Name: 光学顕微鏡で学ぶシナプス前サイレントシナプス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学ぶ光学顕微鏡を用いたシナプス前サイレントシナプスの同定法。FM1-43蛍光染料とVGLUT1免疫染色を組み合わせて、アクティブとサイレントシナプスを区別する神経科学研究の手法です。

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この作品は、ワシントン大学にNIHの助成金DA018109とMH78823、およびNIH神経科学ブループリントコアグラントP30NS057105によってサポートされていました。

文化の準備<ol><li> 0から3の動物1生後からラットまたはマウスの海馬細胞の解離細胞の培養します。私たちの神経細胞はに番号0の厚さのカバーガラスに広がるコラーゲン層への付着を回す基本的なアストロサイト単分子層、に従っている。平方センチメートル当たり約500個の細胞の密度で神経細胞プレート。 </li><li>文化がシナプス発達と成熟を可能にするために10-14日のために成長することができます。さらにグリア成長を阻止するために抗有糸分裂AraCので試験管4日で文化を扱う。ニューロンの生存を高めるためにNeurobasal培地+ B27サプリメント半培地交換をin vitroで5日間でそれらを養う。 </li><li>培養期間中に、機能的に沈黙シナプスの数を変更するように設計された治療法を紹介。我々は、グルタミン酸シナプスの割合が大きい（〜80％）を黙らせるつの便利な方法は、30mMのカリウムと4時間の治療であることがわかります。弱い脱分極刺激によるインキュベーション時間が長いほど同じようなサイレン2を誘導する。 50μMフォルスコリン、アデニリルシクラーゼの活性化、4時間の刺激は、ベースライン3でサイレント端末の人口を目覚めさせるために使用することができます。 </li></ol>サイレントシナプスの可視化<ol><li>細胞は蛍光顕微鏡を用いて離散シナプス端末の可視化を容易にするためにin vitroで10-14に一日でうまく区切り神経突起のプロセスで、比較的低密度を持つ必要があります。 </li><li>蒸留水で5mMのFM1 -​​ 43FXのストック溶液を準備します。株価は4℃暗所で維持されるべきである℃のFM1 -​​ 43FXを使用してすべての実験はまた、暗所で行う必要があります。 </li><li> 100mM塩化ナトリウム、2mMの塩化カルシウム、1mMの塩化マグネシウム、10mMのグルコース、および10μMFM1 -​​ 43FXを含むHEPES緩衝生理食塩水で45 mMの塩化カリウムで2分間の文化に挑戦。このソリューションはまた、シナプス後受容体を遮断し、再発性のシグナル伝達を防ぐために、1μMNBQXと25μMのD - APVが含まれている必要があります。この課題は、エキソサイトーシスとエンドサイトーシスが可能なシナプス端子にラベルを付けます。チャレンジタイムと強度は、リサイクルのプールの4のすべての利用可能な小胞のエキソサイトーシスの少なくとも1ラウンドを引き起こすように設計されています。しかし、課題は、端末の追加のサイレンシングを引き起こすのに十分ではありません。 </li><li>同じ塩化カリウムなく、生理食塩水HEPES緩衝が、500μMAdvasep - 7との非特異的色素5を削除するために使用して、わずか3〜5秒のために文化を洗ってください。このステップのタイミングは、すべてのFM1 -​​ 43FXのラベルが失われますAdvasep - 7の長時間のアプリケーションとして重要であることに注意してください。 5つの2分間隔でAdvasep - 7なしで生理食塩水緩衝さHEPES内の次の洗浄。 </li><li> 10分間、4％パラホルムアルデヒドおよびPBS、pH7.4中0.2％グルタルアルデヒドで細胞を固定してください。一度簡単にPBSで細胞を洗浄し、次いでPBSで4％正常ヤギ血清、0.04％トリトンX - 100を含むブロッキング溶液で15分間反応させます。 FM1 -​​ 43FXもトリトンX - 100はここと後のステップで使用される量に非常に敏感であることに注意してください。一般的に言えば、FM1 -​​ 43FXのラベルは任意のトリトンX - 100がない場合に最適ですが、一部の洗剤には、その後の免疫染色のために、細胞を透過性が必要である。我々は0.04％のTriton X - 100は、シナプス前サイレントシナプスの検査のために最適化されている経験的に決定している。 </li><li> 1:2500の濃度でブロッキング溶液に一次vGluT - 1抗体を希釈します。室温で3時間vGluT - 1抗体希釈で穏やかに振盪/回転で細胞をインキュベートします。 FM1 -​​ 43FXの染料の漂白を防ぐために箔を使用して、培養皿を覆うようにしてください。 </li><li> PBSで2回細胞を洗浄してから、2つの汚れを区別するためにFM1 -​​ 43FXとは異なるスペクトル特性を持つ蛍光体に結合した抗モルモット抗体で細胞をインキュベートする。私たちの実験では、我々は、ブロッキング溶液で1:500でアレクサ555 -標識抗モルモット抗体を使用します。室温で30分間振とうしながら二次抗体で細胞をインキュベートする。 </li><li>細胞をPBSで4回洗浄しFluoromount - Gの小さなドロップを使用してスライドガラス上にカバースリップをマウントします。細胞はスライドが手前になるように向きをカバースリップにしてください。スライドが一晩乾燥することができます。 </li><li>我々は現在、アクティブと非アクティブなシナプスの画像を取得する準備が整いました。共焦点レーザー走査型顕微鏡1.4開口数で60 ×油の目標を準備します。カバースリップ側が客観的に直面していることを確認し、ステージ上でスライドを置きます。スライドを中心にした後、過度に密ではない神経突起のフィールドを探します。また、残留FM1 -​​ 43FXの染料として、細胞体の近くに撮影を避けるために推奨されていても十分に洗浄した後、そこに残ることができる。我々の実験の画像の場合、我々は一般的に51 51ミクロンのフィールドの大きさに拡大します。 </li><li>取得する27 0.3ミクロンの手順で7.8ミクロンの深さをカバーする特定のフィールドのZスタック。この範囲は、我々の文化の中で神経突起の厚さをカバーするのに十分です。 Z -スタック内の各ステップでは、顕微鏡の視野内のすべてのグルタミン酸作動性シナプスを識別するためvGluT - 1抗体の免疫蛍光励起レーザ光を最初のスキャン。同じフィールドは、FM1 -​​ 43FXの蛍光のための各段階で再スキャンされます。信号の飽和を回避しながら、与えられた実験のためのすべてをカバーグラスの間で一貫して中立密度のフィルタリングと光電子増倍ゲインを設定します。我々は通常、各実験の条件ごと≥5のフィールドを取得する。 </li><li>解析ソフトウェアを使用して、コンポジットシングルプレーンのイメージにZ -スタックを変換する。我々はこの変換に使用するプロセスは、各ピクセルでのあらゆる面からの最大の強度に基づいて画像を生成します。合成画像を閾値処理され、vGluT - 1の端子は、FM1 -​​ 43FX染色を参照することなく、分析のために識別されます。涙点と呼ばれるステンドグラスエリアは、、関心領域としてマークされます。我々は通常、フィールドごとに10涙点を選択します。次にFM1 -​​ 43FXのチャネルが閾値処理され、関心領域が重畳されています。解析ソフトウェアは、各シグナルの蛍光強度だけでなく、それぞれの涙の面積を定量化するために使用されます。絶対ピクセル基準または割合のピクセル基準は、非アクティブなシナプスからアクティブ区別するために使用することができます。 </li></ol>代表的な結果<ol><li>私たちの文化では、我々はvGluT - 1染色で定義されているグルタミン酸シナプスの70-80％は、検出可能なFM1 - 43染色2、6-8で示すことがわかります。共局在マーカーとのシナプス：緑FM1 -​​ 43蛍光と赤色vGluT - 1染色のオーバーレイ画像ではこれは黄色い涙点の豊富として反映されます。これらは、矢印で示されている。 </li><li> （赤）vGluT - 1陽性涙点の約20-30％がベースラインより上（緑）FM1 -​​ 43蛍光を持つように失敗します。これらは、非アクティブなシナプス前終末であり、例は、矢印で示されます。 </li><li>シナプスの第三の人口も観察されます。これらは、（赤）vGluT - 1染色のFM1 -​​ 43蛍光が欠けている（緑）のための肯定的です。これらは、アクティブなGABA作動性シナプスであり、例は、アスタリスクで示されます。これらは、我々の分析のほとんどから除外されますが、明示的vGluT - 1抗体の代わりに小胞性GABAトランスポーター抗体を用いて研究することができます。 </li></ol>

