Name: 気道抵抗測定とマウスにおける気管支肺胞洗浄液のサンプリングのためのリバーシブル、非侵襲的方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶマウスの経口挿管法による気道過敏性測定と気管支肺胞洗浄液サンプリングの反復可能な手法。呼吸器生理学研究における炎症細胞解析と気道応答評価に有用です。

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我々は、光ファイバー経口気管内挿管を行うために提案のために博士W. Mintzerに感謝。国立衛生研究所からの補助金U19AI070973、R01AI057696、K02HL75243、およびR01HL082487によってサポートされています。

<ol><li>Hamelmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+measurement+of+airway+responsiveness+in+allergic+mice+using+barometric+plethysmography%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156, 766-775 (1997).</li>
<li>Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestrained+plethysmography+is+an+unreliable+measure+of+airway+responsiveness+in+BALB%2Fc+and+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice.</a> J. Appl. Physiol. 97, 286-292 (2004).</li>
<li>Bates, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+and+misuse+of+penh+in+animal+models+of+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The use and misuse of penh in animal models of lung disease.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 373-374 (2004).</li>
<li>Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reevaluation+of+the+validity+of+unrestrained+plethysmography+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice.</a> J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).</li>
<li>Grunig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+IL-13+independently+of+IL-4+in+experimental+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma.</a> Science. 282, 2261-2263 (1998).</li>
<li>Corry, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+allergen-induced+airway+hyperreactivity+in+T+and+B+cell-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Requirements for allergen-induced airway hyperreactivity in T and B cell-deficient mice.</a> Mol. Med. 4, 344-355 (1998).</li>
<li>Corry, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4%2C+but+not+interleukin+5+or+eosinophils%2C+is+required+in+a+murine+model+of+acute+airway+hyperreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4, but not interleukin 5 or eosinophils, is required in a murine model of acute airway hyperreactivity.</a> J. Exp. Med. 183, 109-117 (1996).</li>
<li>Amdur, M. O., Mead, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+respiration+in+unanesthetized+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanics of respiration in unanesthetized guinea pigs.</a> Am J Physiol. 192, 364-368 (1958).</li>
</ol>

喘息、その他様々な気道閉塞性疾患の研究は、生物医学研究の積極的で拡大しつつある分野を構成している。喘息関連の実験的研究の重要なコンポーネントは、様々な条件の下気道の大きさの変化を測定する能力です。挑発的なチャレンジへの応答の過度の気道狭窄、喘息と関連肺疾患と気道と呼ばれる気道過敏性のプロパティの標準的な機能は、呼吸や死を含む他の症状は、息切れにつながる臨床的に重大な攻撃の主要なコンポーネントです。 本研究では、新規な方法は、気道過敏性を測定し、同時にマウスの気道に動員炎症細胞をサンプリングするために開発されました。我々は、気道過敏性がすぐに最初の、あるいは15日間与えられた課題を7つの連続アレルゲンの、最初のいくつかの後に誘導されていないことを示している。むしろ、気道過敏性は、わずか6の課題（12日）の後に（偽のアレルゲンチャレンジ動物と比較して）非常に重要ななって、進歩的なアレルゲンのチャレンジでのみ徐々に増加する。気道生理学のこの顕著な変化は、ほぼ第一第五アレルゲンチャレンジ後の大量の気道洗浄液（&gt; 10 6個 / ml）で表示される好酸球、によっ...

