Name: 植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートI：リグニン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 学ぶ植物細胞壁のリグニン含有量と組成分析の手法。アセチルブロミド加水分解とUV分光光度法、ガスクロマトグラフィー質量分析を用いて、バイオ燃料生産のためのリグノセルロース系バイオマスの評価を行う方法です。

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私たちは、優れた技術サービスとジョンラルフ、貴重なアドバイス、ディスカッション、およびポプラの木のサンプルのウィスコンシン大学のマシューロバートウェザーに感謝しています。この作品は、科学局、米国エネルギー省（DOE）五大湖バイオエネルギー研究センター（科学DE - FC02 - 07ER64494のDOE BER局）によって、化学科学、地球科学およびバイオサイエンス部門、基礎エネルギー科学局によって資金を供給された、米国エネルギー省（賞なし。DE - FG02 - 91ER20021）。

1。細胞壁の分離<ol><li> iWallを使用して2ミリリットルザルスタットスクリューキャップチューブ、研削及び調剤ロボット（30秒）で5.5 mm、ステンレス鋼ボールで空気または凍結乾燥植物の材料の約60 - 70mgを挽く。ボールミル（retschmill）を使用して代替の非ロボットの低スループットの手順は、第II部2に示す。 </li><li>徹底的に分注された地盤材料を70％エタノール水溶液を1.5 ml加え、ボルテックス。 </li><li>ペレットアルコール不溶性残渣への10分間10,000 rpmで遠心する。 </li><li>上清を吸引したり、デカントする。 </li><li>ペレットを再懸濁するために残渣にクロロホルム/メタノール（1:1 v / v）の溶液1.5mlを加え、よくチューブを振る。 </li><li> 10分と吸引または上清をデカントし、10,000 rpmで遠心。 </li><li>アセトン500μlのでペレットを再懸濁します。 </li><li>乾燥するまで35℃の空気の流れ° Cで溶媒を蒸発させる。 必要に応じて乾燥試料は、さらに処理するまで室温で保存することができます。 </li><li>サンプルから澱粉の除去を開始するには0.1 Mの酢酸ナトリウム緩衝液pH 5.0を1.5 mlでペレットを再懸濁します。 </li><li> 20分間ザルスタット管と熱にフタを。 80℃の加熱ブロックインチ</li><li>氷の上に、懸濁液を冷却する。 </li><li>ペレットには、次のエージェントを追加：0.01％アジ化ナトリウム（NaN3）の35μlの、35μlのアミラーゼ（50μg/ mlのH 2 O、 バチルス属から、シグマ）、17μlのプルラナーゼ（ 枯草acidopullulyticusから17.8単位;シグマ） 。チューブと徹底的にボルテックスにフタを。 </li><li>懸濁液を37℃で一晩インキュベート°回転シェーカーでC。管を配向させる水平側近は改良混合。 </li><li> 100℃の熱サスペンション° C消化を終了するために加熱ブロックに10分間。 </li><li>遠心（10,000 rpm、10分）とを含む上清を可溶化された澱粉を捨てる。 </li><li> 、1.5 mlの水を加えボルテックス、遠心分離、洗浄水からデカンテーションによって、残りのペレット3回洗浄する。 </li><li>アセトン500μlのでペレットを再懸濁します。 </li><li>乾燥するまで35℃の空気の流れ° Cで溶媒を蒸発させる。それはよりよい乾燥用スパチュラでチューブの材料を分割することも必要になる場合があります。 乾燥した材料は、単離された細胞壁（リグノセルロース）を提示。必要に応じて乾燥試料は、さらに処理するまで室温で保存することができます。 </li></ol> 2。リグニン含量このメソッドは、福島とハットフィールド3で報告された方法に基づいています。 <ol><li> 1量る - 調製した細胞壁の材料の1.5ミリグラム（1を参照）ブランクのための空のチューブを残し、2 mlのメスフラスコにする。 </li><li>チューブの底に細胞壁の材料を収集し、空気の流れの下で非常に優しいアセトンを蒸発させるためにアセトン250μlをチューブの壁を洗う。 </li><li>ゆっくりと水はねを防止するためにチューブの壁に沿ってたてのアセチルブロマイド溶液100μl（25％氷酢酸でV / Vアセチルブロマイド）を追加します。 </li><li> 50キャップのメスフラスコと熱° 2時間のためのC </li><li> 15分毎にボルテックスで追加の時間のための熱。 </li><li>室温に氷上で冷却してください。 </li><li> 2M水酸化ナトリウムと作りたての0.5 M塩酸ヒドロキシルアミン70μlの400μlを添加する。渦メスフラスコ。 </li><li>氷酢酸を持っている2.0 mlのマーク、キャップに正確にメスフラスコをいっぱいにして混在させることを数回転倒。 </li><li>ピペットUV特定の96ウェルプレートへの溶液200μlと280nmでELISAリーダーで読み取る。 </li><li> （;草= 17.75;ポプラ= 18.21 シロイヌナズナ = 15.69）、適切な係数を用いて臭化アセチル水溶性リグニン（％ABSL）の割合を決定し、次の式で： ％ABSL Calcの： <img src="/files/ftp_upload/1745/1745eq.