<ol><li>Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+synaptic+properties+of+hippocampal+neurons+grown+in+microcultures+and+in+mass+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures.</a> J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).</li>
<li>Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+activity+depresses+synaptic+function+through+an+effect+on+vesicle+priming%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiological activity depresses synaptic function through an effect on vesicle priming.</a> J. Neurosci. 26, 6618-6626 (2006).</li>
<li>Moulder, K. L., Jiang, X., Chang, C., Taylor, A. A., Benz, A. M., Conti, A. C., Muglia, L. J., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+role+for+Ca2%2B-dependent+adenylyl+cyclases+in+recovery+from+adaptive+presynaptic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing.</a> J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).</li>
<li>Sara, Y., Mozhayeva, M. G., Liu, X., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+vesicle+recycling+supports+neurotransmission+during+sustained+stimulation+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast vesicle recycling supports neurotransmission during sustained stimulation at hippocampal synapses.</a> J. Neurosci. 22, 1608-1617 (2002).</li>
<li>Kay, A. R., Alfonso, A., Alford, S., Cline, H. T., Holgado, A. M., Sakmann, B., Snitsarev, V. A., Stricker, T. P., Takahashi, M., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+lamprey%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 809-817 (1999).</li>
<li>Rosenmund, C., Sigler, A., Augustin, I., Reim, K., Brose, N., Rhee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+control+of+vesicle+priming+and+short-term+plasticity+by+Munc13+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential control of vesicle priming and short-term plasticity by Munc13 isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li>
<li>Altrock, W. D., tom Dieck, S., Sokolov, M., Meyer, A. C., Sigler, A., Brakebusch, C., Fassler, R., Richter, K., Boeckers, T. M., Potschka, H., Brandt, C., Loscher, W., Grimberg, D., Dresbach, T., Hempelmann, A., Hassan, H., Balschun, D., Frey, J. U., Brandstatter, J. H., Garner, C. C., Rosenmund, C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+inactivation+of+a+fraction+of+excitatory+synapses+in+mice+deficient+for+the+active+zone+protein+bassoon%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional inactivation of a fraction of excitatory synapses in mice deficient for the active zone protein bassoon.</a> Neuron. 37, 787-800 (2003).</li>
<li>Ting, J. T., Kelley, B. G., Lambert, T. J., Cook, D. G., Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+overexpression+depresses+excitatory+transmission+through+both+presynaptic+and+postsynaptic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 353-348 (2007).</li>
</ol>

意義<ol><li>一般的にシナプスは、測定可能な確率で送信機を解放することによって動作すると考えられている。自分や他人が仕事では、小胞、神経伝達物質のトランスポーターやその他の重要なシナプスのマーカー2、6-8のフル装備にもかかわらず、いくつかのシナプスは神経伝達物質を放出する難治性であることがはっきりする。我々は、ニューロンの基底のネットワーク活動が非アクティブなシナプスのこの人口を維持するために重要であることが以前に示されている。 </li></ol>重要なステップ<ol><li> 500μMAdvasep - 7での簡単な洗浄を含めることは、著しくFM1 -​​ 43FX染色の品質を向上させます。しかし、5秒以上この洗浄のタイミングのわずかな増加は、FM1 -​​ 43FXのラベルが失われます。 </li><li> FM1 -​​ 43FXは、トリトンX - 100プロトコルの免疫染色部分に使用される量に非常に敏感です。 FM1 -​​ 43FXラベルは任意のトリトンX - 100がない場合に最適ですが、一部の洗剤はvGluT - 1免疫染色用の細胞を...

