Name: KLRG1テトラマーの生産のためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 学ぶKLRG1テトラマー製造プロトコル。細菌培養とIPTG誘導によるタンパク質発現、精製を含む手法で免疫学研究に応用可能。KLRG1リガンド相互作用解析のための強力なツールを作成する方法を解説。

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我々は、リフォールディング条件を最適化することで助けを博士Naidenkoに感謝。この作品は、ローランBrossayにNIHの研究助成金AI58181によってサポートされていました。シンディあるbanhはNIH NRSA F31 AI080230によってサポートされています。 ステファニーTerrizziとシンディあるbanhはこの作品にも同様に寄与する。

封入体の調製<ol><li> TBの4 × 500ミリリットルのフラスコに接種する各KLRG1プラスミド構築物を発現している細菌の一晩培養では50μg/カルベニシリンとのクロラムフェニコールを含む。 ODが600 nmで0.6 Åに達すると、37℃で0.4 M IPTGの添加により誘導と握手さらに4時間培養液を、C. </li><li>再懸濁緩衝液pH = 8.0（50mMトリス- HCl、25％（W / V）ショ糖、1mMのEDTA、10mMのDTT）で採取された細胞を再懸濁します。注：ペレットがこの段階で凍結することができます。 </li><li>ポリプロピレンのビーカー内の細菌resuspensionsを60mlよりプールこれ以上ない。必要な場合は、TE緩衝液pH8.0で60 mlに調整し、半分の速度で混合物をかき混ぜる。 </li><li>攪拌混合物に滴下して加える：リゾチーム（最終= 1 mg / ml）を、MgCl2の（最後の= 5 mM）を、2 mgをDNase Iでは50％グリセロール、75 mM NaClを、トリトン- X100を（最後の= 1％）含まれて、DTTを（最後の= 10 mM）を。 </li><li> 1.5分間氷上でソリューションを超音波処理し、4℃で10分間、5,000 rpmでライセートを遠心℃に<ol class="lalpha"><li>上清をデカント。 </li><li>洗浄緩衝液の15 mlを加え= 8.0（50mMトリス- HCl、0.5％トリトンX - 100、100mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのDTT）。 </li><li>ペレットが完全に再懸濁されるまで氷上で、1.5分間のソリューションを超音波処理。 </li><li>で10分間4℃でサンプルを5,000 rpmで遠心する</li><li>洗濯5回を繰り返します。 </li></ol></li><li> TEバッファー4mlのトリトンX - 100、遠心分離と再懸なく、洗浄バッファーで5bを繰り返します。 </li><li> 30から100 mg / mlの濃度で湿重量の封入体のスラリーとTEバッファーに格納してください。 </li></ol> KLRG1のリフォールディング<ol><li>バッファーのpHをリフォールディングの1 Lを作る= 8.0（0.4 Mアルギニン塩酸、0.1 MトリスpHは8〜8.3、2mMのEDTA、0.2mMのPMSF、3 EDTA -フリープロテアーゼ阻害剤の錠剤、5mMのGSHおよび0.5mM GSSG）とチル〜4℃、攪拌しながら。 </li><li>折り畳み式の混合物への注入のために封入体を準備する：これは、タンパク質の最終濃度が2 3μMとなるように0.25 0.5μMの濃度で各5 10注射をするのに最適です。 <ol class="lalpha"><li> 10mMのβ-メルカプトエタノールで7 M GnHClにおける封入体のスラリーの50mgの量を溶かす。 </li><li> 37℃で封入体/ GnHCl混合物を保持℃で30用のC - 40分と渦完全な溶融を確実にするために5分ごとに（完全に溶融するときにスラリーが明らかになる）。 </li><li> 4で微量遠心機で30分間最大速度で遠心° Cと15 ml遠心チューブに上清を移す。小さな黒っぽいペレットのいずれかを転送するためにしないでください。 </li></ol></li><li>インジェクションバッファー（3 M GnHCl、10mMの酢酸ナトリウム、pHは4.2,10 mMのEDTA）で音量を調整します。 </li><li>希薄化後の封入体時間ごとの1mlを注入する。注入するときは、各ドロップの間に2秒でドロップによる希薄化後の封入体の降下の1 mlを追加する、高速でかき混ぜる。注入が完了すると、低速でかき混ぜる。 </li><li>一晩4℃で低速で撹拌し続ける℃に</li></ol>リフォールディング反応の濃度<ol><li>ミリポアのプロトコールに従い、アミコンを使用して（0.22μmのフィルタ処理）フィルタの適用前のリフォールディング反応の1 Lを集中〜10 mlに細胞とYM10 NMWL 10K限外ろ過膜（Millipore）を攪拌。 </li><li> Centriplus YM - 10 10K MWCOを（ミリポア）を使用して≤2 mlに集中する。 </li></ol> KLRG1四量体の精製<ol><li> 4時AKTAFPLCをセットアップ° C GEヘルスケアのマニュアルにしたがって。 </li><li> 20mMのHEPES、150 mMのNaClでセファクリルS - 200 60分の16の高分解能カラム（GE Healthcare）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによってKLRG1の単量体の形を浄化する。 （図1を参照してください）​​。 </li><li> Centriplus YM - 10 10K MWCOを（ミリポア）を使用して1mlに濃縮する。 </li><li> KLRG1モノマーをビオチニル化するために親和力のプロトコルに従ってのBirA酵素を使用してください。 </li><li>遊離ビオチンは、2のようにサイズ排除クロマトグラフィーによって除去される。 </li><li> KLRG1分子を4倍モル過剰PE結合ストレプトアビジン（BD Biosciences社）でKLRG1モノマーを混合することによりtetramerizedている。 </li></ol>代表的な結果 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="図1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"></a> 図1代表的なリフォールディングKLRG1のAKTA FPLCのサイズ排除クロマトグラフィーからの肯定的な結果を。グラフは、モノマーの分離（83.52ミリリットル）、ダイマー（56.36ミリリットル）、およびリフォールディングKLRG1のマルチマー（36.26ミリリットル）の形式を示しています。 94.25ミリリットルのピークは、バッファの交換を表します。