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> UG / mgの細胞壁のユニットで10件の検索結果で％のABSLの乗算 それは、少なくとも3プレートは微粒子の吸光度値のわずかな変動を引き起こす可能性があるので、吸光度（ABS）を平均化する読み取り行うことができます。注：0.539センチメートルは、光路長を表しますが、板によってはこれを決定する必要があります。 </li></ol> 3。リグニン組成このメソッドは、ロビンソンとマンスフィールド5で発表された最近の方法を採用したものになっています。 <ol><li> thioacidolysis用スクリューキャップ付きガラス管に（1を参照。）細胞壁の材料の約2 mgを転送する。 </li><li>慎重に2.5パーセント三フッ化ホウ素ジエチルエーテレート（BF 3）、10％エタンチオール（EtSH）溶液を調製。あなたは、窒素とジオキサンボトルで失われたボリュームを置換する窒素ガスを充填した気球を使用する必要があります。ジオキサンが非常に有害である、フードの中から試料や装置を取ることはありません。サンプルあたりの溶液の調製に必要なボリューム：ジオキサン175μL、20μLEtSH、5μlのBF 3。 </li><li> EtSH、BF 3、各サンプルのジオキサン溶液200μlを加え。 </li><li>すぐに窒素ガスとキャップ付きパージバイアルヘッドスペース。 </li><li> 100℃熱°だけ時間混合穏やかで4時間。 </li><li>氷上で5分間冷却することにより、エンド反応。 </li><li> 0.4M重炭酸ナトリウム150μlの、渦を追加</li><li>クリーンアップのために1mlの水と酢酸エチル0.5mlの、渦と相が分離することができます（上に酢酸エチル、底面の水）を追加します。 </li><li> 2ミリリットルザルスタットチューブに酢酸エチル層を150μlを移す。ない水が転送されていないことを確認します。 </li><li>空気とコンセントレータで溶剤を蒸発させる。 </li><li> （2回の合計のために繰り返す余分な水分を除去）200μlのアセトンを追加し、蒸発させる。 </li><li> TMS誘導体化のために酢酸エチル500μlの、ピリジン20μlを、そしてN、各チューブにO -ビス（トリメチルシリル）アセトアミドの100μlを加える。 </li><li> 25℃で2時間インキュベート℃に</li><li> GC / MSバイアル​​に反応液100μlを移し、アセトン100μlを加える。 </li><li>四重極質量分光器または炎イオン化検出器付きGCによるサンプルを分析する。 AgilentのHP - 5MSカラムは、（X 0.25ミリメートル× 0.25μmの膜厚30mm）をインストールされています。以下の温度勾配を30分間溶剤遅延および1.1 ml / minの流速で使用されています：130イニシャルホールド℃で3分間、3℃〜250℃/分のランプ℃、1分間保持;を許可130℃の初期温度に平衡化</li><li>ピークはそれぞれ、テトラコサン内部標準（オプション）を使用して相対保持時間によって、または299メートル/ zの、269のm / z、およびSの239メートル/ Z、G、およびHの単量体の特性マススペクトルのイオンによって識別されます（図を参照してください。 2）。リグニン成分の組成は、100％に、総ピーク面積を設定することによって定量化される</li></ol> 4。代表的な結果壁の解析の例を図2に示す。この場合にはポプラの幹（木）は、プロトコルのセクションで概説、様々な手順で分析した。 thioacidolysisとTMS -誘導体化後のリグニン成分の分離の例のクロマトグラムが表示されます。明らかに、syringyl -（S）の相対量、guaiacyl -（G）、およびp - hydroxyphenol -（H）の単位を決定することができます。臭化アセチル水溶性リグニンの含有量は自明であり、一つは壁乾燥重量の20〜50％の間の値を期待することができます。一つは、臭化アセチルを壁にリグニンの存在のすべてを可溶化しない、と可溶化の程度は材料によって異なることに注意する必要があります。しかし、この方法は、比較的実施しやすいと急速であり、リグノセルロース材料のリグニン含量の優れた近似を与える。 <img src="/files/ftp_upload/1745/1745fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：。リグノセルロースの分析の概要細胞壁（リグノセルロース）は、原油乾燥植物材料から分離されています。壁材は、アリコートに重み付けをし、様々なアッセイのために分割されます。壁材は、臭化アセチルとUV -分光法により定量化可溶化したリグニンと扱われます。リグニンの組成の決定については、壁材はthioacidolysisに供される。可溶化されたフェノール類は、TMS誘導体化を受け、その後分離し、GC - MS分析により定量することができる。マトリックス多糖類組成と結晶セルロースのコンテンツのプロトコルは、パートII 2で説明されています。 <img src="/files/ftp_upload/1745/1745fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：ポプラ（ ポプラtremoloides）からポプラ樹木木材チップの包括的なリグノセルロースの分析は、記載されているプロトコルに供した。 Ligin組成物; H のp -ヒドロキシフェニル、G guaiacyl、S syringylユニット。

