Name: 生体系における酸素イメージング用燐光ナノプローブの合成とキャリブレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぶ 白金・パラジウムポルフィリン系燐光ナノプローブの合成とキャリブレーション手法。生体系での酸素イメージングに適したデンドリマー構造の設計と、正確な酸素測定のための調整方法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH、米国からの補助金EB007279とHL081273のサポートは感謝しています。

<ol><li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+on+quenching+of+phosphorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li>
<li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+phosphorescence%3A+A+novel+method+for+measuring+the+distribution+of+oxygen+in+perfused+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue.</a> Science. 241, 1649-1651 (1988).</li>
<li>Lebedev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+phosphorescent+probes+for+oxygen+Imaging+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems.</a> Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).</li>
<li>Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+versatile+synthesis+of+substituted+tetrabenzoporphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins.</a> Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).</li>
<li>Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rothemund+and+Adler-Longo+Reactions+revisited%3A+Synthesis+of+tetraphenylporphyrins+under+equilibrium+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions.</a> Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).</li>
<li>Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+metalloporphyrin-based+dendritic+nanoprobes+for+two-photon+microscopy+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Porphyrins+and+Phthalocyanines%22%5BJournal%5D)">Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen.</a> J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).</li>
</ol>

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"&gt;<tr<td<strong&gt;略称</strong<strong</strong</td&gt;<td<strong&gt;フルネーム</strong<strong</strong</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMP</td&gt;<td&gt; N -メチルピロリジノン</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; TFA</td&gt;<td&gt;トリフルオロ酢酸</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DIPEA</td&gt;<td&gt;ジイソプロピルエチルアミン</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; HBTU</td&gt;<td&gt; 2 - （1H -ベンゾトリアゾール-1 - イル）-1,1,3,3 - テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DMSO</td&gt;<td&gt;ジメチルスルホキシド</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; CDMT</td&gt;<td&gt; CDMT = 1 - クロロ-3,5 - dimethoxytriazine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMM</td&gt;<td&gt; NMM = N - methylmorfoline</td&gt;</tr&gt;</table

生体系における酸素イメージング用燐光ナノプローブの合成とキャリブレーション

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

リン光消光による酸素の測定[1、2]次の手順で構成されています：1）プローブは、関心のある媒体（例えば血液または間質液）に配信されます、2）オブジェクトは、励起するために適切な波長の光で照らされているその三重項状態へのプローブ、3）放射される燐光が収集され、その時間のコースは酸素濃度（または分圧に変換される燐光寿命を、得るために分析され、PO<sub&gt; 2</sub&gt;）。プローブは、生物学的環境と相互作用してはならず、いくつかのケースでは、測定終了時に培地から排泄される）4になるために。これらの各手順は、測定プロトコルの唯一の侵襲的なコンポーネントを構成する燐光プローブの分子設計上の要件を課している。ここでは、生体系における酸素の測定のための樹状燐光ナノセンサーの設計を見直す。プローブは、ポリエチレングリコール（PEGの）残基と末梢変更、PtまたはPdポルフィリン系polyarylglycine（AG）デンドリマーで構成されています。効果的二光子励起の場合は、デンドリマーの末端は、励起エネルギーを捕捉し、分子内（フェルスター共鳴エネルギー移動）FRETを経由してプローブのトリプレットコアに、それをチャンネル2光子アンテナの発色団、と変更されることがあります。我々は、プローブと現在のキャリブレーションの詳細なプロトコルの主要な光物理的性質を記述する。

我々は、リン光消光と生体系における酸素のイメージングのためのポルフィリン系樹状ナノセンサーの見直しの設計によって酸素測定の原理を提示する。

リン光消光法による酸素測定 [1, 2] は、以下の手順で構成される。1) プローブを目的の媒体（例：血液...

