組織学、組織形態計測および蛍光色素分析のためのUndecalcified骨の準備

脱灰骨組織学は、骨の無機成分と細胞成分の両方を示す骨の微細構造を明らかにし、骨代謝回転や骨形成および骨吸収に関する極めて重要な情報を提供します。これは、さまざまな臨床および研究用途において非常に重要です。また、美しい画像が得られるため、蛍光評価や組織計測法などの手法を用いることが可能です。

石灰化骨組織の組織学的解析は、特に大型の検体において技術的な困難が伴います。このビデオでは、石灰化骨の下面切片を作成する際の技術的な問題点と、それを克服するための手法を実演します。なお、これらの切片を用いた組織形態計測学的な評価については扱いません。

これについては、以下の重要な出版物を参照してください。このビデオでは、組織採取後の検体調製と固定処理、研磨および切断による包埋・切片作成、スライド作成、および染色の工程について解説します。検体について説明します。

本ケースでは、羊の頸椎を10%リン酸緩衝液を含む密閉された不透明な容器に入れます。フルオロクローム解析を行う場合は、光への露出を最小限に抑える必要があります。フルオロクロームは光に敏感であるため、その後検体を研究室に運び、固定性を向上させ、ブロックに適合するようにサイズを調整するためのトリミングを行います。

この時点で、ブロックを正しい平面で作成するために、スライド上の組織の向きを把握しておく必要があります。安全確保は非常に重要であり、刃に手が触れないように器具を使用してください。これで、目的の領域が適切なサイズにトリミングされました。

次に、組織の損失を抑えるため、より小型のバンドソーを用いて最終的なトリミングを行います。ブロックを規定のサイズに切断した後、固定を完了させるために、新鮮な固定液を入れた密閉された不透明な容器に封入します。容器の容量は、検体のサイズの約10倍にする必要があります。

十分な固定を行うため、検体はそのサイズに応じて1週間から2週間の間、定式および溶液に浸漬させ、その後70%Ethanolに移します。ブロックのサイズが大きく、骨の透過性が低いため溶媒の拡散が遅くなることから、その後の処理は緩徐に行います。次いで、エタノールの濃度を段階的に上げて脱水を行い、ブタノールで透徹させます。検体は遮光し、常に撹拌した状態で保持します。

各溶液に約1週間ずつ浸すことを推奨します。したがって、処理には約4〜6週間かかります。切片の最終的な品質を損なうため、急いで処理しないでください。

石灰化した骨に対しては、さまざまな包埋オプションが利用可能です。樹脂またはメタクリレートの選択は、どのような試験を行うかによって決まります。例えば、免疫組織化学染色はすべての樹脂で可能なわけではありません。

エポキシ樹脂は硬化にUV光を必要とするため、蛍光色素分析に干渉します。慎重に選択する前に、製造元の仕様書を確認することをお勧めします。本手法では、光学顕微鏡観察および蛍光色素分析に適した良好な切片および研磨切片が得られ、かつ費用対効果の高いTEVI 7, 100を使用しています。

包埋における重要な検討事項は、骨の密度と包埋剤の密度を密接に一致させる必要があることです。これは、その後のブロック切削、特にマイクロトムによる薄切片作成において非常に重要です。混合液は製造元の指示に従って調製し、激しく振とうします。プロトコルを最適化するために、少数のサンプルを用いて予備的な包埋を行う価値があります。

パラフィンとは異なり、これは不可逆的な工程です。ブロックの切削面を下にして型に配置します。型はブロックよりも大きくし、支持力と強度を確保します。

メタクリレートを骨に最大限に浸透させるため、メタクリレートの浸潤はゆっくりと行う必要があります。ここでも、光への露出は最小限に抑えてください。浸潤液を1週間使用した後、浸潤液を交換し、硬化液を加えます。

次に、バッキングプレートを作製します。ここではtevit 30 40を使用します。その後、型を剥がすと、ブロックの準備が完了します。

研磨切片作成により、厚さ 20 から 50 µm のより厚い切片を作製できます。厚い切片ほど蛍光強度が強くなるため、蛍光分析に有用です。研磨切片を作製するにはマイクロトームが必要であり、ダイヤモンドナイフの使用が推奨されます。本手法では、0.6 mm の曲面ダイヤモンドナイフを使用します。

潤滑剤が不可欠です。シリコンベースの潤滑剤でも十分に使用可能ですが、石油系潤滑剤を推奨します。その後、ブロックをクランプに固定します。

マクロカッターに固定し、ブロックを刃の方へ進めます。最初のセクションで切削面を出し、セクションの向きを調整します。この最初のセクションは廃棄してください。

研磨は時間がかかる工程であるため、急いではいけません。切片を研磨する際は、十分な潤滑を確保してください。その後、スライドガラス上に配置します。

必要に応じて洗浄および研磨を行います。切片は丸まりやすいため、サンドイッチバッグの一部を被せ、別のスライドガラスで挟んで平らに固定することを推奨します。

その後、60〜80°Cのインキュベーターに1時間置きます。これによりメタクリレートが軟化し、切片がスライドに平坦に密着します。ここでは、1ヶ月間隔で注入された3種類の異なる蛍光色素の合成蛍光画像を示します。

これにより、特定の時点における石灰化部位の特定が可能になります。これらのラベルの投与量および調製方法は、本文に記載されています。マイクロトムで作成した薄切片は、光学顕微鏡での観察に最適です。

これは技術的に困難なプロセスです。これらの硬いブロックを切断するために必要な強度を確保できるよう、スレッジマイクロトームの使用を推奨します。タングステンカーバイド刃を含む、さまざまな種類の刃を使用することが可能です。

ただし、必要に応じて容易かつ頻繁に研ぎ直すことができるため、ステンレス製の刃を推奨します。刃は、ブロックに対して45度の角度になるように配置してください。メタクリレートの密度は、室内の周囲湿度を含む多くの要因に影響されます。

したがって、ブロックは乾燥した状態で保存する必要があります。必要に応じて、ブロックに濡らしたろ紙を当てて軟化させることができます。質の高い切片を得るための適切な切断条件にするまで、数枚の切片を作成する必要がある場合があります。その後、切片をインキュベーターに入れる前に、サンドイッチバッグと追加のスライドで挟み込み、切片を平坦にします。

染色は標準的なパラフィン包埋組織学と同様ですが、当然ながら脱パラフィン工程は不要です。骨に使用される一般的な染色法には、サフラン対比染色のVSA、サフラン、ol light green、およびmass on golden as trioneがあります。これらのプロトコルについては、本文中で言及されています。

試薬は使用前に選別およびろ過を行います。Golden染色液は、組織光学測定に頻繁に使用されます。まずテストスライドを用いて染色の最適化を行うことを推奨します。

各ステップの後、顕微鏡でスライドを観察し、適切な染色がなされているかを確認します。これにより、各成分染色の適切な時間を決定することが可能になります。染色基準が最適化されたら、染色のばらつきが熱幾何学的な解析に影響を与えるのを防ぐため、実験に使用するすべてのスライドをラックに入れ、同一のプロトコルで同時に染色します。

その後、スライドを標準的な方法でカバーガラスで封入します。実験の成功をお祈りいたします。