ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究​​のための動的画像解析

この手順では、植物組織における遺伝子発現の動態をロボティクスを使用して経時的に画像化し、最初にライマメの種子を滅菌し、湿らせたペーパータオルの間に組織培養容器に入れて発芽させます。4日後、コーアンを取り出し、GFPに融合したプロモーターを含むDNAコンストラクトを照射し、ペトリ皿に入れたコーアンを2次元のカスタム設計ロボット画像収集システムに搭載します。このロボットは、100時間ごとに各ティッシュピースの画像をキャプチャするようにプログラムされています。

画像は画像解析に供され、時間の経過に伴うGFP発現の強度に関する定量的データが得られます。こんにちは、私はオハイオ州立大学の園芸作物科学部の植物形質転換研究所の所長であるジョン・ファイナーです。私はカルロス・ヘランデス・ガルシア、オハイオ州立大学の最終研究室の博士課程の学生です。

本日は、Carlosが緑色蛍光タンパク質を用いた遺伝子発現と植物組織の解析のために開発したプロトコールをご紹介いたします。研究室で開発したこの手順を用いて、OD活性のひずみを測定しています。このプロモーターを行うには、レポーター遺伝子であるGFP遺伝子の上流にある最初のクラウンがあります。

プロモーター制御をリマ静脈触媒に導入し、カスタムデザインのロボット画像キャプチャシステムにアプリを送信する方法を紹介します。最後に、画像解析のプロトコルについて説明します。だから行きましょう この手順を開始するには、標準的な手順を使用して表面滅菌されたライマメの種子

滅菌した種子をマゼンタGAの7つの容器に湿ったペーパータオルの層の間に置き、摂氏25度で4日間インキュベートします。ここでは、プロモーターおよびプロモーターエレメントの分析に役立つ高コピー数発現ベクトルを使用します。このベクターにはGFP遺伝子が含まれており、爆撃の約1〜2時間前に形質転換組織のプロモーターまたはプロモーターエレメントの機能を視覚化するために使用されます。

種皮からのライマメCUレジンを物品税。砲撃に適したCUレジンは、黄色から薄緑色で、平らで、MS塩B、5つのビタミン、3%スクロース、およびpH 5.7で0.2%ゲルレートを含むOMS培養培地で12 cuのレジンをペトリ皿に入れた直後に、さらなる画像分析を妨げる可能性のある損傷がないことが必要です。次に、DNA構築物をM 10タングステン粒子に沈殿させますまず、使用直前に、粒子を滅菌水に再懸濁して100ミリグラム/ミリリットルの濃度にします。

次に、0.6ミリリットルのフージチューブに、25マイクロリットルの粒子、1マイクロリットルあたり1マイクログラムのDNA5マイクロリットル、2.5モル塩化カルシウム25マイクロリットル、100ミリモルの精子アイン10マイクロリットルを追加します。DNA調製物を氷上で5分間インキュベートし、次いで粒子の上の溶液の50マイクロリットルを取り出して廃棄する。チューブの底に残っているDNAコーティングされた粒子をボルテックスによって再懸濁します。

そして、ボルテックスした直後に、2マイクロリットルのEloquaを取り外します。このボルテックスステップを繰り返します。Eloquaを取り外すたびに、コーティングされた粒子を氷上に保管し、15分以内に使用する必要があります。

DNAが粒子にコーティングされたので、フィルタースクリーンの中央にあるシリンジフィルターの上部に2マイクロリットルの粒子を置きます。次に、シリンジフィルターを粒子流入ガンまたはPIGチャンバー内のフィルター保持ユニットに入れます。ビーカーの底に溶けたスクリーンからなるバッフルの上に、軸方向を上にしてライマメの共リードインを置きます。

バッフルは、粒子砲室に砲撃中に組織を支えるためのプラットフォームとして使用されます。組織を衝撃を与えるには、まず真空につながるバルブを開いてチャンバーを排気します。真空度が760mm水銀柱に達したら、ソレノイドを作動させ、ヘリウムを放出して粒子を推進します。

粒子を加速するために使用されるヘリウム圧力は50〜60PSIです。粒子の衝撃後、真空ラインバルブを閉じ、排気バルブを使用して真空を解除します。真空が解除されたら、チャンバーのドアを開けて、爆撃されたコリードインを回収し、コリードインをダル側に戻します。

定量および発現プロファイリングのためのOMS培地まで。DNAコンストラクトごとに最低3つの共リードインを投与します。また、よく研究された遺伝子発現プロファイルを提供するポジティブコントロールも含まれています。

これで、共リードインをイメージングする準備が整いました。水銀ランプをオンにし、ランプが温まるまで30分間待ちます。SPOT R-T-C-C-Dカメラとモーターコントローラーの電源をオンにすると、8枚のプレートを保持するカスタムデザインのロボティクスプラットフォームの動きを駆動します。

MZ L 3 分析顕微鏡で 480 ナノメートルの励起と 510 ナノメートルの発光で GFP 2 フィルターセットを選択することにより、GFP 検出用のフィルターセットを設定します。次に、厚くなったポリカーボネート製のシャーレ蓋に70%エタノールを噴霧して滅菌します。ペトリ皿のベースを覆うために使用される特殊な蓋は、画像収集中の結露を防ぎます。

