光学顕微鏡で学ぶシナプス前サイレントシナプス
January 4th, 2010
グルタミン酸作動性シナプスはサイレントモードにアクティブモードを切り替えることができます。我々は齧歯類の神経細胞の分散培養でそのシナプス前の活動状況を示すと、アクティブなシナプスを可視化するためにFM1 - 43色素の修正可能なフォームを使用し、すべてのグルタミン酸シナプスを可視化するvGluT - 1抗体による免疫染色可視化される。
中枢神経系の一部のシナプス前終末は、機能していないか、静かであるように見えます。ここでは、サイレントシナプス前終末を同定するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、端末のサイレンシングまたは覚醒が疑われる治療および操作の特定に適用できる。
このプロトコルは、ニューロンの脱分極中のシナプス小胞の重要な色素標識と、その後の固定細胞の標識を、サイレントとアクティブの両方のすべてのシナプス前末端を標識する抗体と組み合わせます。シナプス。色素と抗体で標識されたCoは活性です。抗体のみで標識されたシナプシスは沈黙しています。
こんにちは、ワシントン大学医学部精神科のスティーブ・ミニク博士の研究室のアマンダ・テイラーです。私もManic LabのShahinです。本日は、培養した海馬ニューロンを用いて無音のシナプス前終末を可視化する手順をご紹介します。
私たちの研究室では、この手順を使用して、電気的活動と他の単一ノーリング経路が神経伝達物質の放出をどのように調節するかを研究しています。それでは始めましょう。無菌の層流フードでは、HIPAを使用して、出生後のゼロ日目から3匹のラットまたはマウスを購入して、解離細胞培養を調製します。
私たちが公開したプロトコルによると、私たちの培養物は混合グリアです 同じ解剖細胞に由来する培養物は、滅菌された35ミリメートル皿に播種する必要があります。それぞれに、コラーゲンプレート1ミリリットルあたり5ミリグラムでコーティングされたゼロのカバースリップが含まれています。ニューロンの密度は約500細胞/センチメートルの2乗です。
12匹のラットの子犬は、通常、30個の35ミリメートルの皿を産みます。培養物を培養インキュベーターで10〜14日間成長させます。シナプスの発達と成熟のために、抗有糸分裂剤A Cを添加して、in vitro 4日目にグリアの成長を阻止します。
また、in vitro 5日目に、この成熟期間中のニューロンの生存を強化するために、神経基礎培地とB 27サプリメントとの半培地交換を行います。シナプス前沈黙シナプスの数を変える治療法を紹介します。グルタミン酸シナプスの大部分を沈黙させる便利な方法の1つは、30ミリモルカリウムによる4時間の治療であることがわかりました。
培養物が成熟すると、ニューロンは比較的低密度で、十分に分離された広範な神経症プロセスを持つはずです。培養物をインキュベーターから取り出し、ベンチに持って行きます。培地を、45ミリモルの塩化カリウムと10マイクロモルのFM 1 43 FXダイを含む緩衝生理食塩水と交換します。
このソリューションには、シグナル伝達の再発を防ぐために、NBQXとA PVも含まれている必要があります。FM 1 43 FXストック溶液と実験は、光退色を防ぐために暗所に保管することが重要です。したがって、その後のすべてのインキュベーションステップのために、培養皿をホイルで覆います。
室温で正確に2分間インキュベートします。染料溶液を取り出し、500マイクロモルの逆効果で緩衝生理食塩水を山積みにして3〜5秒間だけ洗浄します。7。このステップで非特異的な色素のタイミングを除去することが重要です。
adv Adverse F 7に長時間さらされると、すべてのFM 43 FXラベルが削除されます。次に、細胞を洗浄し、緩衝された生理食塩水を山積みにします。化学ヒュームフードで5つの2分間隔で7つ。
培養物を4%パラアルデヒドと0.2%グルタルアルデヒドのPBSで10分間固定します。細胞をPBSで短時間洗浄します。これで、セルをドラフトから移動させることができます。
4%正常ヤギ血清と0.04%トリットンXを含むブロッキング溶液を添加して、バックグラウンドを減らし、免疫染色のために細胞を透過します。15分間インキュベートします。ブロッキング溶液中で1〜2000に希釈したvlu T one抗体で細胞を染色します。
培養物を抗体中で3時間静かに揺さぶってインキュベートします。細胞をPBSで4回洗浄します。Alexaで細胞をインキュベートします。
ブロッキング溶液中で1〜500に希釈した6 47標識抗モルモット抗体。二次抗体中の培養物を穏やかに揺さぶりながら30分間維持します。細胞をPBSでさらに4回洗浄します。
鉗子を使用して、きれいなスライドガラスに床の量を少し落とします。カバースリップを手に取り、スライドに面した床の量セルのドロップにそっと下げます。スライドを一晩乾かします。
共焦点レーザー走査型顕微鏡で60 xオイル対物レンズを準備します。カバースリップが目標を向くようにステージにスライドを置きます。過度に密集しておらず、残留染料を保持できる体細胞から離れている神経突起のフィールドを見つけます。
51 x 51 ミクロンのフィールド サイズにズームします。画像取得ソフトウェアを使用する。深さ7.8ミクロンのZSスタックを、各ステップで0.3ミクロンの27ステップで取得します。
まずVLU T one抗体をスキャンして、フィールド内のすべてのグルタミン酸作動性シナプスを同定します。その後、FM 1 43 FX 蛍光を再スキャンして、取得後の画像を解析します。解析ソフトウェアを使用して、各ピクセル設定しきい値における任意の平面からの最大強度読み取りに基づいて、Zタックを複合単一平面画像に変換します。
バックグラウンドを減らすには、FM 1 43エフェクトの汚れを参照せずにVGグルTワン端子を特定します。そして、これらの点を関心領域としてマークします。通常、フィールドごとに 10 個の PUNTA を選択します。
FM 1 43 エフェクト画像でしきい値設定と点選択を繰り返し、画像を重ね合わせてサイレントシナプスを特定します。絶対ピクセル基準、またはパーセンテージ ピクセル基準を使用して、アクティブな FM 1 43 正のシナプスと非アクティブな FM 1 43 の負のシナプスを区別できます。私たちの培養では、V glut one染色によって定義されるグルタミン酸シナプスの70〜80%が、緑色のFM 1 43蛍光と赤色のV glut one染色の重ね合わせ画像で検出可能なFM 1 43染色を示すことがわかりました。
これは、共局在のマーカーを持つ黄色の涙点シナプスが豊富にあることからも明らかです。これらは矢印で示されます。赤色のV過剰の約20〜30%の1つの陽性の点は、ベースラインを超える緑色のFM1 43蛍光を持つことができません。
これらは不活性なシナプス前終末であり、例は矢印で示されています。シナプスの3番目の集団も観察されます。これらは緑色FM 1 43蛍光陽性ですが、赤色B過剰1染色はありません。
これらは活性GABA作動性シナプスであり、例はアスタリスクで示されています。これらはほとんどの分析から除外されていますが、小胞性GABAトランスポーター抗体を使用して明示的に研究することができます。VLU T one抗体の代わりに、FM 1 43およびVLU one免疫染色を使用してシナプス前サイレントシナプスを可視化する方法を示しました。
この手順を実行するときは、FM 1 43 FXがアドバーサブセブン洗浄の時間とブロッキング溶液に含まれる治療X 100の濃度の両方に敏感であることを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この研究は、中枢神経系におけるサイレントなシナプス前末端を特定するためのプロトコルを提示します。重要な染料のラベリングと免疫染色を組み合わせることで、研究者は活性とサイレントのシナプスを区別することができます。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- シナプス機能
背景
- 一部のシナプス前末端は機能していない、またはサイレントです。
- シナプス活動の理解は神経科学研究にとって重要です。
