植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

この手法は、特定の細胞タイプでGFPを発現する植物を利用するものであり、蛍光活性化細胞分取法（FACS）を用いて、それらの細胞を他の植物細胞から分離することができます。この例では、シロイヌナズナ（Arabidopsis）の特定の細胞タイプで発現する2つのマーカーラインを使用しています。Arabidopsisの根を持つ幼苗を、フィトトレイまたはアガープレートで育成します。

根を回収し、細胞壁消化酵素で処理します。1時間後、溶液をろ過して大きな破片を除去します。次に溶液を遠心分離し、上清を除去します。

その後、GFP陽性のプロトプラストをFACSで分離します。分取したサンプルは、ゲノムワイドな転写プロファイルなどの細胞型特異的な解析に使用できます。こんにちは。私はニューヨーク大学生物学部のKen Birnbaum研究室のBasian Barmanです。

本日は、植物プロトプラストの蛍光活性化細胞分取（FACS）の手順について解説します。この例では、シロイヌナズナの根における2種類の特定の細胞型を分取します。当研究室では、細胞型特異的な転写プロファイルを研究するためにこの手順を用いています。

それでは始めましょう。この手順を開始するには、野生型の苗とともに、細胞型特異的にGFPを発現する苗を育成します。一方の苗のグループでは、scarecrowプロモーターによってGFPが発現し、根の内皮と静止中心が標識されています。

別のグループでは、根の静止中心（quiescent center）を、GFPを発現させるWOX5プロモーターによって標識しています。苗は水耕栽培され、ナイロンフィルター上のFIAトレイで育成されます。これにより、根が成長培地に向かってフィルターを通り抜けて伸びることができます。あるいは、ナイロンメッシュの上で、垂直に設置した1% agarプレートを用いて植物を育成することも可能です。

フィルターは根の回収を容易にするだけでなく、苗を新しいフィトトレイやアガープレートにまとめて移植することを可能にし、そこで目的の触媒を添加することができます。これにより、栄養素、ホルモン、またはストレス処理に対する細胞型特異的な転写応答を研究することが可能です。蛍光顕微鏡で確認し、蛍光マーカーが想定通りに発現しているか検証してください。

処理によってマーカーの発現パターンが変化する場合があるため、適用した処理条件下で発現パターンが一定であることを確認してください。その後、プロトプラストの回収および調製に進みます。まず、プロトプラスト溶液の調製から開始してください。

脱イオン水を用いて、1.25%weight per volume セルラーゼ、0.3%weight per volume maser zyme、0.4 molar D mannitol、20 millimolar MES、および 20 millimolar KCL を混合し、pH 7.5 の one molar tris HCL で pH を 5.7 に調整します。この溶液はわずかに濁ります。その後、溶液を 55 degrees Celsius で 10 minutes 間加熱します。

溶液が透明になります。室温まで冷却した後、0.1% w/v BSA、10 millimolar 塩化カルシウム、および 5 millimolar β-mercaptoethanol を加えます。1つのファイトトレイから生後1週間の苗を回収します。scarecrow GFP ラインの場合は、4日経過した GFP 苗を8プレート分使用します。メスでナイロンメッシュから根を削り取り、プロトプラスト溶液が入った容器に入れます。

苗1500本につき、プロトプラスト溶液を約10 milliliters使用します。室温にて75 RPMで1時間、フラスコを穏やかに振盪します。インキュベーション時間を長くするとプロトプラストの収量が増加する可能性がありますが、遺伝子発現に対するプロトプラスト自体の影響も強まります。

プロトプラストが遊離したら、40 µmのセルストレーナーを使用して溶液をろ過し、プロトプラスト懸濁液を15 mLコニカルチューブに分注します。ファクスの詰まりを防ぎ、細胞のソーティングに要する時間を最小限にするため、デブリが少なくクリーンなプロトプラスト懸濁液を作成することが重要です。スイングバケット式遠心機を用い、室温で500 G、10分間、チューブを遠心分離します。

遠心分離の速度は、プロトプラストを抽出する植物切片の構成や、酵素処理中に生成される細胞残渣の量によって異なることに注意してください。遠心分離後、上清の大部分を除去し、プロトプラストを含むペレットを少量の残ったプロトプラスト溶液で穏やかに再懸濁させます。最後に、血球計数器を用いてプロトプラストを計数し、その密度を決定することで、収量を算出し、その後のランパラメータを決定します。

計数後、プロトプラストを検査します。完全性、GFPの発現レベル、および混入した細胞残渣の量を確認してください。次に、FACSに進みます。

すぐに FACS に移行しない場合は、プロトプラストを洗浄し、酵素を除いた proto plating solution や W5 solution などのインキュベーション溶液で再懸濁して保存することができます。セルソーターとワークステーションのコンピュータの電源を入れます。

ここでは、Becton Dixon社製のフローサイトメーターを使用します。シース液として1x PBSを使用し、流路系のスタートアップ手順を実行してください。100 µmのノズルを取り付け、シース圧を20 PSIに設定します。

安定したフローストリームを確立し、ドロップディレイを校正します。なお、本手順では校正工程は示していません。1 mlあたり1,000万個という高密度のプロトプラスト懸濁液でも、正常にソーティングすることが可能です。