<table><tbody><tr><td>FM1-43FX</td><td>Invitrogen</td><td>F-35355</td><td>レッドシフトしたFM4-64FXも利用可能であるが、シナプス前終末のサイレンシングのアッセイへの適応性はFM1-43FXほど高くなかった。</td></tr><tr><td>Advasep-7</td><td>CyDex</td><td>AR-0A7-001</td><td></td></tr><tr><td>vGluT-1</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5905</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647接合anti-GP</td><td>Invitrogen</td><td>A-21450</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr></tbody></table>

光学顕微鏡で学ぶシナプス前サイレントシナプス

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

シナプス可塑性の基礎となる学び、覚え、また神経毒性になることから特に有害な侮辱を防止する適応性を表す可能性があるために神経系の能力。それは神経伝達物質のグルタミン酸を含む小胞を放出するシナプス前終末の能力のデジタルスイッチングのオンとオフのように表されるので、我々は一部に興味深いものですシナプス可塑性の形態を研究している。ここでは、齧歯類の海馬から調製した解離細胞培養におけるシナプス前終末の活動状況を可視化するためのプロトコルを示す。方法は、一般的にシナプス小胞を標識するために使用されるスチリル色素FM1 -​​ 43の修正可能な形で染色を使用してアクティブなシナプスの検出に依存しています。この染色プロファイルは小胞性グルタミン酸輸送体1（vGluT - 1）に関係なく、活性化状態のすべてのグルタミン酸シナプスを標識するために設計された汚れに対する抗体と同じ端子の免疫染色と比較されます。私たちは、脱分極刺激はシナプス前サイレンシングを誘導することがわかります。ベースライン条件の下で静かであるシナプスの人口は、長期にわたる電気サイレンシングによってまたはcAMPシグナル伝達経路の活性化によって活性化することができます。

グルタミン酸作動性シナプスはサイレントモードにアクティブモードを切り替えることができます。我々は齧歯類の神経細胞の分散培養でそのシナプス前の活動状況を示すと、アクティブなシナプスを可視化するためにFM1 -​​ 43色素の修正可能なフォームを使用し、すべてのグルタミン酸シナプスを可視化するvGluT - 1抗体による免疫染色可視化される。

