Name: 好中球細胞外トラップ：それらを生成して可視化する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: 学ぶ 好中球細胞外トラップ（NETs）の生成と可視化手法。ヒト血液から好中球を分離し、化学的・生物学的刺激でNETsを誘導し、免疫蛍光法と走査型電子顕微鏡で観察する方法を解説。

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1。ヒト血液からPMN分離抗凝固剤としてEDTAまたはヘパリン（10 U / ml）で約24ミリリットルのヒトの血液を使用してください。 <ol><li> 15ミリリットルファルコンチューブに6ミリリットルHistopaque 1119を追加し、慎重にレイヤ上に5〜7ミリリットルの全血。 </li><li>ブレーキなしで800 × gで20分間遠心する。 </li><li>吸引して廃棄黄色と透明な上部層を、新鮮なファルコンチューブに顆粒球を含む低赤相を転送する。 </li><li> 300 × gで10分間PBSと遠心機でファルコンチューブを充填することにより細胞を洗浄</li><li>その間に2ミリリットル10倍PBSで18 mlのパーコールを混合して100％のパーコール溶液を調製。 1X PBSは85％、80％、75％、70％、65％パーコール4mlの溶液を調製して。 </li><li>降順で互いの上にすべての割合のレイヤー2ミリリットルでPercoll勾配で2ファルコンチューブを準備します。 </li><li>遠心分離上清を除去した後、PBS 4 mlでペレットを再懸濁します沈降した細胞を組み合わせる。 </li><li>グラデーションの各上に再懸濁の慎重にレイヤ2ミリリットル。 </li><li>ブレーキなしで800 × gで20分間遠心する。 </li><li>遠心分離後に末梢血単核細胞でトップ層は65％層の大部分を削除し、新たなファルコンチューブに85％層まで、白残りinterphasesを収集する。 </li><li> PBSと300 × gで10分間、遠心分離でファルコンチューブを充填することにより細胞を洗浄</li><li> PBSの2ミリリットルで上清と再懸沈殿細胞を（通常&gt; 95％がPMNいる）を取り外します。 </li><li>血球計算板を用いて細胞を数える。 </li></ol> 2。アクティベーションPMNは<ol><li>各ウェルに滅菌した13ミリメートル円形のガラスカバースリップ（＃1,5）を置くことによって、24ウェル細胞培養プレートを準備します。 </li><li>シード2ウェルあたり500μLRPMIで× 10 5細胞（ヒト血清アルブミン2％を含む）と37℃CO 2インキュベーターで1時間インキュベート℃に</li><li>一方RPMIに600 nMのPMA溶液を調製し、ウェルあたり100μlの細胞に加える。 37℃までCO 2インキュベーター内で4時間まで15分のインキュベート℃まで</li><li> PBSに溶解した4％（最終濃度）パラホルムアルデヒドで細胞を固定する。 </li></ol> PMAは、ポジティブコントロールとして機能し、これまでNET形成を誘導するための最も強力なエージェントです。また、病原体と他​​の刺激または共培養は、NET誘導に使用することができます。 追加のパラレルサンプルが用意されている場合、時間の経過は、進行している間、NET形成のそれぞれの状態を確認することができます。 SYTOXグリーン（Invitrogen社）のような非透過性のDNA色素は非固定細胞に添加されている場合は、唯一の細胞外DNAが検出されます。新しいネットの形成以来、何らかの形で、各時点ごとに1つのパラレルサンプルを使用する必要がある、SYTOXの存在下で低下している。 3。免疫標識NETの検出ネットがさらに固定後に非常に壊れやすく、大半が準備中に迷子になるそうでなければ、細心の注意を払って操作する必要があります。 <ol><li>慎重にカーブした針で端にそれを持ち上げて、24ウェル培養プレートから添付された細胞とガラスカバースリップを削除し、微細な鉗子でそれをつかむ。 PBSのドロップに逆さまにカバースリップを置く。これは、試験管のスタンドを覆うパラフィルムシートで行うことができます。