プロトプラストの沈降を防ぐため、FACTSのサンプル攪拌オプションを使用してください。FACTSの目詰まりが発生した場合は、3つのトラブルシューティング手順があります。まず、サンプルラインのバックフラッシュを行ってください。

次に、プロトプラスト懸濁液を希釈して密度を下げます。第三に、遠心分離および再懸濁の後、ろ過工程を繰り返してプロトプラスト溶液を精製します。488 nmのレーザーによる励起後、GFP陽性プロトプラストをGFP陰性プロトプラストおよび細胞残骸から区別するために、4つのパラメータが使用されます。前方散乱光（forward scatter）は粒子サイズの指標となり、側方散乱光（side scatter）は粒子の顆粒性の指標となります。

緑色蛍光の指標として530 nanometersでの蛍光強度を、赤色スペクトルの自家蛍光の指標として610 nanometersでの蛍光強度を測定します。まず、前方散乱光（forward scatter）対側方散乱光（side scatter）のドットプロットを作成します。測定されたイベントがプロットの中央に位置するように電圧設定を調整してください。

GFP陽性のプロトプラストは、自家蛍光を示すイベントと比較して、赤色放出に対する緑色放出の比率が高くなることで区別できます。緑色蛍光と赤色スペクトルの自家蛍光を軸としたドットプロットのみを作成してください。測定されたイベントがプロット上で単一の対角線上の集団となるように、電圧設定を適用してください。

野生型プロトプラスト懸濁液を観察する場合、GFP陽性プロトプラストは、野生型サンプルでは決して見られない明確な緑色蛍光イベントの集団として現れるはずです。緑色蛍光と赤色スペクトルの自家蛍光との間のスペクトルオーバーラップを調整するために、コンペンセーション（補正）制約を設定してください。GFP陽性プロトプラスト懸濁液を使用し、適切にコンペンセーション制約を設定することで、GFP陽性プロトプラストを非GFPプロトプラストやデブリからより良好に分離することが可能になります。GFP陽性イベントを特定するためのゲートを設定してください。

ゲート境界を定義しやすくするため、ソート実験を準備する際は毎回、GFP陰性のプロトプラストを一緒に用意することをお勧めします。最後に、小さなデブリを解析から除外するために、前方散乱光（forward scatter）のしきい値（threshold cutoff）を設定します。前方散乱光対側方散乱光（side scatter）のプロットにおいて、GFP陽性イベントを可視化することで、しきい値をどこに設定すべきかを判断できます。

この初期のfactsランで設定したパラメータは、今後のソートでも再利用可能です。日々のfactsの使用には、わずかな調整が必要になります。RNA抽出用に、RNA抽出バッファーを入れた回収チューブを用意してください。目安として、ソート量最大100 µLに対して350 µLの抽出バッファーを使用してください。

20,000回のソーティングイベントにより、合計で約100 µLの回収量が得られます。FACSのパラメータと動作モードが設定され、回収チューブの準備が整ったので、プロトプラストのソーティングを開始し、完了まで行います。細胞懸濁液が上部に溜まる可能性があるため、サンプル回収チューブを混合してください。RNA抽出およびcDNA増幅後のマイクロアレイ解析には、わずか500回のソーティングイベント分で十分に使用可能です。

ここでは、RNEZ micro extraction kit、WT ovation PICO RNA amplification system、およびfl ovation CD NA biotin module V twoを使用します。以下は、non GFP Scarecrow、GFP、およびW 5G FPの苗から誘導したプロトプラストの典型的なFACS結果です。各ドットプロットには100,000個のイベントが表示されており、x軸に緑色蛍光、y軸に赤色蛍光を示しています。y軸において、GFPソーティングゲート内に含まれるイベントは緑色でハイライトされています。

これは、根の内皮および静止中心を標識するscarecrow GFP、または根の静止中心を標識するwalks 5G FPのいずれを発現する苗から得られた、典型的なプロトプラスト回収量のまとめである。根の静止中心には、根の内皮に比べて細胞数が少ない。したがって、開始時のプロトプラスト数は多いものの、GFP発現細胞の回収量は、scarecrow GFPのソートと比較してwalks 5G FPのソートの方が少なくなっている。ここに示しているのは、3連（triplicate）サンプルにおける典型的なRNA抽出結果である。

各サンプルは、10,000件のイベントから抽出されたRNAに対応しています。抽出されたRNAをバイオアナライザーで解析した結果、上部にscarecrow GFPサンプルのリボソームピークが、下部にwalks 5G FPサンプルのピークが示されています。抽出されたRNAは、さらにマイクロアレイ解析に使用できます。このlog2発現レベルの散布図は、2つのレプリケート間の類似性を示しています。

以上で、細胞型特異的な解析に向けた植物プロトプラストの蛍光活性化細胞分取（FACS）の手順を説明しました。この手法は、多くの異なる植物組織および種に適用可能です。デブリの含有量が少なく、健全なプロトプラストを高収率で回収することで、転写解析およびその他の解析においてより優れたダウンストリームの結果を得ることができます。

また、分取したサンプル間での比較を行うためには、植物材料の成長条件を同一に保つことが重要であることも忘れないでください。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしています。