アッセイをストレッチ単一分子のDNAを用いて酵素の複製DNAの直接観察

このビデオでは、広視野光学顕微鏡によるDNA複製の可視化、直鎖化および化学修飾ラムダのプロトコールを実演しています。DNAは、官能基化されたガラスカバースリップに付着しています。DNAの自由端はビーズ標識され、DNAは層流によって引き伸ばされます。

複製が開始されると、先頭の鎖が長くなり始め、コイリングにより遅れている鎖が短くなります。二本鎖DNAと一本鎖DNAの長さの大きな差が、低い力で得られるため、複製中のDNA変換を直接観察することができます。DNAコンストラクトの長さは、ビーズの位置を追跡することによって監視され、DNA複製の速度とプロセスを正確に決定することができます。

こんにちは、ハーバード大学医学部生物化学・分子薬理学部のアント・ワン・ヴァニアン研究所とチャールズ・リチャードソン研究所のアリ・ウルリッヒです。今日は、DNA複製を単一分子レベルでイメージングする手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、DNA合成中に起こる酵素活性を研究しています。

それでは、この手順の開始時に始めましょう。直鎖状細菌ファージLambda DNAは、ひざまずくオリゴヌクレオチドによって修飾され、複製フォーク、ラムダ相補型フォークアーム、ビオチン化フォークアーム、およびフォークプライマーを形成します。ビオチン化フォークの前腕には、5つのプライムエンドにビオチンTが付着しており、DNAテンプレートをフローセルの表面にテザリングすることができます。

ラムダDNAは、ビーズの結合のための高親和性免疫タグとして機能するdiggenおよび部分を含む別のオリゴヌクレオチドであるアニーリングによってさらに修飾されます。レプリケーションフォークを生成するには、ラムダDNAに加えて、このビデオに添付されているプロトコルに記載されている配列のいくつかのオリゴヌクレオチドを取得します。これらのオリゴヌクレオチドは、ビオチン化フォークアーム、ラムダ補完フォークアーム、フォークプライマー、およびラムダ補完型diggenを含み、ラムダ補完型フォークアームの5つのプライム末端およびラムダ相補型ジゴゲニン末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化する。

次に、リン酸化ラムダ相補フォークアーム、ビオチン化フォークアーム、フォークプライマー、およびラムダDNAを10:10〜100:1のモル比で混合します。T four DNAリガーゼバッファーでは、混合物を摂氏65度で5分間加熱し、ヒートブロックをオフにして室温までゆっくりと冷却し、オリゴヌクレオチドとT four DNAリガーゼが混合物に適切にアニーリングできるようにし、2時間インキュベートします。室温では、T four DNAリガーゼはオリゴヌクレオチドとラムダの間のニックのシーリングを触媒します。

DNAは最終的に、リン酸化ラムダ相補diggenを添加してDNA複製テンプレートに終了し、T 4リガーゼバッファーで終了し、45°Cで30分間混合物をインキュベートし、再び、ヒートブロックをオフにして室温までゆっくりと冷却し、リン酸化ラムダ相補的なdig酸素をイオン化して、混合物にT 4 DNAリガーゼを添加してDNA複製テンプレートに終了します。室温で2時間インキュベートします。これで、最終的なDNA複製テンプレートを使用する準備が整いました。タッセル活性化磁気ビーズをDNA複製テンプレートに結合するためには、ジゴジェニンに特異的なFABフラグメントで官能基化する必要があります。

このプロセスを開始するには、ビーズのストック溶液を再懸濁し、400マイクロリットルをアイノアチューブに移します。チューブを磁気セパレーターに入れ、溶液が透明になるまでインキュベートします。その後、ピペッティングで上清を除去します 抗体カップリングのためにトール基を活性化するには、1ミリリットルのボイドバッファーを追加し、ピペッティングで穏やかに混合します。

再度、磁気セパレーターを使用して上清を取り除きます。次に、240マイクロリットルのFABフラグメントを添加し、ビーズを400マイクロリットルのホウ酸緩衝液に再懸濁します。十分に混合し、ローテーターで摂氏37度で16〜24時間インキュベー

インキュベーション後、磁気セパレーターを使用してビーズを分離し、上清を取り除きます。ビーズを1ミリリットルの洗浄緩衝液で洗浄し、摂氏4度で5分間インキュベートし、磁気セパレーターを使用して緩衝液を除去します。この洗濯を2回繰り返します。

遊離トシル基をブロックするには、1ミリリットルのBSA含有トリスバッファーを添加し、摂氏37度で4時間インキュベートします。インキュベーション後、磁気セパレーターを使用してビーズから緩衝液を取り出し、緩衝液と分注で2回洗浄します。使用するために、複製されるDNAは、Amil laneで機能化されたガラスカバースリップに付着します。

