Name: 癌細胞のPuraMatrixのカプセル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学ぶPuraMatrixを用いた卵巣がん細胞株CAR5の3Dカプセル化培養法。自己集合性ペプチドゲルで微小転移結節様構造を形成し、in vivo環境を再現したがん研究に応用可能です。

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テクニカルノート： <ul><li>ゲル化は、塩の添加によって開始されます。したがって、ゲル化が望まれるまでには塩がPuraMatrixに接触しないことが重要ですし、非常に低イオン強度の塩（例えば、&lt;0.05 M）への曝露は、不可逆的なゲル化が発生します。 </li><li>用意されている残りの原液は、彼らは塩と接触されていなければ後日使用することができます。あなたは繰り返し超音波処理を心配する必要はありません。 </li><li>気泡を遠心分離に続いて滅菌チューブにPuraMatrixを小分け削除することができます。 </li><li>簡単にPuraMatrixのベッドを混乱させることができる吸引などのメディアの変化時には十分注意してください。 </li></ul>材料： BD PuraMatrix RAD16のペプチドハイドロゲル1％（カタログ番号354250）：原液混合物の総ペプチドの濃度は10 mg / mlである。 <ul><li>水浴ソニケーターまたはボルテックス</li><li> 96ウェル細胞培養ディッシュ</li><li>細胞培養培地</li><li>滅菌濾過したH 2 O </li><li>滅菌濾過した20％ショ糖</li><li>細胞（全5,000細胞/ウェル）：OVCAR - 5 </li></ul>すべてのステップは、無菌条件下で行う必要があります。 手順： <ol><li>使用前に粘度を減らすために30分間水浴の超音波処理で1％PuraMatrix（RAD16）を超音波で分解する。 </li><li> 1％PuraMatrixのソリューションは現在、将来の実験を簡素化するために滅菌チューブに等分することができます。 <ol class="lalpha"><li>気泡の形成を避け、彼らが形成している場合は単純に5分間1000rpmで（300 × g）でPuraMatrixを含有する滅菌チューブをスピンダウン。 </li><li>原液混合物の総ペプチドの濃度は10 mg / mlである。 </li></ol></li><li> 4ウェルの二組はそれぞれ、2.5 mg / mlの1.25 mg / mlの合計ペプチドの濃度で播種される。 </li><li> 10％ショ糖でBD PuraMatrixの2倍の濃度を達成するために、それぞれ、よく0.2μmの5 mg / mlのと2.5 mg / mlの合計ペプチド濃度まで滅菌濾過した20％ショ糖と13.3％のショ糖で設定された各PuraMatrixを希釈する。 <ol class="lalpha"><li> 20％のショ糖を作るために、次にスクロース10gを、50mlの水にボリュームを希釈する。 </li><li> 13％、10％ショ糖を20％ストック溶液を希釈することにより調製することができる。 <ol class="lroman"><li> 13％ショ糖（各10 mlの）：6.5ミリリットル20％ショ糖+ 3.5 mlの滅菌H 2 O </li><li> 10％ショ糖（各10 mlの）：5.0ミリリットル20％ショ糖+ 5.0 mlの滅菌H 2 O </li></ol></li></ol></li><li>あなたがプレートにしようと井戸の数に基づいてPuraMatrixペプチドのマスターミックスを調製する。 （下記の例を参照してください。）それからマスターミックスの25mlを含む個々のチューブに分注し。 <ol class="lalpha"><li>マスターミックスは、それがメッキ中に細胞の等体積で希釈されるため、合計ペプチドの倍所望の最終濃度に調製してください。 <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig11.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"></li></ol></li><li>細胞単層培養細胞をトリプシン処理により細胞懸濁液を準備します。 <ol class="lalpha"><li> 0.05％トリプシンEDTA 2mlを各T - 75フラスコに使用することができます。 </li></ol></li><li> 10％の熱不活化ウシ胎児血清を含む細胞培養培地の添加によりトリプシンを中和する（前のステップで使用されるトリプシンのmlあたりのメディアの少なくとも2 mlを使用する。） </li><li>細胞ペレットを作成するために5分間1000rpmで（〜300 × g）で細胞を遠心分離します。 <ol><li> 10パーセント滅菌濾過したショ糖で細胞を再懸濁します。 </li><li>細胞をカウントし、メディアに見られる塩の微量を削除するには、5分間で1000rpm（〜300 × g）で再びスピンダウン。 </li></ol></li><li>ウェル当たりの最終細胞数は、各ウェルに5,000細胞になるように2.0 × 10 5細胞/ mlで10％ショ糖でOVCAR - 5細胞を再懸濁します。 次の手順を迅速に実行する必要があります。 </li><li>上記の回路図に示すようにPuraMatrixのマスターミックス25μlを含む最初の個々のチューブに2.0 × 10 5細胞/ mlの懸濁液25μlを追加します。 <ol class="lalpha"><li>すぐに気泡を導入することなく、チューブに（上下〜5回）ピペッティングにより混和する。 </li><li>その後96ウェルディッシュの適切なウェルに50μlの細胞懸濁液/ PuraMatrix混合物をピペットで。 </li><li>優しくもの側面に150μlの細胞培養培地（RPMI + 10％FBS）をピペッティングでのBD PuraMatrixのゲル化を開始 <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig12.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"></li></ol></li><li>すべての井戸がメッキされるまで、8で説明した手順を繰り返します。 </li><li> 30分後に非常に穏やかにハイドロゲルのpHを平衡化するために200μlのピペットを使用して、メディアの〜2 / 3を削除。 <ol class="lalpha"><li> これはマトリックスが中断されます、真空吸引器を使用しないでください </li><li> よくなるようにピペットチップを置きますそれは、PuraMatrixのベッドに触れ、ゆっくりとよくからメディアを削除しません。 </li><li> ケアは、PuraMatrixの細胞の培養中に行列を妨害しないように注意してください。 </li></ol></li><li> 非常にゆっくりと PuraMatrix内にカプセル化も含むセルの側面に新たな細胞培養培地150μlを加える。 </li><li>慎重に手順10と11を繰り返すことによって、新鮮な培地で各ウェル毎に48時間の細胞培養培地を変更します。 </li></ol>代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig1tmb.jpg" alt="図1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 上記のプロトコルで説明したように図1。OVCAR - 5細胞を封入した。画像は、スペクトラフィジックスDeepSeeのチタンを搭載した倒立オリンパスFV1000顕微鏡を用いて取得されました：サファイアレーザーは750 nmのように調整。イメージングセッションは1日目、3、5と7のポスト - メッキに実施された。 40倍対物レンズ（オリンパスLUMPLFLN 0.8 NA）を浸漬長い作動距離、水がPuraMatrixを通してイメージに使用されていました。三次元ボリュームは、1.47μmの軸方向のステップで画像スタックを取得することにより収集した。二つの非デスキャン検出器は紫（440〜490 nm）と緑（510〜550 nm）のバンドパスフィルタを用いて自家蛍光発光を収集した。最終的な画像と深さのスタックムービーは、両方の検出チャネルを組み合わせることで、ImageJを用いて処理した。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1692/1692_fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。

