から毒素誘導とタンパク質抽出フザリウム属属。文化

真菌種のプロテオーム解析のためのタンパク質の抽出は、プロテオーム実験（MIAPE）ガイドラインに関する最小限の情報に応じて達成される標準化の高いレベルが必要です。私たちは、から毒素の誘導と蛋白質の抽出時に実験的なバイアスを最小限にするための手順が含まれているビデオプロトコルを提示

このビデオでは、この場合のome種における毒素シンシンシスの誘導手順と、当研究室でのプロテオミクス研究に用いる全プロテ抽出のプロトコールについて解説しています。手順の長さは、16日、真菌の増殖に4日、毒素癒合に10日、タンパク質抽出に2日です。4日後、コロニーはまだプレートの端に向かって活発に成長しています。

典型的な空中菌糸体が形成され、プレートの表面を優しく引っ掻くことにより、ラミナフローボックスの下にステロイドブレードを使用して収集されます。菌糸体を5つの小さな断片にカットし、25ミリリットルの毒素誘導培地が入った初期のマイフラスコに加えます。毒素誘導は、ダークダストよりも効率的です。

フラスコはアルミニウムで覆われています。その後、培養物を10日間、摂氏25度で毎分150ラウンド振とうします。媒体はSAPH製で、高濃度のS列溶液を含んでいます。

暗闇と一緒にベッドは、リアの毒素の癒着を促進することが知られています。次に、菌糸体は、MI近接組織でろ過することにより、毒素を含む液体から分離されます。液体は毒素含有量の測定に使用でき、菌糸体はタンパク質抽出に使用されます。

メディアのキャリーオーバーを避けるために、私の天井は滅菌水で3回洗われます。余分な水は、その後、液体窒素のように追加され、サンプルはマイナス80度で保存するか、タンパク質抽出に使用することができる。タンパク質抽出手順は、SDSとTCAの使用に基づいており、さまざまな溶解ステップで構成されています。

複数のオペレーターを包含して実施する手法を提案します。生物学的複製の抽出と同時に、異なるオペレーターが各複製を実行します。この手順では、反復を処理するさまざまなオペレーターによって生成される抽出手順の違いが考慮されます。

したがって、生物学的反復を比較すると、演算子変数が反復に含まれるため、より高い堅牢性を示すはずです。同時に、複数のオペレーターを使用することで、処理時間を短縮できます。サンプルは、菌糸体が微粉末になるまで液体窒素を使用して滅菌乳鉢で粉砕されます。

このステップは、タンパク質の品質と量にとって非常に重要です。菌糸体は、チューブの総体積の10分の4の割合で10ミリのテフロンチューブに収集されます。次に、SDSおよび異なるプロテアーゼ阻害剤を含む溶解バッファーを添加します。

次に、均一な溶液が得られるまでチューブを振とうします。次に、サンプルをコードチャンバー内で30分間振とうしてさらに均質化し、サンプルを煮沸して細胞壁と疎水性タンパク質を溶解します。SDSの存在は、タンパク質の沈殿を中止するオリゴマーの形成を防ぎます。

遠心分離ステップでは、3つのフェーズが分離されます。タンパク質は透明な溶液に懸濁され、氷上に保持された新しいチューブに集められます。次に、パレットを使用して、ボルテックス、沸騰、遠心分離を繰り返す2番目のステップを実行します。

2つの溶解からのスナットを組み合わせて、氷河沈殿、酸性トーンを含むバッファー、三酸性酸、およびDTTによる沈殿を行います。その後、サンプルをマイナス20°Cで16時間一晩保存し、タンパク質を許容します。沈殿タンパク質は、沈殿を改善するためにチューブの底に位置しています。

チューブは45分間高速で遠心分離されます。口蓋がよく見えるようになりました。上澄みは、5ミリリットルのパイプパッドを使用して廃棄できます。

次に、アセトンとDTTを含む25ミリリットルの氷河洗浄バッファーを追加することでTCAが除去されます。その後、しっかりと激しく振とうします。次に、新しい遠心分離ステップが実行されます。

タンパク質の口蓋が浮いているので、スナットを排除するために張力を払う必要があります。第2の洗浄ステップが実行され、洗浄、緩衝液、振とう、遠心分離が加わります。SUP剤を排除し、サンプルをスピードバッグを使用して乾燥させます。

サンプルが乾燥すると、タンパク質は粉末のような粘稠度になります。保存します。サンプルタンパク質は、プラスチックの静電干渉を減らすためにチューブから収集する必要があります。

静電ピストルを使用し、金属ヘラを使用してタンパク質粉末を採取します。その後、タンパク質は標識バッファーに直接懸濁されます。毎分800グラムで30分間の2Dダッシュに使用されます。

可溶化には十分です。高価な2Dダッシュラベリングに進む前のタンパク質。タンパク質の品質は、ご覧のとおり、SDSページの1次元ゲルでテストされます。

レーンの端に顕著な汚れがないことは、サンプルの品質が良好であることを示唆しています。