- サイレントの末端を特定することは、様々な治療法の研究に役立ちます。
- シナプス活動の可視化は神経伝達への洞察を提供します。
研究の目的
- サイレントなシナプス前末端を特定するための信頼できる方法を開発すること。
- 治療法がシナプス活動に与える影響を探ること。
- 神経ネットワークにおけるシナプスのダイナミクスの理解を深めること。
使用した方法
- 神経の脱分極時のシナプス小胞の重要な染料によるラベリング。
- すべてのシナプス前末端をラベルする抗体を用いた免疫染色。
- 活性とサイレントのシナプスを区別するための共同ラベリング技術。
- 活性シナプスの可視化にFM1-43染料を使用。
主な結果
- FM1-43染料を使用して活性シナプスを可視化できます。
- 免疫染色はサイレントなものを含むすべてのシナプス前末端を明らかにします。
- このプロトコルは活性とサイレントのシナプスを効果的に区別します。
- 結果はシナプスの可塑性と機能の理解に貢献します。
結論
- 開発されたプロトコルは神経科学研究にとって価値あるツールです。
- サイレントの末端を特定することで治療戦略に情報を提供できます。
- この方法はシナプスの挙動の理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Identifying presynaptically silent synapses enables mechanistic de-risking in target validation by revealing functional heterogeneity in neuronal networks. This method supports predictive confidence in screening assays by distinguishing active from inactive glutamate release sites. It informs portfolio triage by linking synaptic plasticity mechanisms to disease-relevant systems in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying presynaptic silencing or activation states.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct visualization of vesicle release competence.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating cAMP signaling or electrical silencing with functional outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation using co-localization of FM1-43 FX and vGluT-1 signals.
- Quantitative Output: Enables standardized measurement of active synapse percentage via threshold-based image analysis.
- Reproducibility: Supports platform reuse through standardized fixation, staining, and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects presynaptic plasticity to hippocampal-dependent learning and memory pathways.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by monitoring synaptic adaptation to treatments.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying silent synapse populations under baseline and modulated conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a functional readout of presynaptic terminal activity prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of treatments that alter presynaptic silencing via potassium depolarization or cAMP activation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantification of glutamate release competence in dissociated hippocampal cultures.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., % FM1-43+/vGluT-1+ puncta) enabling condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling synaptic adaptation relevant to neuropsychiatric disorder mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for screening modulators of presynaptic function across neuronal models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct assessment of vesicle release probability.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via fixed-cell imaging and co-staining protocol.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in synaptic drug effects.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on functional synaptic modulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture, confocal microscopy, and fluorescence image analysis.
- Needs instrumentation including laser scanning microscope with 60x oil objective and Z-stack acquisition.
- Demands cross-team standardization of staining timing, dye concentration, and wash stringency.
- Involves adaptation considerations for non-hippocampal neuronal systems or alternative vesicle transporters.
- Includes practical limitations such as FM1-43 FX sensitivity to ascorbic acid wash duration and blocking solution composition.
