Name: B細胞のCD40 -活性化のモデルマウス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 学ぶCD40活性化マウスB細胞の培養法。C57BL/6マウス脾細胞から抗原提示細胞を誘導し、免疫応答の研究に応用する手法を解説。免疫学・移植免疫学の基盤技術として活用可能です。

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私たちは親切tmuCD40 - リガンド- HeLa細胞細胞株を提供するために博士はクレメンスWendtnerに感謝。

脾細胞からマウスCD40活性化B細胞（mCD40B）を生成するためのプロトコルは2つの部分に分かれています：パート板として使用されるマウスCD40リガンド（CD40L）を発現するHeLa細胞（tmuCD40L HeLa細胞）の調製を示していますフィーダー細胞に結合した。パートBは、実際のマウスCD40 - Bの文化を説明します。 フィーダー細胞のA.準備（tmuCD40L HeLa細胞） tmuCD40L HeLa細胞は完全にコンフルエントになることはありません接着ヒト上皮細胞株、です。細胞は、そのため1週間に2回分かれています。以上の6週間以上の培養が推奨されていません。 <ol><li>滅菌ピペットを用いて初代培養から古い培地を除去し、1 × PBS 10 mLで細胞を洗浄。洗浄後PBSを吸引除去する。 </li><li> 37℃で10-15分では75 cm 2のフラスコに1 ×トリプシン/ EDTAの4 mLを加え℃に細胞を分離するために穏やかなタッピングを使用してください。 </li><li>野生型の培地10mLを追加し、トリプシンで消化を停止するように静かに回転さ。 </li><li>滅菌ピペットで50mLのチューブに細胞懸濁液を移し、7分間265 xgで細胞をスピンダウン。 </li><li>上清を除去し、野生型の培地10mlに細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液のアリコートの細胞数をカウントし、適切な数の細胞を3つの50 mLの試験管を準備します。 <ol><li>サブカルチャーのための2.5 × 10 6細胞</li><li>マウスCD40 - B細胞の培養に用いる/よく照射するための0.4 × 10 6細胞</li><li>フリーズして残り（必要に応じて）。 </li></ol></li><li> 7分間265 xgで細胞をスピンダウン。 </li><li>上清を取り除く。 <ol><li>継代のための：再懸濁し、2.5 × 10 6細胞を75センチメートル2細胞培養フラスコ（細胞密度2.5 × 10 5細胞/ mL）10 mLの選択培地で、37で細胞をインキュベート· CO 2 5％のCを。週2回のセルを分割する。 </li><li>マウスCD40 - B細胞の培養には：1つの6ウェルプレートに2.4 × 10 6個の細胞を必要とする。 0.2 × 10 6細胞/ mLの密度で野生型の媒体にtmuCD40L HeLa細胞を再懸濁し、78 Gyの時にそれらを照射する。よくそれぞれ、37でそれらをインキュベート° C、5％のCO 2に細胞懸濁液のプレートを2mL。 tmuCD40L HeLa細胞の接着性のある時にB細胞の刺激のために、この準備のプレートを使用する（少なくとも4時間：顕微鏡を用いて密着性を確認するには、B細胞の刺激を開始するために24時間以上待機しません）。 （bに進みます。） </li></ol></li></ol> B.マウスCD40 - Bの細胞培養 CD40刺激（0日）のための脾細胞のI.の準備： ご注意：あなたは、フィーダー細胞が接着していることを確かめる続行する前に。常にマウスインターロイキン-4、β-メルカプトエタノール、使用直前に増殖培地へのシクロスポリンの新鮮なソリューションを追加します。 <ol><li> C57BL / 6マウス（ハプロタイプH - 2b）の脾臓を摘出し、10〜20 mLのDMEMで二回を洗うには、別のチューブから10mLをピペットチップでそれを転送することにより、ゲンタマイシン[15μg/mL]で補足。マウスの汚染物質（例えば、髪の毛）を転送することは避けてください。セルストレーナー（100μmの）を通すことによって脾臓をミンチし、培地の別の10mLでストレーナーをすすぐ。室温で7分間、265 × gで脾細胞をスピンダウン、フィコール密度遠心分離によってmuCD40 - B細胞の培地、および別のリンパ球7mlのに再懸濁します。その30分を450 × gで15 mLの試験管や遠心機で5 mLのマウスPancoll（室温で予熱）上の層の細胞を室温でブレーキなしで行うには。 </li><li>界面で邪魔されずにリンパ球層を残し、上位層のほとんどをオフに描く。