光学顕微鏡で学ぶシナプス前サイレントシナプス

中枢神経系の一部のシナプス前末端は、機能していないか、あるいはサイレント（不活性）であるように見えます。ここでは、サイレントなシナプス前末端を特定するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、末端をサイレント化させる、あるいは覚醒させると考えられる治療法や操作の特定に適用することが可能です。

このプロトコルでは、ニューロンの脱分極時にシナプス小胞をバイタルダイで標識し、続いて固定細胞をすべての前シナプス終末（サイレントおよびアクティブの両方）を標識する抗体で標識します。ダイと抗体の両方で共標識されたシナプスはアクティブであり、抗体のみで標識されたシナプスはサイレントです。

こんにちは。私はワシントン大学医学部精神科のSteve Minick博士の研究室のアマンダ・テイラーです。私はシャヒンで、同じくManic Labのメンバーです。今日は、培養海馬ニューロンを用いてサイレント前シナプス端を可視化する手順をご紹介します。

当研究室では、電気的活動やその他の単一細胞経路が神経伝達物質の放出をどのように調節するかを研究するために、この手順を用いています。それでは始めましょう。無菌的なラミナーフローフード内で、生後0日から3日のラットまたはマウスからHIPAを用いて細胞を回収し、解離細胞培養を調製します。

既報のプロトコルに従い、同一の解離細胞から得られた混合グリア培養細胞を、滅菌済みの35 mmディッシュに播種します。各ディッシュには、5 mg/mLのコラーゲンでコーティングした0番カバーガラスを配置します。ニューロンを約500 cells/cm²の密度で播種してください。

通常、12匹のラット新生子から30mmディッシュ35枚分を回収できます。培養物は培養インキュベーター内で10～14日間成長させます。シナプスの発達および成熟を促すため、in vitro 4日目に抗有糸分裂剤であるCを添加し、グリア細胞の増殖を停止させます。

また、in vitro 5日目に、この成熟期間中のニューロンの生存率を高めるため、Neurobasal MediumにB27サプリメントを添加した培地を用いて、培地を半分量交換します。次に、プレシナプス側のサイレントシナプスの数を変化させる処理を導入します。グルタミン酸作動性シナプスの大部分をサイレント化させる便利な方法の一つとして、30 mMのカリウムによる4時間の処理が有効であることがわかっています。

培養が成熟すると、ニューロンは比較的低密度になり、神経突起が十分に分離し、広範囲に伸びているはずです。培養物をインキュベーターから取り出し、作業台に移動させます。培養液を、45 millimolar 塩化カリウムと 10 micromolar FM 1 43 FX ダイを含む緩衝生理食塩水に交換します。

また、この溶液には再発的なシグナリングを防ぐためにNBQXおよびAPVを含める必要があります。フォトブリーチングを防ぐため、FM 1-43 FXのストック溶液および実験は暗所に保存することが重要です。したがって、以降のすべてのインキュベーションステップにおいて、培養皿をアルミホイルで覆ってください。

室温で正確に2分間インキュベートします。染料溶液を除去し、非特異的な染色の除去のため、500 µM の adversive.Seven を含むリン酸緩衝生理食塩水で3〜5秒間だけ洗浄します。このステップでは、洗浄時間が極めて重要です。

F7に長時間さらすと、FM 4-64のラベルがすべて除去されます。その後、化学フームフード内で、F7を含まないリン酸緩衝生理食塩水を用いて、2分間を1サイクルとして5回細胞を洗浄します。

4%パラホルムアルデヒドおよび0.2%グルタルアルデヒドを含むPBSで10分間、培養物を固定します。PBSで細胞を短時間洗浄します。これで、細胞をドラフト外に移動させることができます。

バックグラウンドを低減し、免疫染色のための細胞透過性を高めるため、4% normal goat serumおよび0.04% tritton Xを含むブロッキング溶液を加えます。15分間インキュベートします。ブロッキング溶液で1:2000に希釈したvlu T one抗体を用いて細胞を染色します。

抗体と共に、緩やかな振盪を加えながら3時間培養します。細胞をPBSで4回洗浄します。細胞をAlexaと共にインキュベートします。

blocking solutionで1:500に希釈した6 47標識抗モルモット抗体を加えます。二次抗体を含む培養物を、緩やかに揺らしながら30分間保持します。その後、PBSで細胞をさらに4回洗浄します。

ピンセットを使用して、清潔なガラススライドに少量のフローア量（floor amount）を滴下します。カバーグラスを取り上げ、スライド上のフローア量の液滴に、細胞がスライド側を向くようにそっと載せます。スライドをそのまま一晩乾燥させてください。

共焦点レーザー走査顕微鏡で60倍の油浸対物レンズを準備します。カバーガラスが対物レンズに向くように、スライドをステージ上に配置します。残留色素が保持されやすい細胞体から離れた、密度が高すぎない神経突起の視野を探します。

視野サイズを51 by 51 micronsにズームします。画像取得ソフトウェアを使用して、1ステップあたり0.3 micronsの27ステップで、深さ7.8 micronsをカバーするZSスタックを取得します。

まず、視野内のすべてのグルタミン酸作動性シナプスを特定するために、VLU T one抗体でスキャンします。次に、取得後の画像を解析するため、FM 1 43 FX蛍光で再スキャンします。解析ソフトウェアを使用して、各ピクセルにおける全プレーンの最大強度読み取り値に基づき、Zスタックを合成単一平面画像に変換し、しきい値を設定します。

バックグラウンドを低減させるため、FM 1-43エフェクツ染色の結果を参照せずに、VG glu T 1末端を特定します。そして、これらの点状構造（puncta）に関心領域としてマークします。通常、1視野あたり10個のpunctaを選択します。

FM 1-43のエフェクト画像に対して閾値処理とパンクタ選択を繰り返し、画像を重ね合わせることでサイレントシナプスを同定します。活性なFM 1-43陽性シナプスと不活性なFM 1-43陰性シナプスを区別するために、絶対ピクセル基準またはパーセントピクセル基準を使用できます。我々の培養系では、緑色のFM 1-43蛍光と赤色のVglut1染色の重ね合わせ画像において、Vglut1染色で定義されるグルタミン酸作動性シナプスの70から80%で検出可能なFM 1-43染色が見られることがわかりました。

これは、共局在マーカーを持つ多数の黄色い点状のシナプスとして認められます。これらは矢印で示されています。赤色のV glut one陽性の点状構造の約20～30%は、ベースラインを上回る緑色のFM 1 43蛍光を示しません。

これらは不活性なシナプス前終末であり、矢印で例が示されています。また、3番目のシナプス集団も観察されます。これらは緑色のFM 1-43蛍光陽性ですが、赤色のBglut1染色は認められません。

これらは活性GABA作動性シナプスであり、アスタリスクで例が示されています。これらはほとんどの解析から除外されますが、小胞性GABAトランスポーター抗体を用いることで明示的に研究することが可能です。VLU T one抗体の代わりに、FM 1 43とVLU one免疫染色を用いてシナプス前終末でサイレントなシナプスを可視化する方法を示しました。

この手順を行う際は、FM 1 43 FXがadver sub seven洗浄の時間およびブロッキング溶液に含まれるX 100処理剤の濃度の両方に敏感であることを覚えておくことが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。