白金およびパラジウムポルフィリンDERsに基づいた酸素用燐光プローブの設計について解説します。これらのプローブは、デンドロンと末梢の親水性ポリエチレングリコール層を包接した金属ポルフィリンコアで構成されています。本論文では、プローブの構築方法とその校正について説明します。こんにちは、ルイス・シンクスです。私はペンシルベニア大学の生化学・生物物理学部で、Sergei OV教授と共に研究を行っています。Emmanuel Losisです。また、Vinaの、そしてSergei Vのチームにも所属しています。リン光消光法による生物学的酸素測定では、外来性のリン光プローブを使用し、これを目的の培地へ直接導入します。血液または組織間液プローブは、測定スキームにおいて唯一の侵襲的構成要素であり、その設計には特別な注意が必要です。本日は、酸素測定および生物学的システム向けの樹状リン光ナノプローブの合成と校正の手順について説明します。この手順を用いて、半定量および2段階の酸素測定用プローブの合成と特性評価を行います。それでは始めましょう。プローブの作製に入る前に、まずプローブのリン光の背後にある基本理論について説明します。リン光は、寿命の長い三重項状態に由来します。プローブ分子は、三重項状態で高い量子収率を示し、蛍光ではなくリン光を放出するように設計する必要があります。プローブの励起は、1光子によって、あるいは特殊な2光子増強プローブの場合は2光子機構によって起こります。一般的に1光子励起は空間分解能が低くなりますが、装置構成が簡素であり、LEDベースのファイバー光学式リン光計を用いた単一点測定に使用できます。プローブが三重項状態にあるとき、酸素分子との衝突が起こり、三重項状態が失活することがあります。この現象はクエンチングと呼ばれます。したがって、酸素が存在すると、りん光寿命は短縮されます。このクエンチングの結果、環境中の酸素量に対する三重項状態の寿命の依存性は、Stern-Volmer式によって特徴付けられます。in vivo実験では、プローブを動物の血液または間質液に投与し、組織表面に適切な波長の光を照射してプローブを励起三重項状態にします。リン光寿命を測定するために、放出されるリン光フォトンの時間を記録（ビン化）します。例えば、励起パルスの後、最初の5 µsで3,609個のフォトンが収集され、次の5 µsで1,421個のフォトンが収集されるといった具合に、フォトンが収集されなくなるまで計測を続けます。時間に対してプロットされたビン内の数値はリン光減衰を示しており、これを解析することでリン光寿命が算出されます。イメージングでは、この手順を画像のすべてのピクセルに適用し、リン光寿命マップを作成します。寿命の測定は、生物学的試料によく見られる、物体内のプローブ分布の不均一性の影響を受けません。それでは、プローブの作製方法について説明します。まず、0.01 molarのテトラヒドロイソインドール溶液に芳香族アルデヒドを添加し、合成手順を開始します。反応混合物を室温の暗所で10分間攪拌してください。次に、トリフルオリドホウ酸ジエチルを加え、さらに2時間攪拌を続けます。続いて、2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン（DDQ）を加えると、溶液の色が淡赤色から深緑色に変化します。混合物を攪拌しながら一晩放置し、翌日に溶液を洗浄・乾燥させた後、真空中で濃縮します。残留物を再結晶させると、目的物が緑色の粉末として得られます。収率は通常50%前後です。次に、遊離塩基ポルフィリンを酢酸パラジウムで処理します。変換はUV-vis分光法でモニターします。468から472ナノメートルの間のDionのソープバンドが消失すれば、変換は完了です。ポルフィリンはシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって単離します。パラジウムテトラベンゾポルフィリンを調製するには、パラジウムテトラシクロポルフィリンを酸化させてください。還流中、色は濃赤色から深緑色に変化します。溶媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタンで希釈し、洗浄後、有機相を真空中で乾燥および濃縮します。シリカゲルクロマトグラフィーの後、パラジウムテトラベンゾポルフィリンを青緑色の粉末として単離します。次に、パラジウムテトラベンゾポルフィリンの末端エステル基を加水分解します。まず、テトラベンゾポルフィリンエステルをテトラヒドロフラン中で塩基で処理します。次に、水性塩基を用いて加水分解を行い、塩酸を添加してポルフィリンを沈殿させた後、真空中で乾燥させます。これでポルフィリンの合成は完了です。次に、エントロンの合成方法について説明します。