このような5分間3回洗浄する。 </li><li>トリトンX - 100室温で1分間、細胞を透過性に0.5％の低下で同じようにカバースリップをインキュベートする。 1分間PBSで3回洗浄する。 </li><li>パラフィルムやウェットティッシュで湿度の高い部屋を準備します。カバーは​​、ブロッキングバッファー（5％ロバ血清）のドロップに逆さま伝票はレイと37℃で30分間インキュベート℃に</li><li>ブロッキングバッファーで一次抗体、例えば、MS抗ヒストンとRB抗好中球エラスターゼを、希釈する。 </li><li>一次抗体の低下にブロッキングバッファーから直接湿度の高い部屋でスリップをカバーし、37℃で1時間インキュベート転送℃に</li><li> PBSで5分間3回洗浄する。 </li><li>二次抗体、例えばDKアンチMS Cy2とし、ブロッキング緩衝液でDK抗RBのCy3を、希釈する。 </li><li> 37℃で1時間二次抗体とインキュベートのドロップ℃の上に湿潤なチャンバにカバースリップを転送する</li><li> PBSで5分間3回洗浄する。染色DNAはUV励起または遠赤色励起のためのDRAQ5とを必要とdistで二回洗うヘキスト33342（1μg/ mlの）のいずれかで5分間、あなたの蛍光顕微鏡のオプションによって異なります。水。 </li><li>スライドガラス上にMowiolの20μlのドロップを設定し、逆さまに細胞をカバースリップをマウントします。細胞がカバーガラスとスライドの間にあることがあります。 Mowiolのドロップは、カバースリップがドロップで配置される均質な厚さの薄層を形成することになる。通常は、サンプルを押す必要はありません。あなたが非液浸レンズを使用する場合、試料は、検査の準備ができています。液浸レンズと顕微鏡分析のために、Mowiolは、サンプルの端に固化するまで約1時間のための試料は乾燥させて。 </li></ol> 4。走査型電子顕微鏡のための準備NETS（SEM） <ol><li> 2,5％のグルタルアルデヒドで24ウェルプレートにガラスカバースリップ上に細胞を固定ポスト。 </li><li> 24ウェル培養プレートから細胞を含むガラスカバースリップを外し、水滴に逆さまに置く。このような5分間3回洗浄する。 </li><li> 30分間0.5％OsO4とインキュベートを含む24ウェル細胞培養プレートに戻してカバースリップを転送します。 </li><li> 24ウェル培養プレートから細胞を含むガラスカバースリップを外し、水滴に逆さまに置く。このような5分間3回洗浄する。 </li><li>バック30分で1％タンニン酸とインキュベートを含む24ウェル細胞培養プレートにカバースリップを転送する。 </li><li>繰り返しのステップ4.2から4.4 </li><li>以下のレジメン（5分ごとに）を介して脱水。 <ul><li> 30％エタノール</li><li> 50％エタノール</li><li> 70％エタノール</li><li> 80％エタノール</li><li> 90％エタノール</li><li> 100％エタノール</li><li> 100％エタノール</li><li> 100％エタノール</li></ul></li><li>臨界点乾燥機と乾燥試料中にスリップをカバー転送する。 </li><li>薄層蒸発器を使用して5nmのプラチン/カーボン層を持つ試料のコートの表面</li></ol> 5。代表的な結果： 分離方法は、通常95％より高い純度を持つ無刺激の実行可能な好中球が得られます。刺激後の異なる時点で固定したとき、免疫染色のプロトコルはNETosisの平坦化細胞、核の小葉の喪失、顆粒の消失と核（ヒストンすなわち）と粒状の（すなわちの増加重複につながる核の完全性の間に形態学的変化のシーケンスを示しています。好中球エラスターゼ）染色。このプロトコルは、好中球による病原体の特異的な相互作用を分析する出発点として利用することもできます。この相互作用は、走査型電子顕微鏡のための準備のプロトコルを使用してより詳細に解剖することができます。 NET蛍光 NETコンポーネント（青= DNA、赤=ヒストン、緑=好中球エラスターゼ）について染色刺激好中球のサンプル。画像はNETローカリゼーション、DNAとヒストンの核局在化と好中球エラスターゼのための顆粒状パターンのほかに、表示されます。 SEM PMA刺激非刺激およびPMA -刺激好中球を示す電子顕微鏡写真をスキャン。刺激後、好中球は平らにならすとネットを生成する。 SEMネットと赤痢菌 NETSの中に閉じ込め赤痢菌の高分解能SEM像。

<ol><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.</li>
<li>Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+capture+and+kill+Candida+albicans+yeast+and+hyphal+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms.</a> Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).</li>
<li>M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+amazonensis+promastigotes+induce+and+are+killed+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps.</a> PNAS. 106, 6748-6753 (2009).</li>
<li>Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase+expression+allows+the+pathogen+group+A+Streptococcus+to+escape+killing+in+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps.</a> Curr Biol. 14, 396-400 (2006).</li>
<li>Fuchs, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).</li>
<li>Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+spontaneous+apoptosis+of+neutrophil+granulocytes+by+the+intracellular+parasite+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major.</a> J Immunol. , 169-898 (2002).</li>
</ol>

提供するプロトコルでは、かなりの純度で非刺激好中球の分離、NET形成の誘導とNETosis時の形態学的変化の解析が可能になります。つまり、緩く接続されたネットのほとんどが失われます過酷な洗浄条件を避け、慎重に試料を取り扱うときは、別の刺激条件下でのNETの形成（持続時間、刺激）の量を比較することができます。好中球/病原体相互作用、刺激の順序、他の免疫細胞との相互作用：この点において、提供されているプロトコルは、より洗練されたシナリオを分析する手法を確立するための出発点として利用することもできます。

好中球細胞外トラップ：それらを生成して可視化する方法

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

好中球顆粒球は、末梢血中の白血球の最も豊富に存在するグループです。プロの食細胞として、彼ら巻き込む細菌とその抗菌顆粒はファゴソームと融合するときに細胞内にそれらを殺す。活性化により、彼らは一緒に病原体に結合する細胞外繊維を形成顆粒のタンパク質とクロマチンを解放：私たちは、その好中球が微生物を殺すの追加の方法を持っています。これらの新規な構造、または好中球細胞外トラップは（NETS）、病原性因子を低下させ、細菌1、真菌2および寄生虫3を殺す。ネットの構造骨格はDNAであり、そして彼らはDNasesの存在下で速やかに分解される。従って、DNasesを表現する細菌は、4より病原性があります。 