シナプス可塑性は、神経系の学習および記憶能力の基盤となっていると考えられており、また、それらがなければ起こり得る...を防ぐ適応能を表している可能性もある。

中枢神経系の一部のシナプス前末端は、機能していないか、あるいはサイレント（不活性）であるように見えます。ここでは、サイレントなシナプス前末端を特定するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、末端をサイレント化させる、あるいは覚醒させると考えられる治療法や操作の特定に適用することが可能です。このプロトコルでは、ニューロンの脱分極時にシナプス小胞をバイタルダイで標識し、続いて固定細胞をすべての前シナプス終末（サイレントおよびアクティブの両方）を標識する抗体で標識します。ダイと抗体の両方で共標識されたシナプスはアクティブであり、抗体のみで標識されたシナプスはサイレントです。こんにちは。私はワシントン大学医学部精神科のSteve Minick博士の研究室のアマンダ・テイラーです。私はシャヒンで、同じくManic Labのメンバーです。今日は、培養海馬ニューロンを用いてサイレント前シナプス端を可視化する手順をご紹介します。当研究室では、電気的活動やその他の単一細胞経路が神経伝達物質の放出をどのように調節するかを研究するために、この手順を用いています。それでは始めましょう。無菌的なラミナーフローフード内で、生後0日から3日のラットまたはマウスからHIPAを用いて細胞を回収し、解離細胞培養を調製します。既報のプロトコルに従い、同一の解離細胞から得られた混合グリア培養細胞を、滅菌済みの35 mmディッシュに播種します。各ディッシュには、5 mg/mLのコラーゲンでコーティングした0番カバーガラスを配置します。ニューロンを約500 cells/cm²の密度で播種してください。通常、12匹のラット新生子から30mmディッシュ35枚分を回収できます。培養物は培養インキュベーター内で10～14日間成長させます。シナプスの発達および成熟を促すため、in vitro 4日目に抗有糸分裂剤であるCを添加し、グリア細胞の増殖を停止させます。また、in vitro 5日目に、この成熟期間中のニューロンの生存率を高めるため、Neurobasal MediumにB27サプリメントを添加した培地を用いて、培地を半分量交換します。次に、プレシナプス側のサイレントシナプスの数を変化させる処理を導入します。グルタミン酸作動性シナプスの大部分をサイレント化させる便利な方法の一つとして、30 mMのカリウムによる4時間の処理が有効であることがわかっています。培養が成熟すると、ニューロンは比較的低密度になり、神経突起が十分に分離し、広範囲に伸びているはずです。培養物をインキュベーターから取り出し、作業台に移動させます。培養液を、45 millimolar 塩化カリウムと 10 micromolar FM 1 43 FX ダイを含む緩衝生理食塩水に交換します。また、この溶液には再発的なシグナリングを防ぐためにNBQXおよびAPVを含める必要があります。フォトブリーチングを防ぐため、FM 1-43 FXのストック溶液および実験は暗所に保存することが重要です。したがって、以降のすべてのインキュベーションステップにおいて、培養皿をアルミホイルで覆ってください。室温で正確に2分間インキュベートします。染料溶液を除去し、非特異的な染色の除去のため、500 µM の adversive.Seven を含むリン酸緩衝生理食塩水で3〜5秒間だけ洗浄します。このステップでは、洗浄時間が極めて重要です。F7に長時間さらすと、FM 4-64のラベルがすべて除去されます。その後、化学フームフード内で、F7を含まないリン酸緩衝生理食塩水を用いて、2分間を1サイクルとして5回細胞を洗浄します。4%パラホルムアルデヒドおよび0.2%グルタルアルデヒドを含むPBSで10分間、培養物を固定します。PBSで細胞を短時間洗浄します。これで、細胞をドラフト外に移動させることができます。バックグラウンドを低減し、免疫染色のための細胞透過性を高めるため、4% normal goat serumおよび0.04% tritton Xを含むブロッキング溶液を加えます。15分間インキュベートします。ブロッキング溶液で1:2000に希釈したvlu T one抗体を用いて細胞を染色します。抗体と共に、緩やかな振盪を加えながら3時間培養します。細胞をPBSで4回洗浄します。細胞をAlexaと共にインキュベートします。blocking solutionで1:500に希釈した6 47標識抗モルモット抗体を加えます。二次抗体を含む培養物を、緩やかに揺らしながら30分間保持します。その後、PBSで細胞をさらに4回洗浄します。ピンセットを使用して、清潔なガラススライドに少量のフローア量（floor amount）を滴下します。カバーグラスを取り上げ、スライド上のフローア量の液滴に、細胞がスライド側を向くようにそっと載せます。スライドをそのまま一晩乾燥させてください。共焦点レーザー走査顕微鏡で60倍の油浸対物レンズを準備します。カバーガラスが対物レンズに向くように、スライドをステージ上に配置します。残留色素が保持されやすい細胞体から離れた、密度が高すぎない神経突起の視野を探します。視野サイズを51 by 51 micronsにズームします。画像取得ソフトウェアを使用して、1ステップあたり0.3 micronsの27ステップで、深さ7.8 micronsをカバーするZSスタックを取得します。まず、視野内のすべてのグルタミン酸作動性シナプスを特定するために、VLU T one抗体でスキャンします。次に、取得後の画像を解析するため、FM 1 43 FX蛍光で再スキャンします。解析ソフトウェアを使用して、各ピクセルにおける全プレーンの最大強度読み取り値に基づき、Zスタックを合成単一平面画像に変換し、しきい値を設定します。バックグラウンドを低減させるため、FM 1-43エフェクツ染色の結果を参照せずに、VG glu T 1末端を特定します。そして、これらの点状構造（puncta）に関心領域としてマークします。通常、1視野あたり10個のpunctaを選択します。FM 1-43のエフェクト画像に対して閾値処理とパンクタ選択を繰り返し、画像を重ね合わせることでサイレントシナプスを同定します。活性なFM 1-43陽性シナプスと不活性なFM 1-43陰性シナプスを区別するために、絶対ピクセル基準またはパーセントピクセル基準を使用できます。我々の培養系では、緑色のFM 1-43蛍光と赤色のVglut1染色の重ね合わせ画像において、Vglut1染色で定義されるグルタミン酸作動性シナプスの70から80%で検出可能なFM 1-43染色が見られることがわかりました。これは、共局在マーカーを持つ多数の黄色い点状のシナプスとして認められます。これらは矢印で示されています。赤色のV glut one陽性の点状構造の約20～30%は、ベースラインを上回る緑色のFM 1 43蛍光を示しません。これらは不活性なシナプス前終末であり、矢印で例が示されています。また、3番目のシナプス集団も観察されます。これらは緑色のFM 1-43蛍光陽性ですが、赤色のBglut1染色は認められません。これらは活性GABA作動性シナプスであり、アスタリスクで例が示されています。これらはほとんどの解析から除外されますが、小胞性GABAトランスポーター抗体を用いることで明示的に研究することが可能です。VLU T one抗体の代わりに、FM 1 43とVLU one免疫染色を用いてシナプス前終末でサイレントなシナプスを可視化する方法を示しました。この手順を行う際は、FM 1 43 FXがadver sub seven洗浄の時間およびブロッキング溶液に含まれるX 100処理剤の濃度の両方に敏感であることを覚えておくことが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、解離神経培養および免疫細胞化学を用いて脳切片の両方シナプス数を定量化する方法を詳しく説明します。コンパートメント特異的抗体を用いて、我々は、シナプス前終末だけでなく、シナプス後部の専門のサイトにラベルを付けます。我々は、これらのマーカーによって生成された信号間の共局在のポイントとしてシナプスを定義します。...

