による励起後のGFP陽性プロトプラストとGFPマイナスプロトプラストおよび細胞破片を区別するために、わずか4つのパラメータが使用されます。

緑色蛍光の尺度として530ナノメートルでの発光、赤色スペクトル自家蛍光の尺度として610ナノメートルでの発光。まず、前方散乱と側面散乱のドットプロットを設定します。測定されたイベントがプロットの中央に配置されるように電圧設定を適用します。

GFP陽性のPROTOPLASTは、自家蛍光を伴うイベントと比較して、緑色と赤色の発光の比率が増加していることで区別できます。ドットプロットは、緑の蛍光と赤のスペクトルの自家蛍光のみを設定します。測定されたイベントがプロットに 1 つの対角母集団を生じさせるような方法で電圧設定を適用します。

野生型プロトプラスト懸濁液を見ると、GFP陽性のプロトプラストは、野生型サンプルでは見られない緑色の蛍光イベントの明確な集団を生成するはずです。補正制約を設定して、緑の蛍光と赤のスペクトル自家蛍光の間のスペクトルのオーバーラップを調整します。A GFP陽性プロトプラスト懸濁液を使用すると、適切な補償制約設定により、GFP陽性プロトプラストと非GFPプロトプラストおよび破片の分離が可能になり、GFP陽性イベントを識別するためのゲートが設定されます。

ゲート境界を定義するために、選別実験を準備するたびに非GFPプロトプラストを持参することをお勧めします。最後に、前方散乱しきい値のカットオフを設定して、小さな破片を解析から除外します。前方散布図と側面散布図でGFP陽性のイベントを視覚化すると、しきい値をどこに設定すべきかを決定するのに役立ちます。

この最初のファクト実行で設定したパラメータは、将来のソートで再利用できます。事実の日常的な使用には、わずかな調整が必要になります。RNA抽出には、RNA抽出バッファーを含むコレクションチューブを調製し、最大で100マイクロリットルのソーティング量から350マイクロリットルの抽出バッファーを目安にしてください。

20, 000 のソートイベントにより、合計ソート量は約 100 マイクロリットルになります。ファックスパラメータと動作モードが設定され、収集チューブの準備ができたので、ソートが完了したらプロトプラストのソートを開始します。細胞懸濁液が上部に溜まる可能性があるため、サンプル収集チューブを混合すると、RNA抽出およびCD NA増幅後のマイクロアレイ分析に使用できるのはわずか500

ここでは、RNEZマイクロ抽出キット、WT ovation PICO RNA増幅システム、fl ovation CD NAビオチンモジュールV twoを使用します。ここでは、非GFPかかし、GFPおよびW 5G FP実生から得られたプロトプラストの典型的なファックス結果であり、x軸上の緑色蛍光と赤色蛍光の各ドットプロットに100,000のイベントが示されています。Y 軸では、GFP ソーティング ゲート内にあるイベントが緑色で強調表示されます。

これは、根の内皮と静止中心を示すかかしGFPを発現するか、根の静止中心を示す歩行5G FPのいずれかを発現する実生からの典型的なプロトプラスト収量の要約です。根の静止中心には、根の内皮に比べて細胞の数が少ないです。したがって、より多くのプロトプラストから開始したにもかかわらず、GFP発現細胞の収量は、ここに示されているかかしGFPソートと比較して、ウォーク5G FPソートの方が小さく、トリプリケートサンプルの典型的なRNA抽出結果です。

各サンプルは、10, 000イベントから抽出されたRNAに対応しています。抽出されたRNAはバイオアナライザーで分析され、上にかかしGFPサンプルのリボソームピークが表示され、抽出されたRNAの下のウォーク5G FPサンプルはさらにマイクロアレイ分析に使用できます。このログ2の発現水準の散布図は、2つの反復間の類似性を示しています。

ここでは、細胞タイプ特異的な分析のために、植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別を行う方法を紹介しました。この手法は、多くの異なる植物組織や種に適用できます。破片含有量が少なく、プロトプラストが健康であるため、良好な収量が得られれば、転写分析やその他の分析において、より優れたダウンストリーム結果が得られます。

また、選別されたサンプル間で比較するためには、植物材料の成長条件を同一に保つことが重要であることを覚えておいてください。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。