気道生理計測ソフトウェア（Rescompは）（; 415-519-4371ミレニアムプレミアグループ）カスタム調製した。 データは、Pentium III CPU（インテル社サンタクララ、カリフォルニア州）とデジタル信号の変換器（ナショナルインスツルメンツ、＃PC - LPM16）〜17ピンアナログを搭載したWindows XPを実行しているPCのワークステーションを用いて解析した。 小動物の気道生理学のワークステーションは、市販の圧力トランスデューサ（部分＃TRD5700とTRD4510）、プリアンプのモジュール（部品＃MAX2270）、シャーシ（パート＃MAX1320を使用して（ミレニアムプレミアグループ）組み立てカスタムでした。Buxco、（株）ウィルミントン、NCからのすべての）とカスタマイズされた小動物のプレチスモグラフ。 光源（コールパーマーイルミネーター、41722シリーズ）に接続さ0.5ミリメートル、外径の光ファイバのスレッド、 人工呼吸器（ハーバード装置マウス人工呼吸器、＃687） 10ミリメートル、27ga針（BD Biosciences社、カタログ番号309602） 熱ランプ 1mlのシリンジ（BD Biosciences社、カタログ番号305109） 4クランプ（ポニー3200スプリングクランプ） 挿管のガイドは0.5mm単位の外部ワイヤ 血球計 Superfrost /プラス顕微鏡スライド（Fisherの猫。無し。12-550-15） シャンドンフィルタカード（サーモカタログ番号5991022） 染色差の細胞のスライド（フィッシャーカタログ番号122911） 光学顕微鏡（ライカ） サイトスピン3（シャンドン） 20 GA、1.25インチProtectIV静脈カテーテル（スミスメディカル） 0.5ミリメートルポリマー光ファイバ（エドモンドオプティクス＃NT02 - 532）。

気道抵抗測定とマウスにおける気管支肺胞洗浄液のサンプリングのためのリバーシブル、非侵襲的方法

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

気道過敏性（AHR）の測定と気管支肺胞洗浄（BAL）液のサンプリングは、実験的喘息モデルには不可欠ですが、同じ動物でそのような測定値を得るための手順を繰り返して、一般的には不可能です。ここで、我々は、マウスからAHRおよび気管支肺胞洗浄液のサンプルの繰り返し測定を得るためのプロトコルを示す。マウスは、治療を受けた強力なアレルゲンまたは偽で14日間鼻腔内に七回チャレンジした。最初の挑戦に先立ち、および各鼻腔内チャレンジ後24時間以内に、同じ動物では経口挿管と人工呼吸器、麻酔をかけた。偽とアレルゲン不自由な動物の間にアセチルコリン（ACH）塩化物の静脈内投与量を​​増やすことによって誘発される呼吸器系の抵抗（RR）の用量反応曲線を比較することによって評価AHRは、決定した。気道細胞の差列挙を行うことができるように、その後、同じ挿管を経由して、左肺はlavagedした。これらの研究は、AHRとBAL液中のコレクションの繰り返し測定は、同じ動物から可能であることを明らかにし、その最大の気道過敏性と気道好酸球増加は、アレルゲンのチャレンジを開始の7〜10日以内に達成されています。この小説の技法が大幅に長手方向の実験に必要なマウスの数を削減し、多様なげっ歯類、疾患モデルと気道生理学機器に適用可能である。

げっ歯類の呼吸の生理学と気道炎症細胞のサンプリングの繰り返し測定が望ましいですが、一般的には不可能。ここでは、気道過敏性と気道炎症細胞のサンプリングの繰り返し測定を可能に経口挿管マウスの反復可能な方法を説明します。

気道過敏性（AHR）の測定および気管支肺胞洗浄（BAL）液の採取は、実験的喘息モデルにおいて不可欠であるが、繰り返しの...