<ol><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+Peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS One. 1, e119-e119 (2006).</li>
</ol>

癌細胞のpuramatrixのカプセル化

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

増加する証拠は、反復する腫瘍生物学の複雑さをより正確に三次元的にその培養癌細胞を示唆している。これらのモデルの多くは、これらの細胞培養モデルの成長に影響を与えることができる成長因子やサイトカインの変数量を含む動物由来の再構成基底膜を利用する。ここで、我々は詳細に説明PuraMatrix、動物由来の材料および卵巣癌細胞株、OVCAR - 5をカプセル化し、伝播する病原体を欠いている市販の自己組み立てペプチドゲルの調製および使用。我々は、使用前にPuraMatrixを準備する方法を説明することから始めます。次に、我々は適切にハイドロゲルに細胞をカプセル化するPuraMatrixと細胞懸濁液を混合する方法を示します。生理的な環境への細胞培養培地または注射を添加すると、PuraMatrixのペプチド成分は急速に自己は、500から200 nmの平均孔径をナノメートルスケールの繊維状の構造を示す3Dハイドロゲルに組み立て<sup&gt; 1</sup&gt;。さらに、我々はカプセル化されたPuraMatrixで育った文化を伝播する方法を示します。 PuraMatrixにカプセル化されたときは、OVCAR - 5細胞は、より密接にin vitroモデル単層よりも診療所で観測された微小結節の形態のようになっていることを三次元腺構造に組み立てる。共焦点顕微鏡を用いて、我々は1日、3、5、および7のポストのメッキにPuraMatrixにカプセル化された代表的なOVCAR - 5細胞の外観を示しています。文化の癌細胞へPuraMatrixの使用は、病気の我々の理解を改善し、より臨床的に予測モデル系における治療効果を評価できるようにする必要があります。

このビデオはPuraMatrix、ペプチドのゲルを組み立てる市販の自己のがん細胞をカプセル化し、文化に方法を示しています。

癌細胞のPuraMatrixのカプセル化

がん細胞を3次元で培養することで、腫瘍生物学の複雑性をより正確に再現できることを示す根拠が増えています。これらの多くは...