新鮮な50 mlチューブにリンパ球層を転送する、他の細胞を除去するために7分間265 × gでスピンダウンしてゲンタマイシン[15μg/mL]と30mLをDMEMで1回洗浄します。上清を捨て、mCD40 - B洗浄培地10mlに細胞を懸濁します。細胞懸濁液の一定量の細胞数を決定します。細胞懸濁液のアリコートをカウントすることにより、細胞数を決定します。 </li><li> 7分間265 xgで細胞の必要量をスピンダウン。 6ウェルプレート5の場合× 10 6細胞/ウェルこうしてプレート当たり30 × 10 6細胞、必要とされています。 </li><li>上清を除去し、新鮮防ぐために、成長因子、100μMのβ-メルカプトエタノールおよびサイクロスポリン0.63μg/ mLのようにインターロイキン-4の1 U / mLのを補充mCD40 - B培地で1.25 × 10 6細胞/ mLでリンパ球を懸濁します。 T -細胞の伸長（考えると濃度が1枚のMLの培地を参照してください！）。 </li><li> tmuCD40L HeLa細胞とのプレインキュベート6 - ウェルプレートから上清を取り除く。 </li><li>穏やかに6ウェルプレートの各ウェルにリンパ球懸濁液を4mL（1.25 × 10 6細胞/ mL）を追加します。 </li><li> 37プレートをインキュベート℃、5％のCO 2。 </li> 3日目に細胞は（II.1に進みます。）reculture。 </ol> II。 mCD40B細胞（3日目とその後週2回）のサブカルチャー： <ol><li>精力的に50 mlチューブに10 mLのピペットとプール一緒に上下にピペッティングにより収穫mCD40B細胞クラスター。 </li><li> 7分間265 xgでスピンダウンし、完全にmCD40 - B洗浄培地で上清を交換してください。アリコートの細胞の量をカウントしながら、7分間265 xgで細胞をスピンダウン。 0.75 × 10 6細胞/ mLの濃度でmCD40 - B培地で再懸濁しmCD40B細胞。 </li><li> 1 U / mLを、100μMのβ-メルカプトエタノール及び培地へのシクロスポリン0.63μg/ mLの濃度でマウスインターロイキン-4の新鮮なソリューションを追加。 </li><li> 6ウェルプレート照射tmuCD40L HeLa細胞でプレインキュベートから上清を取り除く。 </li><li>穏やかに6ウェルプレートの各ウェルにmCD40Bの細胞懸濁液を4mL（0.75 × 10 6細胞/ mL）を追加します。 </li><li> 37プレートをインキュベート℃、5％のCO 2。 </li><li>再び14日間の合計の後に高純度マウスCD40活性化B細胞で終わるために3〜4日ごとに細胞を継代培養。 </li></ol> C.トラブルシューティング：何かのCD40 - B細胞は増殖しないのですか？ <ol><li>あなたは、フィーダー細胞のCD40リガンド発現について確認しましたか？ </li><li> 24歳以上の刺激のために使用されるプレートに結合フィーダー細胞はありますか？ </li><li>マイコプラズマの混入はありますか？ </li><li>補充のために使用されるインターロイキン- 4ソリューションは、新鮮に解凍され、それは適切な生物活性を持っているのですか？ </li><li> β-メルカプトエタノールおよびシクロスポリン正しい濃度で添加されたのはいつですか？ </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="図1 a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1a。 <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="図1 b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1 B"> 図1b。 <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="図1 d" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1 D"> 図1d。 <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li>
<li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li>
<li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+Ligand-activated%2C+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. S. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li>
</ol>