<ol><li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li>
<li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li>
<li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li>
<li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li>
<li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+%28KLRG1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

このプロトコルでは、ビオチニル化する、精製する方法が示され、tetramerize KLRG1ている。 KLRG1四量体はフローサイトメトリーでKLRG1リガンドを標識するために使用することができます。リフォールディング条件は各タンパク質のために経験的にテストされる必要があるものの、他のC型レクチンは、同様のプロトコルを使用してtetramerizedすることができます。プローブとしてtetramerizedタンパク質を使用して、孤児のC型レクチン受容体にリガンドが潜在的に同定することができた。

<table><tbody><tr><td>BirA酵素およびバッファー</td><td>ビオチン化キット</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free</td><td>試薬</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>Amicon Stirred Cell</td><td>機器</td><td>EMD Millipore</td><td>Model #8400</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>YM10 NMWL 10K限外ろ過膜</td><td>ろ過用品</td><td>EMD Millipore</td><td>13642</td><td></td></tr><tr><td>15 ml YM10 コンセントレーター</td><td>ろ過用品</td><td>EMD Millipore</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>AKTAFPLC</td><td>機器</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-200 16/60 高分解能カラム</td><td>機器</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Strepavidin PE</td><td>試薬</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>または同等品</td></tr></tbody></table>

klrg1テトラマーの生産のためのプロトコル

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

キラー細胞レクチン様受容体のG1（KLRG1）はC型レクチン様スーパーファミリーに属するII型膜貫通糖タンパク質抑制性受容体である。 KLRG1は、モノマーとして、及びジスルフィド結合ホモダイマーとしても存在する。このよく保存された受容体は、最も成熟し、最近では活性化NK細胞だけでなく、エフェクター/メモリーT細胞のサブセットに記載されています。 KLRG1四量体だけでなく、他の方法を使用して、E -、N -、およびR -カドヘリンはKLRG1リガンドとして同定された。これらのCa 2 +依存性細胞間接着分子は細胞間相互作用、膜貫通ドメインとアクチン細胞骨格にリンクされている細胞質ドメインの責任fiveカドヘリンリピートを含む細胞外ドメインで構成する。 KLRG1四量体の生成はKLRG1リガンドの同定に不可欠でした。 KLRG1四量体はまた、免疫応答と組織の整合性の調節に役割のカドヘリンとKLRG1プレイを解明するユニークなツールです。

このプロトコルは、KLRG1リガンドの分析のための強力なツールですKLRG1四量体、の製造を説明します。

KLRG1テトラマーの生産のためのプロトコル

キラー細胞レクチン様受容体G1（KLRG1）は、C型レクチン様スーパーファミリーに属するII型膜貫通糖タンパク質抑制性受容体である。...