<ol><li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulosic+Biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellulosic Biofuels.</a> Annual Review of Plant Biology. 60, 165-165 (2009).</li>
<li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+%28Lignocellulosic+biomass%29%2C+Part+II%3A+Carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part II: Carbohydrates.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Fukushima, R. S., Hatfield, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+isolation+of+lignin+for+utilization+as+a+standard+to+determine+lignin+concentration+using+the+acetyl+bromide+spectrophotometric+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Extraction and isolation of lignin for utilization as a standard to determine lignin concentration using the acetyl bromide spectrophotometric method.</a> J. Agric. Food Chem. 49 (7), 3133-3133 (2001).</li>
<li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).</li>
<li>Robinson, A. R., Mansfield, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+poplar+lignin+monomer+composition+by+a+streamlined+thioacidolysis+procedure+and+near-infrared+reflectance-based+prediction+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of poplar lignin monomer composition by a streamlined thioacidolysis procedure and near-infrared reflectance-based prediction modeling.</a> Plant J. 58 (4), 706-706 (2009).</li>
<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant-cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward a systems approach to understanding plant-cell walls.</a> Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).</li>
<li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar%3A+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endo-transglycosylases%5BTitle%5D)+AND+%22Biocatalysis+and+Biotransformation%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endo-transglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li>
</ol>

記載された方法は、リグニン含量とリグノセルロース植物バイオマスの組成の迅速な定量的評価を有効にしてください。 iWallのロボットを使用して約350試料を粉砕し、日ごとに分配することができます。お一人様、様々な分析手法のスループットが異なります。プロトコルを使用すると、30サンプルを一日あたりのリグニン組成物のためリグニン含量のために処理し、15することができる、ここで説明する。データに最適な原料作物の定量的な性質のために、様々なまたは遺伝子型は、バイオ燃料生産のためのその適合性の観点で評価することができる。