TEM、SEM、免疫蛍光法および生細胞イメージング技術を組み合わせて相関顕微鏡を用いて、我々は、刺激によって、好中球の核は、その形状を失うとEUとヘテロクロマチンが均質化することを示している可能性があります。その後、核膜と顆粒膜は、NETコンポーネントの混合を可能に崩壊する。最後に、NETSは、細胞膜の区切りとしてリリースされています。この細胞死のプログラム（NETosis）は、アポトーシスとネクローシスとは区別され、NADPHオキシダーゼ5による活性酸素種の生成に依存する。 好中球細胞外トラップは、急性炎症のサイトで豊富です。 NETSは、バインドの微生物という、拡散を防ぐ、および病原性因子を分解し、好中球は、さらに彼らの寿命を超えて、その抗菌機能を発揮できるようにするため、病原体を殺すために抗菌剤の高い局所濃度を確保する自然免疫応答の形のように見える。証拠が高まっている、しかし、そのネットもその疾患に関与している自己免疫症候群から不妊6の範囲。 我々は、末梢ヒト血液の7から好中球顆粒球を分離し、NETSを形成するためにそれらを刺激する方法を説明します。また、我々は、光と電子顕微鏡内のネットを視覚化するプロトコルが含まれます。

好中球細胞外トラップ（NETS）は、病原性細菌、真菌、寄生虫を戦うために重要な自然免疫機構です。ここでは、ヒトの血液から好中球顆粒球を分離するやネットを形成するためにそれらを有効にする方法を説明します。我々は、光と電子顕微鏡内のネットを可視化する準備のテクニックを紹介。

好中球顆粒球は、末梢血において最も数が多い白血球群である。専門的な食細胞として、好中球は細菌を取り込み、死滅させる。

好中球細胞外トラップ（NETs）は、細胞質タンパク質と顆粒タンパク質の複合体、およびクロマチンを放出することで、好中球が病原体を捕捉するための細胞外繊維を形成し、除去するという最近同定されたメカニズムです。本ビデオでは、ヒストパット密度勾配遠心法を用いてヒト全血から顆粒球を単離します。さらに、ペリコールの勾配を用いて顆粒球調製物から好中球を単離します。カバーガラス上に播種して遠心分離し、化学的または生物学的刺激を用いてネットを形成させた後、免疫標識または電子顕微鏡を用いてネットを可視化するための処理を行います。こんにちは、マックス・プランク感染生物学研究所の顕微鏡コアファシリティのChristian Gosmanです。本日は、ヒト血液から好中球顆粒球を精製し、好中球細胞外トラップ（NETs）を生成させるための刺激を与える手順をご紹介します。次に、免疫蛍光染色および走査型電子顕微鏡を用いてNETsを可視化します。当研究室ではこの手法を用いて、NETs形成に至るメカニズムの解明や、NETsの抗菌特性の解析を行っています。それでは、始めていきましょう。このプロトコルはラミナーフローフード内で行い、4〜15 mLのFalconチューブ4本に、それぞれ6 mLのhisto 1119を分注して準備します。各チューブのhistoの上に5〜7 mLの全血を慎重に重層し、約800 ×gで20分間遠心分離します。その際、遠心終了時にブレーキがオフになるように設定してください。遠心分離後、チューブを慎重に centrifuge から取り出します。チューブ内には、上から下に向かって明確に分離した4つの層が形成されます。これらは、赤血球を含む濃赤色の層、好中球顆粒球と一部の赤血球を含む淡赤色の層、白っぽい黄色の白血球および血清を含む層、そして透明な黄色の血清層です。引き続き、層流クリーンベンチ内で作業を行います。真空システムに接続したアスピレーターを使用して、上層の黄色い層を慎重に吸引します。次に、ピペットを用いて、各チューブから顆粒球を含む赤色の相を新しいファルコンチューブに分注します。次に、チューブにPBSを満たして顆粒球を洗浄します。その後、遠心分離機を用いて約300 ×gで10分間遠心し、細胞をペレット化します。Percoll 18 mLと10倍PBS 2 mLを混合し、100% Percoll溶液を調製します。次に、100% coll溶液と1倍PBSを用いて、65%、70%、75%、80%、および85%の各coll溶液を4 mLずつ調製します。これらの溶液を用い、各溶液2 mLずつを2本のチューブに慎重に層状に重ねることで、per coreグラジエントを作成します。まず、各チューブに85%溶液を2 mLずつ分注することから始めてください。