こんにちは。ブラウン大学分子微生物学・免疫学部のLauren Parce研究室のStephanie Resiです。本日は、K LRG1テトラマーの作製手順について解説します。当研究室では、K LRG1のコヒーレント相互作用を研究するためにこの手法を用いています。それでは開始します。まず、適切な抗生物質を含む500 mLのTBバッファーを入れた4本のフラスコに、K LRG oneプラスミド構築物を発現する細菌を接種し、37 °Cで振盪培養します。OD600が0.6に達したとき、0.4 M IPTGを添加してT7プロモーターを介して発現を誘導し、さらに37 °Cで4時間振盪して培養します。4時間の培養後、細菌を遠心管に移し、4 °C、3000 RPMで20分間遠心分離して菌体を回収します。必要に応じて、この時点でペレットを-80°Cで凍結し、後で使用することができます。回収した細胞を30 mLの再懸濁バッファーで再懸濁します。次に、細菌の再懸濁液をポリプロピレンビーカーに入れ、合計容量が60 mLになるまでまとめます。必要に応じて、pH 8のTEバッファーを追加して全量を60 millilitersにし、ホットプレート上で攪拌機を用い、中速で混合物を攪拌します。プールしたResus懸濁液を攪拌しながら、以下の溶液を混合物に滴下します。Lysozyme、magnesium chloride、DNS 1、TRITTON X 100、そして最後にDTTを加えます。超音波コンバーターを備えたフィッシャー解体装置を用い、振幅30%で溶液を超遠心管に移します。氷上で1.5分間ソニケーションを行い、その後、溶解物を4°Cで5,000 RPMで10分間遠心分離します。上清を捨て、15 millilitersの洗浄バッファーを加えます。ペレットが完全に再懸濁するまで前述のソニケーションを繰り返し、遠心分離を再度行います。この洗浄、ソニケーション、ペレット形成のステップを5回繰り返します。最後に、Triton X 100を含まない洗浄バッファーを用いてペレットを再懸濁します。もう一度遠心分離を行い、4 mLのTEバッファーで再懸濁します。これでインクルージョンボディ（封入体）の調製が完了です。封入体を湿重量で定量します。封入体のスラリーは、30〜100 mg/mL 濃度のバッファーストック中、4 °C で保存することが可能です。封入体の準備が整いましたら、リフォールディングの準備に移行します。リフォールディング緩衝液を1Lの新鮮なボトルに調製し、4°Cで低速で攪拌して冷却することから、リフォールディング手順を開始します。次に、リフォールディング緩衝液に注入するための封入体溶液を7回分準備します。まず、最終容量1.4mLの7Mグアニジン塩酸塩および10mM 2-メルカプトエタノールを含むマイクロ遠心チューブに封入体スラリーのストックを入れ、37°Cのウォーターバスで30〜40分間溶解させます。5分ごとにボルテックス処理を行います。スラリーが透明になれば、溶解が完了したことになります。融解した混合物を、4 °Cのマイクロ遠心機で最大速度で30分間遠心分離します。その後、小さな黒っぽいペレットを回収しないように注意しながら、上清を15 mL遠心チューブに移します。注入用に、インジェクションバッファーで液量を7 mLに調整します。まず、フォールディング混合物の攪拌速度を「高」に上げます。次に、希釈した封入体 1 mLを添加します。1滴ずつ、各滴の間に2秒の間隔を空けて滴下します。希釈した封入体を一度に1 mLずつ添加し、注入の間には1時間の時間を空けてください。攪拌速度を低速に戻します。4 °Cで低速で一晩撹拌を続けます。これでタンパク質を濃縮および精製できる状態になります。リフォールディングしたKLRG1四量体の濃縮を開始します。まず、22 µmのフィルターを用いて反応液を事前ろ過します。次に、製造元の指示に従い、Millipore Amicon攪拌セルと分画分子量10 kDaの限外ろ過膜を用いて、反応液を1 Lから約10 mLまで濃縮します。その後、Milliporeの分画分子量10 kDa限外ろ過膜を用いて、さらに2 mL以下まで濃縮します。メーカーの指示に従ってクロマトグラフィーシステムをセットアップしてください。本手法では、高分解能カラムを用い、4°CでGE healthcare ACTA高速プロテイン液体クロマトグラフィーシステムを使用します。20 mM HEPESおよび150 mM NaClを含む緩衝液を用い、サイズ排除クロマトグラフィーによってK lrgのモノマー形態を精製します。注入量は、カラムの全ゲル容量の2%未満にする必要があります。同様に、Millipore社の10 kilodalton分子量分画限度超ろ過膜を用い、製造元の指示に従ってKLG 1モノマーを最終容量1 mLまでさらに濃縮します。その後、前述と同様にサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製し、遊離ビオチンを除去してテトラマーを得ます。KL LRG oneモノマーを、4倍モル過剰のFICO rine結合ストレプトアビジンテトラマーと混合します。これにより、受容体リガンドの標識が可能です。このグラフは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いてリフォールドしたK lrg oneタンパク質を分離させた際の陽性結果を左から右へ示しています。ピークは、K LRG oneのマルチマー、ダイマー、およびモノマーの形態を表しています。一番右のピークはバッファー交換を示しています。リフォールディング条件はタンパク質ごとに経験的に検討する必要がありますが、他のC型レクチン受容体も同様のプロトコルでテトラマー化できるはずであり、これにより他のリガンドを同定できる可能性があります。以上の手順により、KLRG1テトラマーを生成する方法を説明しました。誘導レベルを確認し、リフォールディング条件を厳守することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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