光学顕微鏡で学ぶシナプス前サイレントシナプス

中枢神経系の一部のシナプス前終末は、機能していないか、あるいはサイレントであるように見えます。ここでは、サイレントなシナプス前終末を同定するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、終末をサイレントにする、あるいは覚醒させると疑われる処置や操作を同定するために適用できます。

このプロトコルでは、神経細胞の脱分極中に行うシナプス小胞の生体染色と、その後の固定細胞に対する、静止状態および活性状態の両方のpresynaptic terminalsを標識する抗体による染色の組み合わせを用います。染色剤と抗体の両方で共標識されたシナプスは活性状態であり、抗体のみで標識されたシナプスは静止状態であると判断します。

こんにちは。私はワシントン大学医学部精神科のSteve Minick博士の研究室のアマンダ・テイラーです。そして、同じくManic研究室のシャヒンです。本日は、培養海馬ニューロンを用いて、サイレント・プレシナプス端を可視化する手順をご紹介します。

当研究室では、電気活動およびその他のシグナル伝達経路が神経伝達物質の放出をどのように調節するかを研究するために、この手順を用いています。それでは始めていきましょう。滅菌済みのラミナーフローフード内で、生後0日から3日のラットまたはマウスからHIPAを用いて、解離細胞培養を調製します。

既報のプロトコルに基づき、同一の解剖組織に由来する混合グリア培養細胞を、滅菌済みの35 mmディッシュに播種します。各ディッシュには、5 mg/mLのコラーゲンでコーティングされた0番カバーガラスを配置します。ニューロンを約500 cells/cm²の密度で播種してください。

通常、ラットの幼仔12匹から30〜35mmディッシュ30枚分が得られます。培養物を培養インキュベーター内で10〜14日間成長させます。シナプスの発達および成熟を促すため、in vitro 4日目に抗有糸分裂剤であるAra-Cを添加し、グリア細胞の増殖を停止させます。

また、in vitro 5日目に、この成熟期間中のニューロンの生存率を高めるため、Neurobasal mediumにB27サプリメントを添加した培地を用いて半量培地交換を行います。次に、シナプス前抑制状態にあるサイレントシナプスの数を変化させる処理を導入します。グルタミン酸作動性シナプスの大部分をサイレント化させる簡便な方法として、30 mMのカリウムで4時間処理することが有効であると考えられます。

培養が成熟すると、ニューロンは比較的低密度になり、神経突起が十分に分離し、広範囲に伸展しているはずです。インキュベーターから培養物を出し、ベンチに移動させます。培地を、45 millimolar 塩化カリウムと 10 micromolar FM 1 43 FX dye を含む緩衝生理食塩水に交換します。

この溶液には、回帰的なシグナリングを防ぐためにNBQXとAPVも含める必要があります。光退色を防ぐため、FM 1 43 FXのストック溶液および実験は暗所で保持することが重要です。したがって、以降のすべてのインキュベーションステップでは、培養皿をアルミホイルで覆ってください。

室温で正確に2分間インキュベートします。染料溶液を除去し、非特異的な染料の結合を除去するため、500 µM の adversive.Seven を含むリン酸緩衝生理食塩水で3〜5秒間のみ洗浄します。このステップにおけるタイミングは極めて重要です。

adverse F sevenに長時間さらすと、すべてのFM 43 FXラベルが除去されます。その後、化学薬品用ドラフトチャンバー内で、adverseなしのheaps buffered salineを用いて、2分間を1回とする間隔で5回、細胞を洗浄します。

4%パラアルデヒドおよび0.2%グルタルアルデヒドを含むPBSで、培養物を10分間固定します。PBSで細胞を短時間洗浄します。これで、細胞をドラフト外に移動させることができます。

バックグラウンドを低減させ、免疫染色用に細胞を透過させるため、4%normal goat serumと0.04%tritton Xを含むブロッキング溶液を加えます。15分間インキュベートします。ブロッキング溶液で1:2000に希釈したvlu T one抗体で細胞を染色します。

緩やかなロッキングを行いながら、抗体とともに培養物を3時間インキュベートします。PBSで細胞を4回洗浄します。細胞をAlexaとともにインキュベートします。

1:500にブロッキング溶液で希釈した6 47標識抗モルモット抗体を加えます。緩やかに揺らしながら、二次抗体中で30分間培養します。その後、PBSで細胞をさらに4回洗浄します。

ピンセットを使用して、清潔なガラススライド上に少量のフロアアウントを滴下します。カバーガラスを手に取り、フロアアウントの滴の上に、細胞がスライド側を向くようにそっと被せます。スライドを一晩乾燥させます。

共焦点レーザー走査顕微鏡に60xオイル浸漬対物レンズを準備します。カバーガラスが対物レンズに向くようにスライドをステージに設置します。残留染料が残りやすい細胞体から離れた、密度が高すぎない神経突起の視野を探します。

視野サイズを51 by 51 micronsにズームします。画像取得ソフトウェアを使用して、1ステップ0.3 microns、計27ステップで、深さ7.8 micronsをカバーするZSスタックを取得します。

まずVGLUT1抗体でスキャンし、視野内のすべてのグルタミン酸作動性シナプスを特定します。次に、画像取得後に解析を行うため、FM 1-43 FXの蛍光を再スキャンします。解析ソフトを用いて、各ピクセルにおける全プレーン中の最大強度読み取り値に基づき、Zスタックを合成単一平面画像に変換し、閾値を設定します。

背景ノイズを低減するため、FM 1-43 染色による効果とは無関係に VG glu T1 終末を特定します。そして、これらの点状構造（puncta）を関心領域（ROI）としてマークします。通常、1視野あたり10個の puncta を選択します。

FM 1 43染色の画像に対して閾値処理と puncta の選択を繰り返し、画像を重ね合わせてサイレントシナプスを特定します。活性のある FM 1 43 陽性シナプスと不活性な FM 1 43 陰性シナプスを区別するために、絶対ピクセル基準またはパーセントピクセル基準を用いることができます。我々の培養系では、V glut one 染色によって定義されるグルタミン酸作動性シナプスの 70～80% が、緑色の FM 1 43 蛍光と赤色の V glut one 染色の重ね合わせ画像において、検出可能な FM 1 43 染色を示すことが分かりました。

これは、共局在マーカーを持つ黄色の点状のシナプスが豊富に存在することから明らかです。これらは矢印で示されています。赤色のV glut one陽性の点状構造の約20〜30%は、ベースラインを超える緑色のFM 1 43蛍光を示しません。

これらは不活性なシナプス前終末であり、矢頭で例が示されています。また、第3のシナプス集団も観察されます。これらは緑色のFM 1-43蛍光陽性ですが、赤色のB-glut1染色は認められません。

これらは活性化しているGABA作動性シナプスであり、アスタリスクで例を示しています。これらはほとんどの解析から除外されますが、小胞GABA輸送体抗体を用いることで明示的に研究することが可能です。VLU T one抗体の代わりに、FM 1 43およびVLU one免疫染色を用いて、シナプス前終末でサイレントなシナプスを可視化する方法を説明しました。

本手順を実施する際は、FM 1 43 FXがadver sub seven洗浄の時間およびブロッキング溶液に含まれる処理用X 100の濃度の両方に敏感であることを留意しておくことが重要です。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。