次に、85%per collの上に、80%per coを2 mL注意深く重ねます。溶液の濃度が低くなる順に、65%solutionが最上層になるまで、各溶液を2 mLずつ重ねて加えます。フード内で、遠心管から沈殿した白血球を取り出します。上清を廃棄し、細胞を1 mLのPBSで再懸濁します。次に、再懸濁した細胞を新しいチューブにまとめます。再懸濁した顆粒球2 mLを、各Percoll密度勾配の上に慎重に重層します。次に、約 800 ×g で 20 分間遠心分離し、遠心分離後にはブレーキをオフにすることを確実にします。細胞密度が最も高いため、界面がはっきりと見えるはずです。末梢血単核細胞（pBMC）を含む最上層と 65% 層の大部分を廃棄します。各勾配から65%70%界面、70%75%界面、および80%85%界面を回収し、新しいファルコンチューブに移します。チューブにPBSを満たして細胞を洗浄し、約300 ×gで10分間遠心分離して、細胞をペレット化します。上清を除去し、沈殿した多形核白血球（PMNs）を2 mLのPBSで再懸濁します。この時点で、調製物中の細胞の95%以上がmnsとなります。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を測定し、500 µLのRPMIに懸濁した200,000個の細胞を、15 mmウェルの培養プレートに配置した滅菌済みの丸型カバーガラス上に播種します。細胞をカバーガラスに接着させるため、37 °C、5% CO2インキュベーター内で1時間インキュベートします。目的の刺激剤を含むRPMIを100 µL添加します。タイムコース実験を行う場合は、各条件の刺激時間が最も長いものから順に、刺激剤を逐次的に添加してください。また、RPMIに600 nMのPMAを添加し、ポジティブコントロールを必ず準備してください。また、各条件またはタイムポイントについて、RPMIのみを添加してネガティブコントロールを準備します。刺激中の37°CのCO2インキュベーター内で最大4時間インキュベートし、NETsの形成を明視野顕微鏡を用いてモニタリングします。刺激後まもなく、核の形態が劇的に変化します。核はLOEsを消失して円形になり、その後拡大します。所定のタイムポイントで、各ウェルに室温の8%パラホルムアルデヒド溶液600 µLを添加します。最終濃度を4%にするため、免疫標識のために2〜4時間インキュベートします。直径約15 mmの穴が3×8列ある試験管ラックの上に、パラフィルムシートを敷きます。ウェルを形成させるため、ウェルにPBSを満たします。曲針を用いて、培養プレート上のパラアルデヒドからカバーガラスをそれぞれ持ち上げます。次にピンセットでカバーガラスを掴み、パラフォーム上のPBSの液滴の表面に反転させて置きます。この時点での好中球細胞外トラップは非常に脆弱であるため、細胞の脱落を防ぐため操作には細心の注意を払ってください。5分後、カバーガラスを新しいPBSの液滴に移して洗浄を繰り返します。これを計3回行います。次に、細胞を透過させるため、カバーガラスを室温の0.5% Triton X 100の液滴に1分間移します。その後、PBSで1分間ずつ3回洗浄します。付属の書面プロトコルに従って染色を進めてください。各インキュベーションおよび洗浄ステップは、カバーガラスをパラフィルム上で反転させて行います。細胞の染色が完了したら、グラススライド上にMOを20 µL滴下し、細胞がカバースリップとスライドの間に入るように、カバースリップを裏返してマウントします。1時間後、MOYが凝固し、細胞を顕微鏡解析できる状態になります。浸漬レンズを使用する場合は、化学薬品用ドラフトチャンバー内で走査電子顕微鏡用の細胞調製を行ってください。24ウェルプレート内のガラスカバースリップ上の細胞を、PBSで調製した2.5%グルタルアルデヒドを用いて30分間後固定します。インキュベーションの間、直径約15 mmの穴が3列8個開いた試験管立ての上に、パラフォームシートを置いて準備します。ウェルを作成します。ウェルに蒸留水を満たします。湾曲した針を使用して、グルタルアルデヒド溶液からカバーガラスを1枚ずつ持ち上げます。次にピンセットを用いてカバーガラスを掴み、Paraform洗浄用の蒸留水の滴に移します。この操作を計3回、各回5分間繰り返します。