昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ

このビデオでは、ショウジョウバエ、メラノガスター、そしてひどくガンビアに準備された匂い物質を紙片にピペットで移し、牧草地のピペットに挿入する方法を説明しています。嗅覚器官を固定するために生きた昆虫が取り付けられています。昆虫を顕微鏡下に入れ、参照電極を昆虫の眼に挿入します。

次に、記録電極を嗅覚センターに挿入します。ピペットからセンタムに臭いが吹き込まれ、ニューロンの活動が記録されます。こんにちは、私はロックフェラー大学のサル研究所のレスリー・ヴァサル、そして同じくヴァサル研究所のマリザ・ペレグリーノです。

そして、私はから、今日は、酢フライ食道メラノガスター、およびマラリア蚊とナイガンビの嗅覚ニューロンから記録する手順をお見せします。私たちの研究室では、この手順を使用して、センサーの匂いが昆虫でどのように機能するか、およびニューロンが揮発性化学物質にどのように応答するかを研究しています。それでは始めましょう。

この手順は、記録に使用する電極を研ぐことから始めます。ドリルを使用して、先端から1センチメートルのところにある20リットルの注射器の壁に直径約2ミリメートルの小さな穴を開けます。シリンジにろ過された0.5モルの水酸化カリウムを充填し、先端を視野に入れて解剖顕微鏡の下のスタンドに水平にクランプし、シリンジの穴に電線を押し込み、シリンジの先端を塞がないようにして電源のアノードに接続します。

顕微鏡の右側で、電極ホルダーシャフトを手動マイクロマニピュレーターに取り付けます。次に、ワニ口クリップを使用して、電極ホルダーシャフトの付け根に電気ケーブルを取り付けます。ケーブルを電源のカソードに接続します。

5センチメートルのタングステンワイヤーを電極ホルダーに挿入し、シャフトにねじ込みます。マニピュレーター上。PSUを6倍に設定します。

解剖顕微鏡で観察しながら、電極の長さの90%が溶液中に入るように、シリンジの先端に電極を挿入します。1分後、電極をゆっくりと引き出してから、電極を再度挿入します。今回は、電極の50%のみが溶液と接触している必要があります。

30秒後、電極を再度引き抜きます。電極の50%が水酸化カリウムと接触するように針を挿入するたびに、このプロセスを10回繰り返します。電極を研ぎ澄ますと、実験に使用する準備が整います。

クロマトグラフィー紙を3ミリメートル×5センチメートルのストリップに切断することにより、所望の臭気物質の30マイクロリットルの各ストリップピペットに臭気物質送達システムの準備を開始する。次に、ピペットを過ぎたグラスの内側にストリップを置きます。長さ約3cmのエアラインチューブをピペットに取り付けます。

次に、コネクタを使用してチューブを閉じ、準備した臭気物質を脇に置きます。次に、カミソリの刃を使って上から4ミリリットルのマークで10ミリリットルのプラスチック血清ピペットをカットし、先の尖った端を捨てます。次に、小さなドリルを使用して、マイナス1.5ミリリットルのマークに1つ、マイナス0.5ミリリットルのマークに1つの2つの穴を作成します。

次に、200マイクロリットルのピペットチップを有刺鉄線のカプラーに挿入し、10ミリリットルのピペットの切断端にカプラーを押し込みます。ピペットをマグネットスタンドに固定し、顕微鏡の近くに置きます。次に、エアラインチューブを使用して血清ピペットをエアポンプに接続し、臭気物質を含むピペットを血清ピペットの隣に置き、すぐに使用できます。

次に、電極ホルダーに電極をねじ込み、顕微鏡セットアップのマニピュレーターに接続されたプローブをねじ込みます。デンタルワックスの上にカバーガラスを30度の角度で置き、デンタルワックスがガラスの上部を覆わないようにします。次に、デンタルワックスを顕微鏡の中央部分に置きます。

スライドは、スライドの上に示されているように、スライドの上に追加の小さなワックスを置きます。垂直プーラーで引っ張られたガラスキャピラリーを置きます。120 cm のエアラインチューブの一端に、切り取った 200 マイクロリットルのピペットチップを挿入して、フライトアスピレーターを組み立てます。

チューブのもう一方の端を1.5センチメートル×1.5センチメートルのメッシュで覆い、切り込みでキャッピングして所定の位置に固定します。1ミリリットルのピペットチップ。次に、ハエ吸引器を使用して、ボトルから成虫のハエを拾います。

フライアスピレーターの先端を200マイクロリットルの先端でキャッピングして、ハエを捕まえます。次に、チューブに息を吹き込んで、フライを200マイクロリットルの先端の端に向かって押します。カミソリの刃のトリムを使用して、ピペットの先端をフライから数ミリメートル離します。

デンタルワックスをすばやく挿入して、フライを解剖顕微鏡で捕らえます。フライの頭の近くでピペットチップを切り取り、小さなピペットチップで傷つけないように注意してください。ハエの目の約半分が先端から突き出るまでワックスを押します。