プローブを組み立てる前に、Denmarkの分岐点となるエントロンをあらかじめ合成しておく必要があります。ここでは、クロマトグラフィーを用いない手法で安価な出発物質から簡便に調製できる、aero gly、same DERsを使用します。次に、焦点にアミノ基を持つテロンを、先ほど作製方法を示したフィのカリル基に結合させます。その後、DMEの周辺にあるエステル基を、ポルフィリンの周辺にあるカルボキシル基と同様に加水分解します。この段階で、ポルフィリンDMEポリカルボン酸を出発物質として、2光子プローブを合成することが可能になります。まず、デマー（demer）周辺部のいくつかのカルボキシル基に、少数の2光子アンテナ断片を分岐的に結合させます。次に、デマーに残っているカルボン酸残基の修飾を行います。まず、高濃度のポルフィリンライマー溶液に1.25当量のHBTUを加え、反応混合物を室温で10分間撹拌します。次に、ジイソプロピルエチルアミンとメトキシポリエチレングリコールアミンを加えます。反応混合物を室温で2日間撹拌し、その後、エチルエーテルを加えます。遠心分離によって形成された沈殿物を分離し、ジエチルエーテルを加えてテトラヒドロフランから数回再沈殿させます。最後に、テトラヘドランを溶媒として、ポリスチレンビーズを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによりプローブを精製します。次に、プローブの特性評価とキャリブレーションについて説明します。プローブの吸収および放出スペクトルは、標準的な分光光度計および定常状態蛍光光度計を用い、周囲条件下で1 µMのプローブ溶液を使用して取得します。次に、プローブの寿命と酸素濃度の関係を求めるためのStern-Ulmer校正曲線を得るため、プローブ溶液を特殊な円筒形容器に入れます。この容器は、励起用および放出用の光ファイバーポートを備えた遮光ケージ内の温度制御チャンバーに設置します。容器をストッパーで密閉し、そこには高感度のクラーク型酸素電極が挿入されています。ストッパーには、アルゴンガスの導入および排出用のニードルポートが2つあります。温度を36〜37 °Cに設定し、溶液が平衡状態に達するまで撹拌し続けます。励起ファイバーを、PCで制御されるデジタルリン光計の励起ポートに接続します。光源およびフォスぺリメーター（phos perimeter）には高出力LEDが使用されており、その出力は333 kHzのデジタル-アナログ変換基板によって制御されています。放出光ファイバーはフォスぺリメーターの別の光学ポートに接続されており、そこから赤外線感応アバランシェフォトダイオードに結合されています。ダイオードの出力は増幅された後、同じ制御基板のADチャンネルに入力され、これにより励起チャンネルと放出チャンネルの同期が可能になります。自作の制御ソフトウェアにより、任意の長さの励起パルスを生成し、続いてリン光減衰を収集します。酸素電極の出力は増幅され、同一PC上の別のアナログ-デジタル変換ボードに送られます。これは最大1 kHzの低周波ボードであり、通常は1秒間に10回という選択された時間ポイントで電極電流を記録するために使用されます。溶液の温度が平衡状態に達した後、phosペリメーターと電極プログラムを同時に初期化します。10秒ごとに測定を行うため、それぞれの出力を2つの別個のファイルに同期して記録します。その後、vetストッパーの入口ポートにアルゴンを接続します。攪拌した溶液の表面にアルゴンを流すと、徐々に酸素が置換されます。これにより電極電流が減少し、ホス・ペリメーター（phos perimeter）で測定されるリンの寿命が延びます。通常、溶液中の酸素は完全に除去されます。滴定ランから約2時間後、電極データとリン光寿命を標準的な解析プログラムにインポートし、リン光寿命の逆数対酸素分圧のプロットを作成します。このプロットに最小二乗法を用いて直線近似を行い、その傾きから酸素消光定数を求めます。リン光寿命は、同じ近似曲線から、あるいは酸素分圧ゼロでの測定値から直接的に得られます。動物のin vivoにおける血液中の条件を模倣するため、血漿中に存在するタンパク質であるアルブミンの存在下でプローブ溶液を用いて滴定を繰り返すことができます。ERがプローブを保護し、PEG基がプローブとアルブミンの接触を遮断している場合、得られるStern-Volmerプロットは同一になるはずです。ここでは、酸素合成における選択的な手順、および処理済みプローブとその校正について提案します。校正を行う際は、条件を目的とする生物学的システムの条件にできるだけ近づけることが重要です。プローブ分子がアルブミンなどの生体分子の影響を受けないことを確認することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。