実験は、実験動物の飼育のための国内及び欧州のガイドラインに従って行った。ドイツの動物福祉法を参照する動物は、適切な当局によって定期的に制御されていました。

このプロトコルの変更も、マウスCD40活性化B細胞の効率的な世代に降伏、特にCD40刺激し、使用されるマウス系統のタイプの起源について、可能な限りされています。アフマディら。 CD40 -リガンドマウスでトランスフェクションしたマウス線維芽細胞に対して同様の結果が示されている。このコンテキストでは外来の抗原の提示を確実に除外されますが、in vivoでのセキュリティと毒性に関する集中的な研究は、炎症またはヒトトランスフェクトしたHeLa細胞を使用して、この設定で自動免疫反応の兆候を与えたことはできません。しかし、最善の選択肢は、我々の知る限りでは市販されていないと同時に、で活動を活性化し、増殖とCD40 -リガンド可溶性マウスを表します。 また、このプロトコルは129S2/SvPasマウス（ハプロタイプH - 2B）からのリンパ球には有効ですが、これまでのところ、さらにマウスの系統については評価されていない。さらに、細胞密度の調整の違い、サイトカイン濃度、シクロスポリンの持続治療、細胞培養培地と料理でも同様の増殖速度とマウスB細胞の効率的なCD40 -活性化につな...

メディアのA.の準備： <table border="1"><tbody><tr><td> フィーダー細胞の野生型媒体 </td><td> フィーダー細胞を選択培地 </td><td></td></tr><tr><td> 試薬 </td><td> 濃度 </td><td> 試薬 </td><td> 濃度 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td> 300μg/ mLの</td><td> L -グルタミン</td><td> 300μg/ mLの</td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10パーセント</td><td> FBS </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mMの</td><td> HEPES </td><td> 10 mMの</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td> 15μg/ mLの</td><td>ゲンタマイシン</td><td> 15μg/ mLの</td></tr><tr><td></td><td></td><td>ハイグロマイシンB </td><td>は0.2 mg / mLの</td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40 - Bの洗浄媒体 </td><td> mCD40 - B培地 </td></tr><tr><td> 試薬 </td><td> 濃度 </td><td> 試薬 </td><td> 濃度 </td></tr><tr></tr><tr><td> D - MEM </td><td> </td><td> D - MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td> 580μg/ mLの</td><td> L -グルタミン</td><td> 580μg/ mLの</td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 4.5 mg / mLの</td><td>グルコース</td><td> 4.5 mg / mLの</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mMの</td><td> HEPES </td><td> 10 mMの</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td> 15μg/ mLの</td><td>ゲンタマイシン</td><td> 15μg/ mLの</td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0.1mmの（1X） </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10パーセント</td></tr></tbody></table> B.その他の試薬： <table border="1"><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> オーダーNo </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td>インビトロジェンギブコ</td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D - MEM </td><td>インビトロジェンギブコ</td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS（10倍） </td><td> PAA </td><td>猫なしH15 - 011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td>デルタの選択</td><td>アートなし7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td>ロンザ</td><td>猫なしDE14 - 802C </td></tr><tr><td> HEPESバッファー</td><td> PAA </td><td>猫なしS11 - 001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td>インビトロジェンギブコ</td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td>ハイグロマイシンB </td><td> PAA </td><td>猫なしP02 - 015 </td></tr><tr><td>組換えマウスインターロイキン-4 </td><td> Immunotools </td><td>猫なし12340045 </td></tr><tr><td>シクロスポリン</td><td>ノバルティス</td><td>猫なしNDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td>トリプシン/ EDTA（10倍） </td><td>インビトロジェンギブコ</td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> C.その他の用品： <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> オーダーNo </td></tr><tr><td>滅菌ピペットチップ</td><td>ザルスタット</td><td></td></tr><tr><td> 6ウェルプレート</td><td> NUNC </td><td>猫なし140675 </td></tr><tr><td> 50mLのコニカルチューブ</td><td> BDファルコン™ </td><td>猫なし352070 </td></tr><tr><td>組織培養フラスコ</td><td>ザルスタット</td><td>猫なし83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