この手順を開始する前に、マウスにtiletamineを腹腔内投与して麻酔をかけます。その後、動物を台の上に置き、20ゲージのカテーテルを口経由で気管に挿入します。挿管したマウスを人工呼吸器に接続し、尾静脈に静脈ラインを確保します。その後、マウスを2つの圧力トランスデューサーに接続されたげっ歯類用SIGGRAPHに封入します。この電子装置により、アセチルコリン負荷中の呼吸器系抵抗の連続測定が可能になります。人工呼吸器と静脈ラインを外した後、気管カテーテルを左肺まで進め、カテーテルを通じて注入および回収する生理食塩水による肺洗浄を行います。こんにちは。ベイラー医科大学医学部のSimone Pharです。本日は、気道力学の測定および気管支肺胞洗浄液（BALF）の繰り返し採取を可能にする、マウスの経口挿管法について解説します。私たちはこの手順を、喘息の実験モデルである実験的アレルギー性疾患の研究に利用していますが、本手法は他の用途にも応用可能です。それでは、手順を開始します。まず、マウスにketamine 48 mg/kgを腹腔内投与し、深く麻酔させます。その後、マウスを落ち着かせるため、柔らかい光が当たったボックスの中に配置します。この目的には、布のドレープで覆った清潔なマウスケージを使用できます。5～10分後、つま先への刺激で動物が完全に麻酔状態にあることを確認し、仰向けの状態にします。45度の角度に調整した小さなテーブルの上に腹側を上にして置きます。被験者を固定するため、上顎の歯列の後方でテーブルを囲むようにゴムバンドENCを挿入します。右手でマウスを温めるために、ヒートランプを使用してください。ピンセットで舌を掴んで口から引き出し、伸ばします。次に、左手で持った金属製の舌圧子をゆっくりと挿入します。これにより、気道が確保され、挿管のための声帯の視認が可能になります。次に、光源に接続された直径0.8 mmの光ファイバースレッドをアンギオカテーテルに通し、先端から10 mm突き出すように伸ばします。左手でディプレッサー（舌圧子）を保持しながら、右手で光ファイバースレッドの発光端を口腔および咽頭経由で誘導し、声帯が視認できるまで進めます。次に、直接視認しながら、声帯が最大に開いたタイミングに合わせて、ファイバー光ファイバスレッドを動いている声帯を通過させ、気管内に挿入します。次に、アンギオカテーテルを光ファイバスレッドに沿わせて気管内に挿入し、カテーテルの先端が気管の中間に位置するようにします。17～22 gのマウスの場合、これは口の外に10 mmのカテーテル部分が残る状態に相当します。挿管が成功したことを確認するため、ファイバーオプティック糸を抜き取ります。親指でコネクターを閉塞させた直後に規則的な深呼吸が停止することを確認してください。プレチスモグラフのテーブルをワークベンチと平行になるまで下げ、被験者を180度回転させて、空気ベンチレーターポートに向かせます。人工呼吸器に接続する前に、動物を側臥位にします。気密性の高い接続を確保し、人工呼吸器を作動させます。その後、腹壁の上下動が人工呼吸器のペースと同期していることが確認できれば、挿管が成功したことになります。静脈ライン用の針を準備するには、10 mmの27ゲージ針をシリンジコネクタから取り外し、ベベルが角度の内側に向くように、中点を90度に曲げます。ベベルのない端を、IV注入ポートに通じるPE 10チューブに接続します。これは、致命的となる可能性のある空気塞栓を防ぐためです。1 mLシリンジを用いて、37 °Cの0.9%塩化ナトリウムでチューブと針をパージします。注入ポートは、15 mL遠心チューブのキャップに開けた穴に27ゲージの針を差し込んだ構造になっています。キャップ内は生理食塩水で満たされており、針先が常に浸っているため、空気が針に混入して静脈内に注入される可能性を低減しています。針を尾の先端に合わせます。側脈に対して平行かつその真上に配置してください。針を誘導しながら、皮膚のわずか下に沿って進めます。静脈の走行に沿って頭側へ進み、屈曲部に向かって皮下へ押し込みます。IV（静脈内）への留置が成功したことを確認するため、シリンジのプランジャーをわずかに引きます。IVチューブに血液が逆流してくるはずです。さらに、尾静脈に 50 to 100 µL の生理食塩水を注入した際に、IVラインを通じて妨げなく流れることを確認してください。セットアップからヒートランプを取り外した後、被験体をプラスモグラフに入れ、4つのクランプを用いて気密に固定します。プラスモグラフチャンバー内の空気が加熱され、その後の呼吸器系抵抗（RRS）の測定値が変動する可能性があるため、ヒートランプを取り外すことが重要です。呼吸器系抵抗（RRS）は、商の連続的な定量によって決定されます。