Name: アッセイをストレッチ単一分子のDNAを用いて酵素の複製DNAの直接観察 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 3 s
Description: 学ぶ単一分子レベルでのDNA複製の可視化手法。ラムダDNAを用いた広視野光学顕微鏡法で、リーディングストランドとラギングストランドの動態をリアルタイムで観察し、複製速度とプロセス性を正確に測定する。

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DNA伸長アッセイの開発はポールBlainey、ジョン鳳リー、とSamirハムダンによって助けられた。この作品は、チャールズリチャードソン（GM54397）、およびアントワーヌバンOijen（GM077248）に健康補助金の国立研究所によってサポートされています。

<ol><li>Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+primase+acts+as+a+molecular+brake+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication.</a> Nature. 439, 621-624 (2006).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+Grafted+to+Silicon+Surfaces%3A+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+of+lambda+exonuclease+reveal+base+dependence+and+dynamic+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
</ol>

層流でビーズに加わる抗力は、複製タンパク質の酵素活性に影響を与えないことを保証することが重要です。例えば、0.012 ml / minの流量に対応する3 PNの力は、DNAリーディング鎖の複製には影響しません。しかしそれは協調DNA合成中に行われる酵素活性に影響を与えます、そして、従って、1.5 PNに縮小する必要があります。抗力は、簡単に流量や流路5の幅を変更することによって制御できます。 DNA伸長アッセイは、二重と一本鎖DNAとの間の長さの違いを採用しています。実験では、ssDNAのへのdsDNAの変換は、リーディング鎖の合成（図2）の結果として発生するここで説明する。 ssDNAは6 PN（図1）以下の低伸縮力でのみdsDNAをより短いことを覚えておく必要があります。 この方法の可能な改善は、その3&#39;末端に2番目のビーズを取り付けることにより、レプリケーションテンプレートのラギング鎖を変更することです。このような交代は、DNAの両鎖で行わ酵素活性の直接観察を可能にするであろう。 ...

<table><tbody><tr><td>バクテリオファージ &amp;#955; DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011L</td><td></td></tr><tr><td>DNAオリゴヌクレオチド</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T4ポリヌクレオチドキナーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-ジゴキシゲニンFab</td><td>Roche Group</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>トシル活性化ビーズ</td><td>Invitrogen</td><td>142-03</td><td></td></tr><tr><td>磁性分離装置</td><td>Invitrogen</td><td>Dynal MPC</td><td></td></tr><tr><td>3-アミノプロピルトリエトキシシラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td>他のアミノシランを使用するか、表面密度を低くするために非アミン反応性シランと混合して使用可能</td></tr><tr><td>サクシニミジルプロピオネートPEG</td><td>Nektar</td><td></td><td>同様のPEGはNanocsやCreativePEGWorksなどで購入可能</td></tr><tr><td>ビオチン-PEG-NHS</td><td>Nektar</td><td></td><td>同様のPEGはNanocsやCreativePEGWorksなどで購入可能</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>SA-S-1L</td><td>厚さ 100 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>石英スライド</td><td>Technical Glass</td><td>20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)</td><td>カバーガラスに適合するサイズ。ダイヤモンドチップドリルビット（DiamondBurs.net）で穴あけ加工を行う</td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>内径 0.76 mm, 外径 1.22 mm&lt;br/&gt;他のサイズのチューブで代用可能</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td>1 mg/mL溶液を調製し、PBS pH 7.3で 25 &amp;#x03BC;Lずつ分注する</td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレオチド三リン酸混合溶液</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>10倍対物レンズ付き倒立光学顕微鏡</td><td>Olympus Corporation</td><td>Olympus IX-51</td><td></td></tr><tr><td>永久レアアース磁石</td><td>National Imports</td><td>www.rare-earth-magnets.com</td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>QImaging</td><td>Rolera-XR Fast 139</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Harvard Apparatus</td><td>11 Plus</td><td>溶液交換を容易にするため、リフィルモードで使用する</td></tr><tr><td>ファイバーイルミネーター</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>OSL1</td><td></td></tr></tbody></table>