<table><tbody><tr><td>塩酸ヒドロキシルアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255580</td><td></td></tr><tr><td>臭化アセチル</td><td>Aldrich</td><td>135968</td><td></td></tr><tr><td>エタンチオール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3708</td><td></td></tr><tr><td>三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体</td><td>Fluka</td><td>15719</td><td></td></tr><tr><td>N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド</td><td>Fluka</td><td>15241</td><td></td></tr><tr><td>ジオキサン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296309</td><td></td></tr><tr><td>Spectromax Plus 384</td><td>Molecular Devices</td><td>Plus384</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>6890 GC/5975B MSD</td><td>(リグニン組成)</td></tr><tr><td>5.5mm ステンレスボール</td><td>Salem Ball Company</td><td>(N/A)</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート用ヒートスプレッダー</td><td>Biocision</td><td>Coolsink 96F</td><td></td></tr><tr><td>ヒーティングブロック</td><td>Techne</td><td>Dri-block DB-3D</td><td></td></tr><tr><td>サンプル濃縮器</td><td>Techne</td><td>FSC400D</td><td></td></tr></tbody></table>

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートi：リグニン

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

産業と社会のための再生可能エネルギー、カーボンニュートラル、そして持続可能な原材料の必要性は、21世紀の最重要課題の一つとなっている。これは輸送用液体燃料の生産のための工業用原料としての植物製品の使用に関心を再燃させたている<sup&gt; 1</sup&gt;このようなbiocomposite材料として他の製品<sup&gt; 7</sup&gt;。植物バイオマスは地球上で最大の未開発の埋蔵量の一つである<sup&gt; 4</sup&gt;。それは主にセルロース、様々なヘミセルロース（マトリックス多糖類、およびポリフェノールリグニンを含むエネルギーリッチなポリマーで構成されている細胞壁で構成されています<sup&gt; 6</sup&gt;そのため、時にはリグノセルロースと呼ばれる。しかし、植物の細胞壁は、壁は細胞やプラント全体への引張強度を提供するように病原体を撃退、そして水は植物全体に輸送できるように、劣化への反抗的になるように進化して、最大の木の場合には上記より100メートルにグランドレベル。壁の様々な機能が原因で、単一工場内の異なる植物種や細胞タイプの城壁内に巨大な構造の多様性がある<sup&gt; 4</sup&gt;。したがって、どのような作物の種の種類により、作物の品種、又は植物組織がバイオリファイナリーのために使用され、液体バイオ燃料の化学的/酵素的プロセスと様々な糖のその後の発酵による解重合のための処理ステップを調整し最適化する必要があります。この事実を支える植物のバイオマス原料の徹底した特性評価のための必要性。ここでは、リグノセルロースの組成の決定を可能にし、ハイスループット分析への培地に適している包括的な分析方法を説明します。この最初の部分では、ポリフェノールリグニン（図1）の分析に焦点を当てる。このメソッドはdestarched細胞壁の材料を準備してから始まります。結果として得られるリグノセルロースは、acetylbromideの可溶化により、そのリグニン含量を決定するために分割されます<sup&gt; 3</supそのsyringyl、guaiacyl -およびp -ヒドロキシフェニル単位の面で&gt;、及びそのリグニン組成<sup&gt; 5</sup&gt;。セルロースの含有量とマトリックス多糖組成物を含むリグノセルロース系バイオマス中の炭水化物を分析するためのプロトコルは、パートIIで説明されています<sup&gt; 2</sup&gt;。

植物バイオマスは、バイオ燃料の生産に使用できる主要なカーボンニュートラルな再生可能な資源です。植物バイオマスは、主に細胞壁、リグノセルロースと呼ばれる構造的に複雑な複合材料で構成されています。ここでは、コンテンツとポリフェノールリグニンの組成の包括的な分析のためのプロトコルについて説明します。