等しい肺容量における、気流に対する気道圧の変化、またはdelta P over Vを測定します。Delta Pは、気管血管カテーテルVに接続された圧力トランスデューサを用いて決定します。時間経過に伴うプラズマグラフト体積の微分は、プリアンプモジュールによって計算されます。安定したベースラインを確立した後、RRSは、静脈内（iv）に、濃度を段階的に高めたアセチルコリンクロリド（またはCH）を1秒ごとに5回連続で投与します。気道抵抗が200%増加するまで、RRSがベースラインに戻るたびに次の一回投与を行います。尾静脈からIVを抜き、マウスを人工呼吸器から切り離します。気管カニューレを留置して気道を確保したまま、マウスが自発呼吸を再開したことを確認してください。そうでない場合は、胸部を優しくマッサージすることで呼吸を促します。マウスが自発呼吸を再開したら、気管カニューレを挿入したまま、100%酸素でパージし、ヒートランプで37 °Cに維持されたチャンバーに移動させます。アセチルコリン誘発性の過剰唾液分泌による窒息死を防ぐため、動物が覚醒するまで気管カニューレを留置しておく必要があります。気管支肺胞洗浄（BAL）液は、マウスの嘔吐反射が十分に回復した後にのみ採取できます。これは通常、回復チャンバーでの待機から約20分後に起こります。嘔吐反射を確認するには、アンギオカテーテルをゆっくりと前後にスライドさせます。明らかな咳や抵抗が見られれば、嘔吐反射が戻ったことを示しており、BAL液を採取できます。肺の左葉に向けた約30度の連続的な曲げ加工が施された金属製挿管ガイドワイヤーを、アンギオカテーテル内に挿入します。Gワイヤーとアンギオカテーテルを同時に肺の左葉まで進め、カテーテルハブの突出部が前歯から1 mmだけ外に出るようにします。Gワイヤーの先端がアンギオカテーテルの開口端を通り抜けないように注意してください。アンギオカテーテルを留置したまま気管の裂傷や破裂を防ぐため、1 mLシリンジを用いて、プランジャーを引き上げた直後に300 µLの滅菌PBS (pH 7.4)を左肺に注入します。陰圧を生じさせるため、肺を強くマッサージしながら、アンギオカテーテルをゆっくりと抜去します。100～200 µLのBAL回収量が見込まれます。洗浄後のマウスを直ちに37 °C、100%酸素のチャンバーに戻してください。動物を左側臥位にし、約20分かけて完全に回復するまで待機した後、ケージに戻します。ここでは、気道抵抗測定の代表的な結果を示します。気道過剰反応性は、4回目の投与における5回の抗原チャレンジ後のアセチルコリン投与量において、ナイーブ値よりも有意に高いRRS値として定義されます。なお、6回目のチャレンジ後にはさらに強い気道過剰反応性が認められましたが、反応性のさらなる上昇は見られませんでした。7回目のチャレンジにおいて、RRS値がベースライン値の3倍に達した時点でCHの投与を停止した。それ以上の投与量の増加は、致死的な気管支痙攣を引き起こすためである。vehicleを鼻腔内投与で繰り返しチャレンジしたマウスでは気道過剰反応が発現せず、またCHをどの用量で投与した場合でも、RRSの測定値はベースライン値から有意に変動しなかった。これは、naiveマウスおよび、強固なAHRが出現する前に連続的にCHをIV投与したアレルゲン6回チャレンジマウスからの、代表的なリアルタイムRRSトレースによって示されている。アレルゲンによって誘導された気道の主要な細胞型は、AHRの傾向と同様に好中球であった。しかし、アレルゲンチャレンジを繰り返すにつれて好酸球浸潤が徐々に強まり、好酸球がBAL液中で数的に優位な細胞型となった。これは、好中球数が著しく減少した6回目のチャレンジ後であった。PBSを投与したコントロール群のマウスにおいて、気道抵抗の測定値も時間経過に伴い有意な変動は見られませんでした。また、これらのマウスでは、反復的なBAL液採取のみを行ったマウスで観察された変化と同様に、好中球およびマクロファージのBAL液への浸潤は増強しましたが、好酸球の浸潤は認められませんでした。マウスの経口挿管および抜管の手順、ならびに気道生理学的データと気管支肺胞洗浄液を回収するための静脈ラインへのアクセス方法について説明しました。これらの手法を生体動物に適用する前に、死骸標本を用いて各手法を個別に練習し、習熟させることが不可欠です。厳格かつ丁寧な取り扱いが不可欠であり、常に厳格な無菌操作を行う必要があります。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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