衝撃を受けたクアンが入ったプレートをロボティクスプラットフォームに置き、横方向の止めネジを締めて所定の位置に固定します。次に、ロボットプラットフォームと画像取得の両方を制御するカスタムソフトウェアアプリケーションを開きます。また、ソフトウェアを使用してソフトウェア白色光コントローラースイッチを開き、プラットフォームをホームポジションに向けます。

これは、ポジションに入る前に行われます。モータータブのすべてのコドルリードインで、最初のプレートを選択します。プラットフォームは、顕微鏡の対物レンズの下にペトリ皿の中心を配置します。

移動距離ボタンを使用して、画像収集用の最初のCULEADINを正確に配置します。ライブモード機能を使用して、抱きしめるリードを適切なに移動します viewエリア 最初の抱きしめるリードの場合は、解剖顕微鏡の手動ノブを使用してフォーカスを設定し、倍率を1.6倍に設定します。関心領域を設定したら、[このポジションを追加]ボタンをクリックします。

ソフトウェアは、この領域の座標を位置スケジュールファイルに追加し、プラットフォームはプレート上の残りのすべてのコーエンのプレートセット位置の中心に戻ります。移動距離ボタンを使用して、ロボティクスプラットフォームの各プレートの下にある3本の手動レベリングネジを使用して、同じプレート上の残りのコーンの焦点を調整します。すべての座標を入力したら、位置スケジュール座標を保存します。

光の種類(GFPの場合は青色)や露出設定などの画像収集パラメータを入力し、付属の書面によるプロトコルに記載されているように、画像を保存する場所を指定します。キャプチャ時間制御タブに移動し、画像取得時間間隔と画像収集の合計サイクル数を設定します。通常、画像は 100 時間ごとに収集されます。

明確に定義された遺伝子発現プロファイルの生成。画像取得を開始するには、ポジションスケジュールタブを開き、実行スケジュールボタンをクリックします。100時間の画像収集の最後に、画像収集システムを外来光から分離します。

それぞれ約5メガバイトの高解像度画像は、画像分析の準備ができています。[準備ができたイメージを使用] 各フォルダから 100 個の連続したイメージを組み立てます。すべての連続画像をフレームとしてインポートし、画像処理を高速化するために800 x 600ピクセルにサイズを変更します。

次に、新しく導入されたレイヤーにマークを使用し、すべてのフレームに表示され、画像参照で選択したGFPスポットを使用します。整列が完了したら、各画像を手動で整列させ、参照として使用したレイヤーを削除して、ファイルを1つのPSDファイルとして保存します。また、すべてのフレームを最高の解像度を使用して単一のMOVファイルとしてエクスポートします。

これで、GFP定量を開始する準備が整いました。画像Jを使用してMOVファイルを開き、400 x 300ピクセルの領域を切り抜きます。次に、赤と緑のチャンネルのRGB分割ツールを使用して、シーケンシャル画像を赤、青、緑のチャンネルに分割します。

各スライスプラグインツールで測定されたROIの減算を使用して、バックグラウンド蛍光を減算します。しきい値レベルを調整し、ピクセルあたりの平均グレースケール値とGFP表現ピクセルの総数を測定するように設計されたプラグインを使用して、GFP表現を計算します。画像に出力値をコピーする J.最後に、緑と赤のチャンネルの出力値をMicrosoft Officeに貼り付けます。

Excelを使用してさらにデータを操作し、画像の位置合わせの結果を把握することができます。この最初のアニメーションは、100時間の実験中のロボティクスプラットフォームの再配置の不正確さを示しています。スポット移動は、手動の画像アライメント後にロボティクスプラットフォームが各時点でまったく同じ位置に戻ることができないことに起因するアーティファクトであり、GFP発現細胞を容易に観察でき、この追跡システムのユニークな特徴を簡単に視覚化できます。

このアニメーションが繰り返しているように、丸で囲まれたGFP発現細胞、赤で囲まれた細胞は、衝撃後18〜20時間で発現が非常に急速に減少することを示していますが、白で囲まれた細胞はGFP発現の遅延開始を示しています。アニメーション以外にも、この手順により、ライマメの標的組織におけるGFP発現の経時的な迅速な定量化が可能になります。これらの代表的な結果は、CAMV 35 S プロモーターと 4 つの異なる大豆プロモーターを使用したプロモーター強度の比較定量を示しています。

発芽のカタリンにDNAを導入する方法をお見せしました。リマ静脈の種子は、カタリンをロボットに置き、画像分析のために画像を収集し、それらの画像を分析します。私たちの研究室では、クローン植物のプロモーターを検証するために、この手順を日常的に使用しています。

異なる植物プロモーターの導入により、大量のデータを生成することができます。ただし、この手順は複雑で、この手順を実行することが新しいラインビーンシードから始めるか、少なくとも適切に保管されていた高品質のシードを使用することが重要である場合に失敗する可能性があります。また、ボンバードの蓋を切断してロボットにすばやくセットアップし、結露の問題を最小限に抑えるために厚いペット皿の蓋を使用することも重要です。

最後に、私たちが使用しているGFPは、ハーバード大学のSGFPと呼ばれる別のバージョンであることに注意してください。このGFPはあまり安定しておらず、遺伝子発現の急速な変化を追跡するのに適している可能性があります。そして、それが私たちを見守ってくれた私たちです。

そして、あなたの実験に幸運を祈ります。