b細胞のcd40 -活性化のモデルマウス

Murine Model of CD40-activation of B cells

B細胞の研究は、CD40の活性化が、その抗原提示能を改善することが示されています。インターロイキン-4およびCD40リガンド（CD40L）で刺激したとき、ヒトB細胞は、高純度のCD40 - B細胞の非常に大きな金額に14日以内に末梢血の少量から困難なく拡張することができます（&gt; 10<sup&gt; 9</sup健康なドナーだけでなく、癌患者から患者あたり&gt;細胞）<sup&gt; 1月4日</sup&gt;。 CD40 - B細胞が重要なリンパ節ホーミング分子を発現し、T細胞を引き付けることができる<em&gt; in vitroで</em<sup&gt; 5</sup&gt;。さらに彼らは、効率的にT細胞に、プロセスと存在する抗原を取る<sup&gt; 6,7</sup&gt;。 CD40 - B細胞は素数ナイーブではないだけに示して、だけでなく、メモリーT細胞を展開していた<sup&gt; 8,9</sup&gt;。したがって、CD40活性化B細胞（CD40 - B細胞）の細胞ベースのimmunotherapy1、5,10のための免疫刺激抗原提示細胞（APC）の代替源として研究されている。 CD40 - B細胞はin vivoで効果的なT細胞応答を誘導し、我々はマウスのCD40活性化B細胞の産生のために細胞培養系を確立し、基礎となるメカニズムを研究するかどうかをさらに研究するために。脾細胞を用いてまたはCD40 -活性化のためのC57BL / 6マウス由来のB細胞を精製し、最適な条件は次のように同定された：C57BL / 6マウス（ハプロタイプH - 2b）はリンパ球の脾臓細胞からの起動は、密度勾配遠心法により精製し、HeLa細胞と共培養されています組換えマウスCD40リガンド（tmuCD40L HeLa細胞）を発現する細胞<sup&gt; 11</sup&gt;。細胞は3-4日ごとにreculturedされており、そのようなCD40L、インターロイキン-4のような主要なコンポーネントは、-メルカプトエタノールおよびサイクロスポリンが補充されています。このプロトコルでは、ヒトCD40 - B細胞（図1A、B）と同様のAPC -表現型と完全に活性化マウスCD40 - B細胞を（mCD40B）を取得する方法を示しています。 CD40刺激は、急速な伸長や細胞培養の14日以内に高純度（&gt; 90％）CD19 + B細胞（図1C、D）の拡大につながる。非トランスフェクト細胞の混入を避けるために、トランスフェクタントでマウスCD40リガンドの発現は、（図2）定期的に制御する必要があります。マウスCD40活性化B細胞はB細胞の活性化と分化と同様にin vitroおよびin vivoにおけるAPCとして機能する潜在能力を調査するための研究に使用することができます。また、彼らは腫瘍に対する治療剤又は予防接種を確立するための有望なツールを示しており、このアプローチの安全性と免疫原性に関する質問に答えるために役立ちます。<sup&gt; 12</sup&gt;。

このビデオでは、我々は、CD40 -活性化と免疫の誘導を研究するためにモデル抗原提示細胞（APC）として使用することができますC57BL / 6マウスの脾臓細胞からマウスB細胞、の拡張の手順を示しています。

B細胞のCD40 -活性化のモデルマウス

B細胞に関する研究により、CD40の活性化が抗原提示能を向上させることが示されている。インターロイキン-4およびCD40リガンドで刺激すると...