synthesis-calibration-phosphorescent-nanoprobes-for-oxygen-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、燐光の酸素依存性消光に基づく脳血管系における酸素の分圧（PO2）を測定するための実験手順を示す。動物の準備と撮像法は、ラットとマウスにおけるPO2の2光子励起に基づくイメージングにおけるPO2のビューCCDベースのイメージングの大きなフィールドの両方に概説された。...

燐光の酸素依存性の焼入に基づいて脳の血液の酸素化の測定

このプロトコルは、電子スピン共鳴顕微鏡による生細胞の周囲の環境中の酸素濃度のミクロンスケールの三次元イメージングのための方法を説明します。...

電子スピン共鳴酸素マッピングのためのライブ種のマイクロイメージング

私たちの研究室で生産された蛍光ナノ粒子は、そのような生理的恒常性の間のシグナリングおよび間質液中の細胞のような生物学的システムにおけるイメージングイオン濃度とイオンのフラックスに使用されます。...

生体内イオン濃度の測定のための蛍光ナノ粒子

NADPHオキシダーゼは、食細胞内の活性酸素種の主要な供給源（ROS）です。なぜならROSのはかない性質のために、生きている動物のROSレベルを測定し、監視することは困難である。生きたマウスにおけるROSのシリアル定量化のための低侵襲的方法が記載されている。...

異なる動物モデルにおけるNADPHオキシダーゼ活性の生物発光イメージング

この原稿は、蛍光顕微鏡を使用して単一細胞のNO•変動をリアルタイムで監視するための新しい遺伝的にコードされた一酸化窒素(NO•)プローブ（geNOps）の適用のためのプロトコルを提示します。個々の内皮細胞レベルでのCa2+によって誘発されるNO•形成は、geNOpsと化学的なCa2+センサーを組み合わせることによって視覚化されました。...

遺伝的にコードされた蛍光一酸化窒素の応用（•NO）シングル細胞におけるNO•信号のリアルタイムイメージングのためのプローブ、geNOps、

脱酸素条件のナノ秒-ミリ秒のタイム スケールの時間分解フォトルミネッ...

時間分解光物性評価のトリプレット収穫有機化合物無酸素環境使用、iCCD カメラ

2DO2分布を光学センサ箔でマッピングするための新規な周波数領域発光寿命カメラの使用について説明します。カメラシステムと画像解析手順は、水生植物の根圏におけるO2微小環境を可視化するためのセンサ箔の調製、キャリブレーション、および適用と共に説明されています。...

周波数領域ベースのカメラシステムを用いたO2の発光寿命イメージング

このプロトコルは、標準的な蛍光顕微鏡での酸素化および細胞死のマルチパラメトリック分析を使用して、バイオプリンティングのためのハイスループットスフェロイド生成を記述している。このアプローチは、スフェロイドの生存率を制御し、3D組織、腫瘍微小環境、および成功した(マイクロ)組織バイオファブリケーションのモデリングにおいて重要な標準化を実行するために適用することができる。...

多細胞スフェロイドの手頃な価格の酸素顕微鏡支援バイオファブリケーション

この論文では、長い崩壊発光サンプルの巨視的なフォトルミネッセンスライフタイムイメージングのための新しい高速光学イメージャーの使用について説明します。統合、画像取得、および分析手順、およびイメージング用のセンサー材料の準備と特性評価、および生物学的サンプルの研究におけるイメージャーの適用について説明します。...

生物医学アプリケーション向けの蛍光寿命マクロイメージャ

2光子励起蛍光顕微鏡(2PEF)と統合された酸化重水素(重水D2O)プローブ誘導ラマン散乱(DO-SRS)顕微鏡を使用して、アミノ酸によって制御される細胞の代謝活動を直接視覚化するプロトコルを提示します。...

芳香族アミノ酸によって制御される細胞代謝のバイオ直交化学イメージング

このプロトコルは、二重層マイクロ流体チップを作製し、急速な酸素振動下での微生物増殖を分析する方法を提示します。このデバイスの性能は、流体チャネルでの酸素センシングと微生物培養を通じて検証されました。...

マイクロ流体二重層デバイスを用いた微生物1細胞増殖解析における急速酸素振動の創出

学ぶ 白金・パラジウムポルフィリン系燐光ナノプローブの合成とキャリブレーション手法。生体系での酸素イメージングに適したデンドリマー構造の設計と、正確な酸素測定のための調整方法を解説します。

生体系における酸素イメージング用燐光ナノプローブの合成とキャリブレーション

さらに動画を探す