植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートI：リグニン

植物細胞壁のリグニン含有量と組成の決定は、さまざまな抽出にかけられる乾燥植物材料から始まります。得られた材料は細胞壁のみで構成され、その後分割されてリグニン含有量が決定されます。壁材を臭化アセチルによる加水分解にかけ、可溶化されたモノラルをUV分光法で定量してリグニン組成を決定します。

壁材は細胞溶解によって加水分解されます。可溶化されたリグニン成分は、揮発性の生理食塩水トリメチル誘導体に誘導され、ガスクロマトグラフィーと質量分析を組み合わせて分離および定量できます。マトリックス多糖類の組成とセルロース含有量の測定は、植物細胞壁の包括的な組成分析、パート2炭水化物と題された別のビデオで実証されています。

こんにちは、私はマーカス・ポーリーで、ここミシガン州立大学の五大湖バイオエネルギー研究センターの壁分析施設の責任者です。私は分析細胞壁施設のマネージャーであるクリフ・フォスターです。植物バイオマスサンプルの含有量と組成を決定する手順をお見せします。

植物は太陽からの光エネルギーをバイオマスなどの化学エネルギーに変換します。植物バイオマスは、主に細胞壁、つまりすべての植物細胞を包むさまざまなポリマーの複雑なネットワークで構成されています。ここでは、非常に豊富な再生可能資源であるこれらのリグニンCellose Xをバイオ燃料に変換する可能性を評価するために、植物細胞壁材料の組成を決定します。

今日は、ポリフェノールリグニンに焦点を当てます 植物細胞壁の包括的な組成分析、パート2炭水化物というタイトルの別のビデオ。ここでは、多糖類の分析に焦点を当てます。この手順を開始するには、5.5ミリメートルのステンレス鋼球3個を2ミリリットルのサレドスクリューキャップチューブと約60〜70ミリグラムの空気または凍結乾燥植物材料に加えます。

材料は、粉砕および分配ロボットであるアイウォールを使用して微粉末に粉砕することができます。アイウォールはチューブを取り、30秒間振とうしますが、金属球により、材料は微粉末に粉砕され、次に粉砕されますが、コンパクトな植物粉末は、代替の非ロボット低スループット手順で緩められます。レトロの促進は、パート2で提示され、1.5 Mの70%水性エタノールを粉砕材料のボルテックスに完全に加え、室温で遠心分離します。

この処理は、ほとんどのタンパク質と細胞小器官を可溶化し、上清を吸引し、体積に1対1の体積を追加します。アルコール不溶性ペレットにクロロホルムメタノール溶液をよく振ってペレットを再回転させ、遠心分離します。クロロホルムメタノールは、遠心分離後に脂質などの疎水性化合物を抽出し、上清を吸引し、ペレットと500マイクロリットルのアセトンを再懸濁します。

サンプルを乾燥させるために、乾燥するまで摂氏35度の空気の流れで溶媒を蒸発させ、乾燥させたサンプルをさらに処理するまで室温で保存することができます。サンプルreusからのデンプンの取り外しを開始するには、ペレットと0.1モル酢酸ナトリウムpH 5キャップの1.5ミルをチューブに懸濁し、デンプンをゼラチン化するために加熱ブロックでそれらを加熱します。懸濁液を氷上で冷却した後、でんぷん分解酵素ミックスを加え、チューブにキャップをして、懸濁液を一晩で十分にインキュベートします。

摂氏37度のシェーカーでは、回転シェーカーが適切な混合を保証します。一晩のインキュベーション後、摂氏100度の加熱ブロックで10分間加熱することにより、消化を終了します。次に、可溶化デンプンを含む上清を遠心分離して廃棄します。

残りのペレットを、前に示したようにボルテックス、遠心分離、およびデカンテーションにより、毎回1.5ミルの水を使用して3回洗浄します。最後に、ペレットを500マイクロリットルのアセトンに再懸濁し、乾燥するまで摂氏35度の空気の流れで溶媒を蒸発させます。分離された細胞壁または脚を含む乾燥サンプルは、セルロースがさらに分析する準備ができておらず、室温で保存することができます。