こんにちは、私はTanya Wigです。ケルン大学病院の腫瘍免疫学および移植免疫学研究室で博士課程に在籍しています。私の研究は主に、marine CD 40活性化B細胞と、それらがin vivoで免疫応答を誘導する能力に焦点を当てています。もともと、ヒトCD 40 B細胞は、樹状細胞に代わる抗原提示細胞として作製されました。これらの細胞は免疫療法の目的での使用を目指しています。臨床現場では、CD 40 B細胞はCD 40シグナル伝達とIL-4による刺激の下で生成されます。このシステムに従うことで、数週間にわたって細胞を増殖させることが可能です。当研究室においてPBMCからのヒトCD 40 B細胞の生成を最適化した後、この原理をマウスに正常に適用させました。本日はその方法について解説します。脾臓から出発し、14日間の細胞培養によりマウスCD40活性化B細胞を生成します。主な手順は、まずフィーダー細胞の調製です。ここでは、接着性であり、78 Grayで照射した後に6ウェルプレートに播種したマウスCD40リガンド導入フィーダー細胞株を使用します。次に、C57BL/6マウスから新鮮に精製した脾細胞を用い、マウスinterleukin-4、β-mercaptoethanol、およびcyclosporine Aで処理して、マウスCD40 B細胞の培養を開始します。その後、これらの細胞を6ウェルプレート上の照射済みフィーダー細胞へと移します。この手順を、細胞培養の14日目まで3〜4日ごとに繰り返します。高純度のマウスCD 40活性化B細胞を得るため、精製したばかりのLXiマウスの脾細胞を用いて、マウスCD 40活性化B細胞の作製を開始します。まず、脾細胞を50 mLのマウスCD 40 B洗浄液に再懸濁して洗浄します。次に、細胞数を測定するため、1300 RPM（260 5Gに相当）で7分間遠心分離します。細胞を10 mLのmarine CD 40 B洗浄培地で十分に再懸濁し、最後にボルテックスミキサーで細胞を混合します。その後、細胞数を測定します。6ウェルプレートを用い、1300 RPM（260 5Gに相当）で7分間遠心分離し、必要な量の細胞を回収します。1ウェルあたり5×10⁶個、したがって1プレートあたり30×10⁶個の細胞が必要です。marine CD 40 B培地を用いて、1.25×10⁶ cells/mLの濃度で必要な量を分注してください。次に、刺激のためにmarine IL-4を1 U/mLの濃度で、T細胞の増殖を抑制するためにシクロスポリンAを0.63 µg/mLの濃度で、および100 µMのEGTAエタノールを細胞懸濁液に新鮮に添加します。これで、HeLa細胞による刺激の準備が整いました。HeLa細胞株は培養状態で数ヶ月間生存できるため、細胞の生存、分化、

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免疫学と感染症

ヒトCD40活性化B細胞の生成

この動画では、細菌のリポ多糖と免疫グロブリンの静脈内投与に応答した骨髄由来マクロファージの活性化を実演しています。...

抗体に応答したマウス骨髄由来マクロファージの活性化

ここでは、同系CD4+CD45RB高T細胞をT細胞およびB細胞欠損レシピエントに養子として移すことにより、マウスに結腸炎症を誘発するプロトコールを提示します。臨床的および組織病理学的特徴は、ヒトの炎症性腸疾患を模倣しています。この方法により、結腸性炎症の開始と疾患の進行の研究が可能になります。...

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

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今回ナイーブ cd4 陽性 T 細胞 (T 細胞) の活性化、増殖、GM-CSF 骨髄 (BM) による th1 細胞分化・生体内で定量のためのプロトコル-由来樹状細胞 (Dc)。さらに、このプロトコルでは、BM と T 細胞の分離、DC 世代と DC および T...

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このプロトコルは、非遺伝的欠陥転写伸びのインビトロマウス癌モデルを詳述する。ここで、CDK9の慢性阻害は、全癌型の約20%に存在する臨床的に過剰なTE間違いなく現象を模倣し、研究するために、炎症反応遺伝子に沿ったRNA Pol...

癌における広範な非遺伝的転写伸長欠損(TE)を研究する慢性CDK9阻害のマウス細胞株ベースモデル

ここでは、生体内B-1a細胞の移行および局在化を調べるマウスB-1a細胞のレトロウイルス過剰発現および導入導入の方法について説明する。このプロトコルは、ドナーB-1a細胞の局在化の定量化や、導入後のドナー細胞由来分泌因子の分析を含む、多様な下流機能アッセイに拡張することができる。...

マウスB-1a細胞におけるCXCR4のレトロウイルス過剰発現と骨髄およびIgM産生への標的B-1a細胞の移行のための養子転移

ここでは、フローサイトメトリーによる腹膜、脾臓、および骨髄組織におけるマウス免疫B細胞区画の不均一性の単純な分析について説明する。プロトコルは、他のマウス組織に適応し、拡張することができます。...

マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定

学ぶCD40活性化マウスB細胞の培養法。C57BL/6マウス脾細胞から抗原提示細胞を誘導し、免疫応答の研究に応用する手法を解説。免疫学・移植免疫学の基盤技術として活用可能です。

B細胞のCD40 -活性化のモデルマウス

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