定量シナプス：シナプス数を定量する免疫細胞ベースのアッセイ

この報告書は、添付されたシナプス前boutonsを保持する個々の実行可能な神経細胞の機械的な分離のためのテクニックを示しています。...

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

このビデオは、暗順応したマウス網膜組織スライス調製物における光誘発後シナプス応答の記録を示しています。網膜切片を記録室に入れ、記録ピペットを使用して網膜神経節細胞との電気的導通を確立する。光パルスを印加して神経節細胞に興奮性のシナプス後電位を生成し、ピペットで記録します。...

マウス網膜切片のニューロンにおける光誘発シナプス後応答

私たちは、機能的な神経末端での画像シナプス小胞のリサイクルへのスチリルのFM色素の使用を記載している。このプロトコルは、誘発するだけでなく、自発的な、ミニチュアシナプス活動にも適用することができる。プロトコルは、効果的に評価することができシナプス様々なイベントが展開されます。...

誘発、自発的、およびミニチュアシナプス活動中に、FM色素を用いたシナプス小胞のリサイクルの検討

マウスの目から網膜スライスを準備し、網膜ニューロンの光応答を記録する方法を示します。すべての手順は、暗所に適応した条件で行われます。...

パッチクランプ技術を用いたダーク適応、マウス網膜スライス標本におけるニューロンにおける記録光誘発シナプス後応答

このビデオは、Thy1-GFPトランスジェニックラインのin vivo...

同時2光子<em&gt;インビボ</emマウス脳梁膨大後部皮質におけるシナプス入力とシナプス後ターゲットの&gt;イメージング

ここでは、光への長期曝露後に遺伝的にコードされた分子マーカー、およびそれらの調節で強調、数およびキイロショウジョウバエ の光受容体におけるシナプスアクティブゾーンの空間分布を定量化する方法を示しています。...

のシナプス変調を分析<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;長時間の光照射後の感光体

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一次ニューロンにおけるタンパク質とシナプスマーカーの共局在化を研究する超分解能イメージング

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

DetectSynは、治療または疾患状態にわたる相対シナプス(シナプス前およびシナプス後関与)数の変化を測定する、偏りのない迅速な蛍光アッセイです。この技術は、培養ニューロンおよび固定組織の両方において使用することができる近接ライゲーション技術を利用する。...

DetectSyn:シナプス密度の変化を検出するための迅速で偏りのない蛍光法

提示されたプロトコルは、主にシナプス数と樹状突起棘の形態に焦点を当てて、マウスバレル皮質の概日変化を定量化するための透過型電子顕微鏡(TEM)の使用を説明しています。...

マウスバレル皮質における概日シナプス可塑性の解析のための可視化技術としての透過型電子顕微鏡

学ぶ光学顕微鏡を用いたシナプス前サイレントシナプスの同定法。FM1-43蛍光染料とVGLUT1免疫染色を組み合わせて、アクティブとサイレントシナプスを区別する神経科学研究の手法です。

光学顕微鏡で学ぶシナプス前サイレントシナプス

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