アミルレーンのオキシ基はガラスに結合し、ビオチン化ペグ分子に結合できるアミンを残します。このコーティングは、表面への非特異的な結合を減らすのに役立ちます。ガラスカバースリップを完全に洗浄するには、それらを染色瓶に入れ、瓶にエタノール超音波処理剤を充填します。

30分間、瓶を洗い流し、1モルの水酸化カリウム超音波酸塩を30分間充填し、両方の洗浄を繰り返します。最初の官能基化反応では、微量の水をすべて除去する必要があります。染色ジャーにアセトンを充填し、10分間超音波処理します。

瓶を空にし、再びアセトンを入れます。サイン試薬を瓶に加え、2分間撹拌します。次に、大量の水で急冷します。

次に、カバースリップをオーブンで摂氏110度で30分間焼いて乾かします。次に、ペグ混合物を体積あたり約0.2%の重量で調製します。ガラスカバースリップスペーサーを含むビオチン化ペグは、カバースリップの分離を可能にし、乾燥したサイロ化されたカバースリップに100マイクロリットルをピペットで移します。

2枚目のカバースリップを上に置きます。カバースリップをPEG溶液で3時間インキュベートします。次に、カバースリップの各ペアを分離し、水で広範囲に洗います。

カバースリップは機能化された面を上にして、片面のみがペグでコーティングされるため、注意してください。最後に、カバースリップを圧縮空気で乾燥させ、真空下で保管します 乾燥剤を使用すると、表面は少なくとも1か月間安定したままです。そのため、数十枚のカバースリップを一括して作成し、必要に応じて使用できます。

カバースリップの準備ができたので、1つは1つの分子実験のための流動室を組み立てることができる。1分子実験は、機能化されたカバースリップ、両面テープ、クォートスライド、およびチューブで構成された単純なフローチャンバーを使用して行われます。1分子の実験ごとに1つのフローチャンバーが用意されています。

まず、5ミリリットルのブロッキングバッファーと20ミリリットルの作業バッファーを混合し、混合物を乾燥剤に入れて、後のステップのために気泡を除去します。次に、PBS中のstrp dinの作業溶液100マイクロリットルを、官能基化したカバースリップを室温で20分間インキュベートし、strp dinが表面ビオチンに結合できるようにするためのものです。その間、クォーツスライドのサイズに合わせて両面テープをカットし、テープのチューブ穴の位置をマークします。

幅3mmの中央チャネルと両方の穴を含む長方形を描画して、フローチャンバーの輪郭を描きます。フローチャンバーは、2つの入口と2つの出口のY字型チャネルで設計できます。次に、描かれたアウトラインに沿ってマークされたテープをカットし、接着剤がチャネルに突き出ないようにまっすぐにきれいにカットします。

アセトンを使用してクォーツスライドを完全に洗浄し、以前の実験で使用したフローセル構造から接着剤を取り除きます。チャネル アウトラインの最適な配置を見つけます。粘着性の裏地の片面をはがし、テープをコートスライドに慎重に置きます。

入口と出口の穴が塞がれないようにする必要があるため、テープを適切に位置合わせするように注意してください。次に、フローセルの入口と出口に内径0.76ミリメートルのチューブカット長のチューブを準備します。チューブの端を約30度の角度で切断して、チューブがチャンバーの底部に平らに押し付けられないようにします。

チューブを試験管ラックに吊り下げて、次のステップでフローセルに簡単に取り付けられるようにします。これで、カバースリップのインキュベーションは終了しているはずです。カバーをすすぎ、水で完全に滑り込ませ、圧縮空気で乾かします。

カバーの滑りをひっくり返さないように注意してください。テープバッキングの反対側を取り外し、クォーツスライドをカバースリップに載せて、フローチャンバーの組み立てを完了しますカバースリップを軽く押して、接着剤に閉じ込められた空気を押し出します。これにより、気泡が流路に入るのを防ぐことができます。

チャンバーの側面をエポキシで密封します。カットしたチューブを石英の穴に挿入し、エポキシで所定の位置に密封します。数分間乾かします。

乾いたら、21ゲージの針を使用してDGAブロッキングバッファーの一部をチューブの1つに引っ張り込み、チャンバー表面をブロックします。数回フラッシュアウトして気泡を取り除き、チャンバーを少なくとも30分間インキュベートしてから、1分子複製実験に移ります。DNAテンプレート官能基ビーズとフローチャンバーを調製したら、1分子実験を行うことができます。