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートI：リグニン

産業および社会にとって、再生可能でカーボンニュートラルかつ持続可能な原材料への需要は、21世紀における最も差し迫った課題の一つとなっている。

植物細胞壁のリグニン含有量および組成の決定は、乾燥させた植物試料にさまざまな抽出処理を行うことから始まります。得られた試料は細胞壁のみで構成されており、これを分画してリグニン含有量を測定します。細胞壁試料をブロモアセチルで加水分解し、可溶化したモノマーをUV分光光度計で定量することで、リグニン組成を決定します。細胞壁材料は細胞溶解によって加水分解されます。可溶化したリグニン成分は、その後、揮発性のトリメチルシリル誘導体に誘導され、ガスクロマトグラフィーと質量分析を組み合わせることで分離および定量が可能です。マトリックス多糖類の組成およびセルロース含有量の決定については、「Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part Two Carbohydrates（植物細胞壁の包括的な組成分析 第2部 炭水化物）」という別のビデオで実演しています。こんにちは。私はミシガン州立大学のグレートレイクス・バイオエネルギー研究センターにあるウォール分析施設の責任者、マーカス・ポーリーです。私は分析細胞壁施設のマネージャーを務めるクリフ・フォスターです。植物バイオマス試料の含有量および組成を決定する方法について解説します。植物は太陽からの光エネルギーをバイオマスなどの化学エネルギーに変換します。植物のバイオマスは主に細胞壁で構成されており、細胞壁はすべての植物細胞を包み込む多様なポリマーの複雑なネットワークです。ここでは、豊富に存在する再生可能資源であるこれらのリグニンCellose Xをバイオ燃料に変換する可能性を評価するため、植物細胞壁材料の組成を決定します。本日のビデオでは、「植物細胞壁の包括的な組成分析（第2部：炭水化物）」と題した別のビデオでポリフェノールであるリグニンについて取り上げます。ここでは多糖類分析に焦点を当てます。この手順を開始するには、2 mLのサレドスクリューキャップチューブに5.5 mmのステンレス製ボールを3個と、風乾または凍結乾燥させた植物試料を約60～70 mg加えます。材料は、粉砕・分注ロボットであるeyewallを用いて微粉末に粉砕できます。eyewallはチューブを取り込み、30秒間振とうします。内部のメタルボールによって材料が微粉末に粉砕され、その後、粉砕されて凝集した植物粉末をほぐします。代替案として、ロボットを使用しない低スループットの手順もあります。レトロの手法を容易にする手順はパート2で示します。粉砕した材料に1.5 Mの70% aqueous ethanolを加え、十分にボルテックスし、室温で遠心分離します。この処理により、ほとんどのタンパク質と細胞小器官が可溶化されます。上清を吸引し、アルコール不溶性ペレットに対して等量のクロロホルム・メタノール溶液を加えます。十分に振とうしてペレットを再懸濁し、遠心分離を行います。クロロホルム・メタノールによって脂質などの疎水性化合物が抽出されます。遠心分離後、上清を吸引し、ペレットを500 µLのアセトンで再懸濁します。サンプルを乾燥させるには、35 °Cの空気気流を用いて溶媒を蒸発させ、乾燥するまで待ちます。乾燥したサンプルは、次の処理まで室温で保存可能です。サンプル残渣からデンプンの除去を開始するには、ペレットを1.5 mLの0.1 M 酢酸ナトリウム（pH 5）に懸濁させ、チューブに蓋をして加熱ブロックで加熱し、デンプンを糊化させます。懸濁液を氷上で冷却した後、デンプン分解酵素ミックスを加え、チューブに蓋をして十分にボルテックスミキシングし、懸濁液を一晩インキュベートします。37 °Cのシェーカー内で、回転シェーカーを用いて適切に混合します。一晩のインキュベーション後、100 °Cのヒーティングブロックで10分間加熱し、消化を停止させます。その後、遠心分離を行い、可溶化デンプンを含む上清を廃棄します。前述の手順に従い、ボルテックス、遠心分離、デカンテーションを繰り返し、残りのペレットを1.5 mLの水で3回洗浄します。最後に、ペレットを500 µLのアセトンに再懸濁し、35 °Cの気流で溶媒を蒸発させて乾燥させます。単離された細胞壁またはセルロースを含まないレグニンを含む乾燥試料が完成し、以降の解析に使用可能です。これらの試料は室温で保存できます。まず、調製した細胞壁物質を1〜1.5 mg量り取ります。この物質は、手動で量り取るか、パート2で示すようにアイウォールを用いて自動的に量り取ることができます。チューブの壁面を250 µLのアセトンで洗浄して細胞壁物質をチューブの底に集め、気流下でアセトンを非常に緩やかに蒸発させます。