アッセイをストレッチ単一分子のdnaを用いて酵素の複製dnaの直接観察

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

我々は、バクテリオファージの複製システムのタンパク質によって媒介個々のDNA分子のリアルタイムレプリケーションを観察するための方法を説明します。線形化されたλDNAは、1つの鎖の端にビオチン、および同じ鎖のもう一方の端のジゴキシゲニンの部分を持つように変更されます。ビオチン化エンドは、官能ガラスのカバースリップと小さなビーズにdigoxigeninated末尾に添付されます。フローセルの表面上にこれらのDNA -ビーズテザーのアセンブリは、層流がビーズ上に抗力を発揮する適用することができます。その結果、DNAが近い引き伸ばされていると流量（図1）によって決定される力でカバースリップの表面に平行。 DNAの長さは、ビーズの位置を監視することにより測定されます。一本鎖および二本鎖DNAとの間の長さの違いは、フォークで複製タンパク質の活性のリアルタイム情報を取得するために利用されています。ビーズの位置を測定することで巻き戻しDNAと重合（図2）の速度とprocessivitiesの正確な測定が可能になります。

我々は、バクテリオファージの複製システムのタンパク質によって媒介個々のDNA分子のリアルタイムレプリケーションを観察するための方法を説明します。

アッセイをストレッチ単一分子のDNAを用いて酵素の複製DNAの直接観察

バクテリオファージの複製システムに属するタンパク質が媒介する、個々のDNA分子のリアルタイム複製の観察方法について記述します。

このビデオでは、広視野光学顕微鏡を用いて、線状化し化学修飾を施したλ DNAの複製を可視化するプロトコルを紹介します。DNAは機能化されたガラスカバースリップに固定されます。DNAの自由端にはビーズで標識がなされ、層流によってDNAが伸展されます。複製が開始されると、リーディングストランドが伸長し始める一方で、ラギングストランドは巻き戻しによって短くなります。低荷重条件下では、二本鎖DNAと一本鎖DNAの長さに大きな差があるため、複製中のDNA転換を直接観察することが可能です。ビーズの位置を追跡することでDNA構築物の長さをモニタリングし、これによりDNA複製の速度とプロセスを精密に決定することができます。こんにちは。ハーバード大学医学部、生物化学・分子薬理学部のAnto one VanianおよびCharles Richardsonの研究室のAri Ulrichです。本日は、単一分子レベルでDNA複製をイメージングする手順をご紹介します。私たちの研究室では、DNA合成中に起こる酵素活性を研究するためにこの手法を用いています。それでは始めましょう。この手順の最初では、線状化したバクテリアファージLambda DNAを、アニーリングさせるオリゴヌクレオチドによって修飾し、複製フォーク、lambda相補的フォークアーム、ビオチン化フォークアーム、およびフォークプライマーを形成させます。ビオチン化フォークアームの5'末端にはビオチンが結合しており、これによりDNAテンプレートをフローセルの表面に固定することが可能になります。λ DNAは、ビーズへの結合のための高親和性免疫タグとして機能するdiggenin部位を含む別のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることで、さらに修飾されます。複製フォークを生成するには、λ DNAに加えて、本ビデオに付随する書面プロトコルに記載されている配列を持ついくつかのオリゴヌクレオチドを用意します。これらのオリゴヌクレオチドには、ビオチン化したフォークアーム、λ相補的フォークアーム、フォークプライマー、およびλ相補的diggenin末端が含まれます。T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、λ相補的フォークアームおよびλ相補的diggenin末端の5'末端をリン酸化します。次に、リン酸化したλ相補的フォークアーム、ビオチン化フォークアーム、フォークプライマー、およびλDNAを、モル比10:10:100:1で混合します。T4 DNA Ligase buffer中で、混合液を65 °Cで5分間加熱し、ヒートブロックの電源を切ることで室温までゆっくりと冷却し、オリゴヌクレオチドとT4 DNA ligaseを混合液に適切にアニーリングさせ、2時間インキュベートします。室温において、T4 DNA LigaseがオリゴヌクレオチドとλDNAの間のニッ

direct-observation-enzymes-replicating-dna-using-single-molecule-dna

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、リアルタイムで個々のreplisomesによってDNA複製を視覚化するためのシンプルな単一分子蛍光顕微鏡の技法を示しています。...

蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

DT40、モデル脊椎動物の遺伝学的システムは、タンパク質の機能を解析する強力なツールが用意されています。ここでは、単一分子レベルでのDT40細胞におけるS期の間にDNA合成に影響を与えるパラメータの定性的な分析を可能にするシンプルな方法を説明します。...

DNAの繊維技術を用いた脊椎動物のモデルシステムのDT40のDNA複製の可視化

この研究は、単一分子蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて二本鎖DNAのループダイナミクスを測定するための詳細な実験手順を提示する。プロトコルは、Jファクターと呼ばれるループする確率密度を抽出する方法を説明します。...

1分子FRETによるDNAループを研究

このプロトコルは、DNA 分子の一次元 (1 D)...

シンプルで堅牢、かつ高スループットの単一分子 DNA 分子の輸送を研究するためのストレッチ法の実装を流れ

このプロトコルでは、電気泳動、ゲル画像を用いた近赤外蛍光に分類された DNA に変化の観察を通じて変更された DNA の DNA...

アクリルアミドゲル電気泳動法で可視化した近赤外蛍光標識 DNA を用いた DNA ポリメラーゼ活性測定法

単一分子レベルでのDNAの部位特異的切断を測定するための高度に平行な方法が記載されている。このプロトコルは、制限エンドヌクレアーゼNdeIを用いた手法を示す。この方法は、部位特異的なDNA切断をもたらす任意のプロセスを研究するために容易に改変することができる。...

部位特異的DNA切断のための並列高スループット単一分子運動アッセイ

量子ドット標識DNAと全反射蛍光顕微鏡を用いて、非標識タンパク質を用いた制限エンドヌクレアーゼの反応機構を調べることができます。この単一分子技術により、個々のタンパク質-DNA相互作用の大規模な多重化観察が可能になり、データをプールして、十分に蓄積された滞留時間分布を生成できます。...

制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析

この方法論は、ナノ粒子の存在下でのDNA複製ダイナミクスの変動の分析に役立ちます。目的の材料の細胞毒性レベルに基づいて、さまざまな方法論を採用できます。さらに、DNAファイバー解析に役立つように画像解析の説明が提供される。...

ナノ粒子によって誘発されるDNA損傷および修復ダイナミクスを調べるためのDNAファイバーアッセイのデモンストレーション

タンパク質関連新生DNAの濃縮およびシーケンス(eSPAN)は、2本の複製DNA鎖におけるクロマチン関連タンパク質の相対的な存在比を検出するために開発され、クロマチン複製およびその結合過程に関する分子的知見を明らかにしました。このプロトコルは、酵母およびマウスの胚性幹細胞(ES)細胞におけるeSPAN手技を記述しています。...

タンパク質関連新生DNA法の濃縮およびシーケンスによる複製DNA鎖におけるタンパク質の鎖特異的解析

このプロトコルは、CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しのライブ可視化のための単一分子アッセイの実施を示しています。(1)DNA基質の調製、(2)蛍光標識 されたDrosophila melanogaster...

CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しの1分子リアルタイム可視化

このプロトコルは、蛍光顕微鏡法に基づく単一分子DNA複製アッセイの概要を示しており、DNAポリメラーゼとG-四重鎖構造などの障害物との間の相互作用をリアルタイムで可視化することができます。...

G-四重鎖におけるDNAポリメラーゼダイナミクスの1分子蛍光可視化

学ぶ単一分子レベルでのDNA複製の可視化手法。ラムダDNAを用いた広視野光学顕微鏡法で、リーディングストランドとラギングストランドの動態をリアルタイムで観察し、複製速度とプロセス性を正確に測定する。

アッセイをストレッチ単一分子のDNAを用いて酵素の複製DNAの直接観察

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