その後、カバーガラスを0.5%四酸化オスミウム蒸留水溶液を含む細胞培養プレートのウェルに戻し、室温で30分間インキュベートします。プレートからカバーガラスを取り出し、先ほどと同様に蒸留水で3回洗浄します。その後、各ウェルに0.5 millilitersの1%タンニン酸を入れた24ウェルプレートにカバーガラスを戻し、30分間インキュベートします。次に、カバーガラスを5分間ずつ3回洗浄します。その後、四酸化オスミウムによる固定と洗浄を繰り返します。次に、試験管に蓋をします。新しいパラフィルムで密封してください。30, 50, 70, 80, 90, 100%の各エタノール溶液を用いて、それぞれ5分間ずつ連続的にインキュベートし、細胞を脱水します。最後に、もう一度100% ethanolで処理します。エタノールを満たした標本用ボートにラックを浸します。標本が乾燥しないように注意しながら、カバーガラスを迅速に金属ラックに配置してください。次に、試料ボートを冷却した臨界点乾燥機（CPD）に移します。CPDのチャンバーに液体CO2を満たします。液面を維持するためにインレットバルブを全開にし、チャンバー底部のCO2相の下にエタノール相が見え次第、底部のドレインバルブを開きます。エタノールの大部分を除去します。チャンバー内を約30分間フラッシュさせてください。フラッシュ後、入口バルブを閉じ、液面をボートの上端の直下まで下げます。CPDのジャケットに温水を流します。温度が36～38°Cに達し、圧力が1,200 pounds per square inchまで上昇すると、液相と気相の境界線が消失し、試料が臨界点を超えます。臨界点に達したら、5分間かけてゆっくりとガスを排気してください。結露を防ぐため、温度は40 °C前後に維持してください。この間にドアを開け、ボートを取り出します。脱水溶媒が蒸発したことを確認してください。カバーガラスの表面を上にしてアルミニウム製試料ホルダーの粘着面に貼り付け、高解像度コーティングシステムに導入します。コーティングシリンダー内を 2 × 10⁻⁵ mbar まで真空排気します。次に、装置を 1.8 kV、70 mA に設定し、水晶振動子膜厚計でプラチナカーボン層の厚さをモニターし、層が 5 nm に達するまでコーティングを行います。高解像度コーティングシステムのコーティングシリンダーをベントします。次に、ピンセットを用いてコーターからサンプルを取り出します。SEMのチャンバーを大気圧に戻します。ドアを開けます。次に、試料を試料ホルダーに挿入し、チャンバー内を真空にします。SEM分析用です。刺激後の異なる時間経過で固定することで、免疫蛍光顕微鏡によりNETosis中の形態変化を観察することができます。この図では、DNAが青色で、ヒストンDNA複合体および好中球エラスターゼが赤色で示されています。NETosisの第一相では、顆粒マーカーは緑色で示され、凝縮した核の核周縁部のみに認められます。その後、クロマチンがさらに脱凝縮すると、脱凝縮したネットの核の大部分が染色されます。染色は均一です。この一連の画像は、NETosisに伴って起こる核染色と顆粒染色の重複について詳細に示しています。この走査電子顕微鏡写真には、刺激前の好中球が示されており、Ella細菌による刺激後、好中球は扁平化し、好中球細胞外トラップ（NETs）を形成します。ここでは、細菌がNETsに捕捉されている様子が示されています。ゲルのような細菌は、ネットに存在する酵素によって固定され、死滅します。ここまで、ヒト血液から好中球顆粒球を単離し、それらを刺激して好中球細胞外トラップ（NETs）の形成を誘導する方法について説明しました。これらはその後、免疫蛍光染色や走査電子顕微鏡を用いてさらに解析することが可能です。この手順を行う際は、固定後であってもネット（網状構造）が非常に壊れやすいことに留意することが重要です。ネットの損失を最小限に抑えるため、ウェル腔から刺激した好中球が載ったカバーガラスを取り出し、手順の大部分をバッファー滴の表面上で行います。その場合でも、標本を穏やかに、ゆっくりと移動させることが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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