アセトンが蒸発した後、新鮮に調製した25%（v/v）氷酢酸中臭化アセチル100 µLを、容器の壁面に沿ってゆっくりと加えます。液跳ねを防ぐため、少量ずつ加えてください。臭化物はリグニンポリマーをアセチル化されたモノマーに分解します。その後、メスフラスコに蓋をし、50 °Cで2時間加熱します。さらに1時間加熱し、15分ごとに4回振とうした後、最終的に氷上で冷却します。室温まで冷却した後、フラスコに2 M 水酸化ナトリウム 400 µLと、調製直後の0.5 M ヒドロキシルアミン塩酸塩 70 µLを加え、メスフラスコをボルテックスします。次に、氷酢酸を用いてメスフラスコの2 mL標線まで正確に満たし、溶液を中和させます。キャップを閉め、数回反転させて混合します。加水分解および可溶化したモノリスを含む溶液 200 µLをUV専用の96ウェルプレートにピペッティングし、マイクロプレートリーダーを用いて280 nmで測定します。粒子によって吸光度にわずかな変動が生じる可能性があるため、プレートを少なくとも3回読み取り、吸光値の平均を算出します。書面によるプロトコルに提示された式を用い、適切な植物係数を使用して、臭化物可溶性リグニン（BSL）の割合を決定します。リグニンは主に p-ヒドロキシフェニル、グアイアシル、シリンギル単位の3つのサブユニットで構成されるポリフェノールネットワークであり、植物試料中のリグニン組成を決定します。まず、約 2 mg の細胞壁材料を、細胞溶解用のねじ蓋付きガラスチューブに移します。次に、2.5% ボロン三フッ化物エチルエーテルおよび 10% エタンチオールジオキサン溶液の調製準備を行います。ジオキサンは非常に危険であるため、サンプルや器具をフードの外に持ち出さないでください。細心の注意を払って作業し、窒素ガスを満たしたバルーンを使用して、ジオキサンボトルの減少した容量を窒素で置換してください。1サンプルあたり、175 µLのジオキサン、20 µLのETSH、5 µLのBF3を混合して溶液を調製します。混合後、各サンプルにこの溶液を200 µLずつ加えます。バイアルのヘッドスペースを窒素ガスでパージし、キャップを閉めます。直ちにサンプルを100 °Cで4時間加熱し、1時間ごとに緩やかに混合します。その後、溶血反応を氷上で5分間停止させます。次に、中和のために0.4 M 重曹（炭酸水素ナトリウム）を150 µL加え、ボルテックスミキサーで撹拌します。リグニン分解産物の精製のため、1 mLの水と0.5 mLの酢酸エチルを加え、ボルテックスした後、相分離させます。酢酸エチルの層が上層に、水層が下層になります。リグニン成分を含む上層の酢酸エチル層から150 µLを、水が混入しないように注意して2 mLチューブに移します。上層の酢酸エチル層を回収した後、エア濃縮機を用いて溶媒を蒸発させます。アセトンを200 µL加え、蒸発させます。過剰な水分を除去するため、このアセトンによる処理を2回繰り返します。次に、リグニン成分を揮発性のトリメチルシリル誘導体に誘導します。各チューブに500 µLの酢酸エチル、20 µLのピリジン、および100 µLのN,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミドを添加します。25 °Cで2時間インキュベートします。2時間後、反応液100 µLをGC MSバイアルに移し、100 µLのアセトンを加えます。四重極質量分析計または水素炎イオン化検出器を備えたGCを用いてサンプルを分析します。カラムおよび分析条件の詳細については、付属の書面プロトコルを参照してください。ポプラ材を植物材料として用いたリグニン分析の代表的な結果を以下に示します。この分析によると、ポプラ材料の22%がポリフェノールリグニンで構成されています。リグニン成分の組成はGCMSによって分析されました。ピークの同定は、内部標準としてテトラコサンを用い相対的な保持時間に基づいて行うか、またはsgおよびhモノマーに特有の質量スペクトルイオンである2 99 MZ、2 69 MZ、および2 39 MZを用いて行います。リグニン成分の組成は、総ピーク面積を100%として定量します。組成分析の結果、この特定のサンプルには主にシリンギル（S）ユニットが含まれていることが示されました。しかしながら、グアイアシル（G）ユニットも豊富に含まれています。当然ながら、量およびモノリグニトール単位の組成は、植物組織や種によって異なります。ここでは、多糖類分析のための植物材料のリグニン含有量および組成を決定する方法について説明しました。パート2へ進んでください。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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生物学