単層細胞培養モデルは、がんを含むさまざまな疾患の研究において非常に有用なツールとなってきました。しかし、これらのモデルでは、生体内で観察される三次元的な環境を再現することができません。このビデオでは、市販の自己組織化ペプチドゲルであるpure Matrixxを用いて、卵巣がん細胞株CAR fiveを封入し、増殖させる方法を実演します。細胞懸濁液を純粋なMatrixxおよび細胞培養液と混合します。純粋なMatrixxに封入して培養し、活性化させるために培地を添加します。純粋なMatrixx内で培養すると、5つの細胞が凝集して、微小転移結節の形態に類似した3D ASIN R構造を形成します。こんにちは、私はAdnan Abbiです。私はマサチューセッツ総合病院のWoman Center for Photo MedicineにあるTBA Hassan博士の研究室の研究員です。本日は、pure matrixと呼ばれる合成マトリックス内に卵巣がん細胞株を封入して培養するためのプロトコルをご紹介します。当研究室では、卵巣がんの治療反応性を評価するためにこのモデルを使用しています。それでは始めましょう。BD 1%pure matrix RAD 16ペプチドハイドロゲルは、使用前の全ペプチド濃度が10 mg/mLとなっています。滅菌状態を維持しながら、ウォーターバスで30分間ソニケーションを行い、pure matrixの粘度を下げます。1% pure matrix溶液を滅菌チューブに分注します。今後の実験を簡略化するため、気泡の形成を避けてください。気泡が生じた場合は、pure matrixを含む滅菌チューブを1000 RPMで5分間遠心分離して解消させます。本デモンストレーションでは、合計ペプチド濃度が2.5 mg/mLおよび1.25 mg/mLとなるよう、4ウェルずつの2セットをプレートします。プレート予定のウェル数（今回は8ウェル）に基づき、pure matrixペプチドのマスターミックスを2種類調製します。各マスターミックスは、プレートへの播種時に等量の細胞で希釈されるため、全ペプチドの目的最終濃度の2倍で調製する必要があります。純粋なMatrixxを滅菌済み10% sucroseおよび13.3% sucroseで希釈し、全ペプチド濃度がそれぞれ5 mg/mLおよび2.5 mg/mLとなるようにして、10% Sucrose中での純粋なMatrixxの2倍濃度を実現します。次に、マスターミックスを25 µLずつ8本の個別のチューブに分注します。これで、細胞を封入するための純粋なMatrixxマスターミックスの準備が完了しました。本実験では、卵巣がん細胞株CAR5を封入し、増殖させます。トリプシン処理の前に、細胞をカルシウムおよびマグネシウム不含の滅菌済みPBS 10 mLとともに15～20分間インキュベートします。PBSを吸引し、細胞単層培養物をトリプシン処理します。10%熱不活化胎児ウシ血清を含む細胞培養液を加え、トリプシンを中和します。この際、前段階で使用したトリプシン1 mLあたり、少なくとも2 mLの培養液を使用してください。次に、細胞を遠心管に移し、1000 RPMで5分間遠心分離して細胞ペレットを作成します。遠心分離後、細胞ペレットを10%滅菌ろ過済みスクロースに懸濁します。細胞数を計測し、再び1000 RPMで5分間遠心分離します。培地に含まれる微量の塩を除去するため、最終的なウェルあたりの細胞数が5,000個になるように、細胞を10%スクロースを用いて2×10⁵ cells/mLの濃度で懸濁します。これで細胞をpure Matrixxに封入する準備が整いました。pure matrixへの細胞封入に関する以下の手順は迅速に行う必要があります。あらかじめ調製した細胞懸濁液25 µLを、pure Matrixxのマスターミックス25 µLが入った個別のチューブに加えます。気泡が入らないように注意しながら、ピペッティングで5回ほど素早く上下に混ぜ合わせます。次に、50 µLの細胞懸濁液を含むpure Matrixx混合液を、96ウェル細胞培養プレートの適切なウェルにピペッティングします。ウェルの側面に細胞培養培地150 µLを静かにピペッティングし、BD pure matrixの凝固を開始させます。残りのウェルについても、同様に細胞の封入手順を繰り返します。これらのステップは迅速に行う必要があり、次のウェルに移る前に、1つのウェルに対して封入の手順をすべて完了させてください。8つすべてのウェルに播種した後、30分間放置します。30分後、200 µLピペットを用いて、ピペットチップが純粋なマトリックス層に触れないようにウェルに差し込み、非常にゆっくりと培地を除去します。ハイドロゲルのpHを平衡化させるため、培地の約3分の2を除去する必要があります。マトリックスが乱れるため、バキュームアスピレーターは使用しないでください。次に、純粋なMatrixxに封入された細胞が入っているウェルの壁面に沿って、150 µLの新鮮な細胞培養培地を非常にゆっくりと加えてください。前述と同様の手順で、培地の3分の2を除去し、残りのウェルに新鮮な培地を加えてください。48時間ごとに、各ウェルの細胞培養液を新鮮な培養液に交換します。前述のプロトコルに従い、Ocar five細胞を封入しました。純粋なマトリックス内で封入・培養されたOR five細胞の、1日目、3日目、5日目、および7日目の画像を代表的な3Dレンダリングで示します。ここでは、卵巣がん細胞株OCar5とPure Matrixxと呼ばれる合成マトリックスを用いて、培養下で封入する方法を説明しました。Pure Matrixxを使用する際は、このプロトコルがOCar5細胞株に合わせて最適化されていることに留意してください。研究者は各自、使用する特定の細胞株に合わせてプロトコルの最適化および微調整を行う必要があります。培地交換を行う際は、マトリックスベッドが非常に壊れやすいため、これを乱さないようにすることが極めて重要です。吸引は絶対に行わず、常にピペットを使用してください。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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