足が出てこないように注意してください。フライをワックスに取り付け、頭を上に向けて取り付けます。次に、ここに示すように、カバーガラスに隣接するスライドにワックスを置きます。

ワックスを少し動かして、アンテナが伸びてガラスの上に置かれるようにします。2番目と3番目のアンテナセグメントの間の溝にガラスキャピラリーを配置して、アンテナを固定します。フライをスライド上に配置したら、記録と匂い物質のセットアップで使用する顕微鏡に低倍率で移します。

アンテナを視野のほぼ中央に配置します view。参照電極をゆっくりと下げ、目に隣接して配置します。次に、記録電極を下げて、アンテナに隣接して配置します。

倍率を上げ、アンテナを視野の中央に再配置します。アンテナを指すフライの頭の近くに臭気送達装置を置きます。マイクロマニピュレーターを使用して低倍率に戻します。

参照電極をハエの目に挿入します。記録電極をアンテナの表面に触れないようにアンテナの上に下げます。その後、マイクロマニピュレータを使用して高倍率化に戻します。

電極が適切に配置されたときに、記録電極をその長さに沿った任意の点でsynに挿入すると、sensの細胞内の自発的な活動を検出できます。必要に応じて、電極をsensの奥まで押し込むか、さらにはsensまで押し込むことで、より良い信号対雑音比を得ることができます。臭気物質への反応を記録するには、エアラインチューブを使用して牧草地ピペットをエアポンプに接続し、この場合は臭気物質である酢酸メチルを、エアポンプを毎分約220ミリリットルで約1秒間作動させて

電気吸引器を使用して、40〜63〜5日齢の蚊を小さなプラスチックケージに集めます。ケージを氷の上に約15分間置き、蚊に麻酔をかけます。蚊の動きが止まったら、4〜6匹の蚊を解剖顕微鏡ステージに移します。

男性と女性の両方。蚊は録音に使用できます。男性で。

触角は羽のように見えますが、女性では、細い鉗子を使用するようにフィラメントのように見え、蚊の翼と脚を取り除き、蚊を固定します。翼を取り外したら、蚊が乾燥するのを防ぐために、蚊を加湿されたプラスチックカップに入れます。解剖顕微鏡の下のスライドガラスの中央と側面に、互いに平行に、約1センチ離して、互いに平行に、約1センチメートル離して2つの1センチメートルの長さの両面テープを置き、鉗子を使用して1匹の蚊をその側に置きます。

中央のテープ上。片目がテープにくっつきます。上顎歯髄の位置を調整して、上顎歯髄がテープ上で平行に伸びるようにします。

上顎歯髄は、人間の毛などの細い紐を歯髄の基部と先端に配置して固定します。蚊がスライドに配置されたら、記録セットアップに移します。低倍率位置では、上顎歯髄は視野のほぼ中央にあり、上部のヘッドは、歯髄の1つが直角になるまでステージを回転させます。

記録電極を使用して、参照電極が蚊の目の真上に配置されるように電極の高さを調整します。そして、記録電極は上顎歯髄の近くにあります。臭気送達装置は、できるだけパルプに近づくように配置してください。

参照電極を目に挿入します。100 x 対物レンズに切り替えて、記録電極を触診のペグに挿入します。電極がセンタムに入ると、細胞の自発的な活動を検出できます。

ショウジョウバエの記録と同様に、この場合、臭気物質を膨らませることによって臭気物質が反応を誘発し、臭気が入る後部ピペットをエアポンプに接続し、次にエアポンプを作動させることによって、1OCTが3つすべてになります。次に、ショウジョウバエとoph嗅覚ニューロンの両方からの代表的な記録をいくつか紹介します。太陽と記録の品質に応じて、ショウジョウバエの大きな塩基の象徴的なシッラの単一のトレース内で異なる数の嗅覚ニューロンを区別することができます、たとえば、2つから4つの細胞の間で、その違いのスパイク振幅は記録中に現れるはずです。

この図は、2つのショウジョウバエAB 2つのlum細胞から行われた記録を示しています。A細胞からの記録は青色で、B細胞からの記録は緑色で示されていますが、パラフィンオイルの塗布中にどちらの細胞も活性化されません。左図に示すように、OPISガンビアの上顎パルでは酢酸メチルに対するA細胞応答のみ、溝付きペグとソームには3つの細胞が含まれていますが、識別が容易なのは2つだけです。ここは。

緑色で示されている記録は、臭気物質1、OCT3に対するB細胞の応答を示しています。すべて私たちはあなたに酢のフライのショウジョウバエmelanogaster、そしてマラリアの蚊と斬新なガンビの嗅覚ニューロンから記録する方法を示しました。この手順を実行するときは、安定したisset準備と、録音を正常に実行するための細かいタンクと電極を用意することを覚えておくことが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。