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本研究の目的は、nanocelluloseフィブリル、希水性懸濁液から組み立てられた単離されたリグニンのレイヤーバイレイヤーアセンブリを使用して合成植物細胞壁組織を形成することであった。水晶振動子マイクロバランスおよび原子間力顕微鏡の表面測定技術は、ポリマー - ポリマーナノ複合材料の形成をモニターするために使用した。...

Nanocellulose、リグニンから製造自立フィルム、合成ポリカチオン：Biomimickingウッドに向けて

二本鎖RNA干渉（dsRNAi）技術は、より低い植物リグニン含量にトウモロコシシンナモイル補酵素Aレダクターゼ（ZmCCR1）遺伝子をダウンレギュレートするために採用される。細胞壁からのリグニンのダウンレギュレーションは、顕微鏡分析によって可視化しクラソン法により定量される。ヘミセルロースおよび結晶セルロース中の組成変化を分析する。...

のリグニンダウンレギュレーション<em&gt;トウモロコシ</em&gt; dsRNAiとクラソンリグニン分析によって

植物細胞壁の組成は組織タイプによって異なり、リグニン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチンを含むことができます。細胞種レベルでの違いを可視化するために、さまざまな染色技術が開発されてきました。この論文は、一般的に使用される細胞壁染色技術をまとめたものです。...

の組織化学的染色<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;二次細胞壁の要素

植物の細胞壁の構造と化学的特性が評価され、バイオ燃料とバイオマテリアルの理想的な原料を特定します。標準メソッドを大規模なデータセットに適用すると、制限があります。これらのハイスループット前処理法、酵素糖化法、および熱分解分子ビーム質量分析法は、実験時間とコストを削減しながら、大量のバイオマスサンプルを比較します。...

リグノセルロース系バイオマス中の反抗バリエーションのハイスループットスクリーニング：総リグニン、リグニンモノマー、および酵素シュガーリリース

このプロトコルは、ラマンイメージングおよび多変量解析を用いて、植物細胞壁のリグニン、セルロースおよびヘミセルロースを視覚化するための一般的な方法を提示することを目的とする。...

ラマンイメージングと多変量解析を組み合わせて、植物細胞壁のリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを視覚化する

ブリス、木質化のダイナミクスを研究するためのデュアル ラベル プロトコルが開発されました。合成モノリグノールを使用して記者と SPAAC と CuAAC bioorthogonal の連続の組み合わせ反応、この方法論は、 planta...

化学のをクリックして、植物の木質化のダイナミクスを可視化する: 二重分類は至福である!

ここでは、草本植物バイオマスにおけるリグニン含量の推定のための改変TGA法を提示する。この方法は、リグニンと特定のチオエーテル結合を形成することによってリグニン含有量を推定し、リグニン含有量推定のために比較的小さなサンプルを必要とするため、クラソン法よりも有利である。...

チオグリコール酸(TGA)を用いた植物バイオマスリグニン含量の推定

リグニンとタンニンの定量 31P NMR分析

学ぶ植物細胞壁のリグニン含有量と組成分析の手法。アセチルブロミド加水分解とUV分光光度法、ガスクロマトグラフィー質量分析を用いて、バイオ燃料生産のためのリグノセルロース系バイオマスの評価を行う方法です。

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートI：リグニン

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