まず、フローセルを顕微鏡ステージに置きます。ステージクリップでチャンバーを所定の位置に保持し、流路がCCDカメラと一直線に配置されていることを確認します。シリンジポンプとフローセルの出口チューブに、以前に構築された空気スプリングに接続します。

大径のコネクタチューブを使用して、フローセルのインレットチューブをブロッキングバッファーに入れ、シリンジを引き戻してチューブから気泡を取り除き、アウトレットチューブを静かにフリックしてフローセルに閉じ込められた気泡を取り除きます。すべての気泡を取り除いたら、インレットチューブの1つを針で塞ぎ、アウトレットチューブの1つを180度曲げて粘着テープで固定して密封します DNAを細胞に添加する前に、ストックDNAテンプレートを1ミリリットルのDGAで10ピコモルに希釈します 1×ブロッキングバッファー。テンプレートを適度な流速でチャンバーに流し込み、DNAの表面を良好にカバーします。

ストックビーズ溶液を、ミリリットルあたり6番目のビーズの10の2〜4倍に希釈します。DGAの1ミリリットルに1xブロッキングバッファ。次に、混合物をボルテックスし、20秒間超音波処理します。

希釈したビーズ溶液をチャンバーに流します。ビーズを追加したら、フローをオフにして、チャンバーが平衡に達するのを待ちます。次に、両方のアウトレットチューブを閉じます。

チャンバーを閉じていない状態でチューブを変更すると、圧力変動が発生し、ビーズに強い力がかかり、つながれたDNA分子がせん断されます。ビーズの装填に使用したインレットチューブを、2本目のインレットチューブで針で差し込みます。DGAs 1 x 溶液のブロッキングバッファー洗浄でフローセルの洗浄を広範囲に開始します。

表面に特異的に付着していないビーズを取り除くためにタップしてステージを攪拌し、それを確認します。ビーズはDNAにつながれています。流れの方向を変えてみてください。

遊離ビーズが十分に除去されたら、流れを止め、チャンバーが平衡に達するまで待ちます。テキストプロトコルに示されているように、複製タンパク質を含む新鮮な反応混合物を調製します。開いている出口チューブを閉じ、入口リザーバーを新しく準備した反応混合物に切り替えます。

酵素反応を進めるための急激な圧力変化を避けるために、ゆっくりと出口を開きます。まず、タンパク質溶液を適度な流速でチャンバーに流し込み、DNAへの効率的な結合を可能にします。流れを止め、チャンバーが平衡に達するのを待ちます。

出口チューブを閉じ、反応混合物を含むチューブを交換します。DGAs洗浄バッファーからなるチューブで、洗浄後にチャンバーを洗浄して遊離タンパク質を除去します。再度、流れをオフにし、チャンバーが平衡に達するのを待ちます。

出口チューブを閉じ、洗浄バッファーの入ったチューブを交換します。T seven複製バッファーを含むチューブでは、T 7複製バッファーには、複製反応の開始をトリガーする塩化マグネシウムが含まれています。このプロトコルに記載されている条件を使用して、DNAテザー上の3ピコネウィン抗力に対応する毎分0.012ミリリットルの流量を使用します。

イメージング前に希土類永久磁石をフローセルの上に置いて、ビーズと表面との間の非特異的な相互作用を防ぎます。10 倍の対物レンズと CCD カメラを使用して、10 度の入射角で、顕微鏡ステージと平行に、顕微鏡の視野の近くにファイバーイルミネーターを配置します。暗視野照明は、テザービーズを使用してビーズイメージングフォーカスのコントラストを高めるために使用されます。

データ集録を低速のフレームレートで20〜30分間開始します。実験が成功すると、100個のビーズを同時に観察することができます。この実験により、主要な鎖DNA合成を示す多数のトレースが得られるはずです。

DNAの巻き戻しと重合の速度と処理を測定するためには、ビーズの正確な位置を決定する必要があります。これらの位置を 2 次元のガウス関数でフィットさせます。トラッキングソフトウェアを使用して各フレームのビード位置を追跡することにより、軌道を視覚化します。

次に、任意のグラフィックソフトウェアを使用してビードの位置を時間の関数としてプロットし、レートデータを取得します。プロットを線形回帰で近似し、processiveの傾きを計算します。短縮イベントの開始から終了までのDNAの全長を決定します。

すべての単一測定値とプロットレートと生産性の分布を組み合わせ、それぞれガウス関数と単一指数関数を使用してデータを適合させます。ここまで、DNA複製の速度と処理を1分子レベルで測定する方法をお見せしました。この手順を行うときは、薄層流による力と特定のベットが複製タンパク質の酵素活性に影響を与えないことを確認することが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験を楽しんでください。