まず、調製した細胞壁材料の1〜1.5ミリグラムの重量を量ることから始めます。材料は、手作業で計量することも、パート2で示したようにアイウォールを使用して自動的に計量することもできます。チューブ壁を250マイクロリットルのアセトンですすいで、チューブの底に細胞壁材料を集め、エアフロー下でアセトンを非常に穏やかに蒸発させます。

アセトンが蒸発した後、2つの壁に沿って氷酢酸中の臭化アセチルを体積に100マイクロリットルの25%容量に加えます。飛散を防ぐために、微妙な臭化物がリグニンポリマーをアセチル化モノに分解します。次に、メスフラスコに蓋をし、摂氏50度で2時間加熱します。

15分ごとに4つのテキストメッセージでさらに1時間を加熱し、最後に氷上で冷却します 室温でフラスコを冷却した後、400マイクロリットルの2モルの水酸化ナトリウムと70マイクロリットルの新たに準備された0.5モルのヒドロキシルラミン塩酸塩渦、容積フラスコを追加します。次に、氷酢酸キャップで容量フラスコを2ミリリットルのマークまで正確に充填して溶液を中和し、数回反転させて、加水分解および可溶化モノラルを含む溶液の200マイクロリットルをピペットでUV特異的な96ウェルプレートに混合し、ウェルプレートリーダーで280ナノメートルのプレートを読み取ります。プレートを少なくとも3回読み取り、微粒子が吸光度値のわずかな変動を引き起こす可能性があるため、吸光度を平均化します。

書面によるプロトコルに示されている式で適切な植物係数を使用して、微妙な臭化物可溶性リグニンまたはA BSLの割合を決定します。リグニンは、植物材料中のリグニンの組成を決定するために、主に3つのサブユニット、Pヒドロキシフェノール、グアACell、および春巻きユニットで構成されるポリフェノールネットワークです。まず、細胞溶解のために約2ミリグラムの細胞壁材料をスクリューキャップ付きガラス管に移します。

次に、2.5%三フッ化ホウ素エチルアテとジオキサン中の10%エタンチオール溶液を調製する準備をします。ジオキサンは非常に危険ですので、ボンネットからサンプルや機器を取り出さないでください。非常に慎重に作業し、窒素ガスで満たされたバルーンを使用して、ジオキサンボトル内の失われたボリュームを窒素で置き換えることを忘れないでください。

サンプルごとに175マイクロリットル、ジオキサン20マイクロリットル、ETSH5マイクロリットル、BF3のボリュームを混合して溶液を調製します。混合後、各サンプルに200マイクロリットルの溶液を加えます。バイアルのヘッドスペースを窒素ガスとキャップでパージします。

すぐにサンプルを摂氏100度で4時間加熱し、1時間ごとに穏やかに混合します。テオエース溶解は氷上で5分間反応します。次に、150マイクロリットルの0.4モル重炭酸ナトリウムを加えて中和し、渦巻きにします。

リグニン分解生成物のクリーンアップには、1ミルの水と0.5ミルのアセテートボルテックスを追加し、相を分離させます。酢酸エチル層が上部にあり、下部に水があります。リグニン成分を含む最上部のエセルアセテート層の150マイクロリットルを2ミルのチューブに移し、水が移動しないことを確認します。

最上部のエセルアセテート層からの転写に続いて、空気を含む濃縮器を使用して溶媒を蒸発させます。200マイクロリットルのアセトンを加えて蒸発させます。アセトンで治療を2回繰り返して、余分な水分を取り除きます。

次に、リグニン成分を揮発性トリメチルCy Lane誘導体に誘導します。500マイクロリットルの酢酸エチル、20マイクロリットルのプリン、および100マイクロリットルのNOビストリメチルシルアセトアミドを各チューブに追加します。.摂氏25度で2時間インキュベートします。

2時間の終わりに、反応液100マイクロリットルをGC MSバイアルに移し、アセトン100マイクロリットルを添加します。クワッド質量分析計または水素炎イオン化検出器を備えたGCでサンプルを分析します。実行の列と詳細については、添付の書面によるプロトコルを参照してください。

ここでは、ポプラ材を植物材料としたリグニン分析の代表的な結果をご紹介します。この分析によると、ポプラ材の22%はポリフェノールリグニンで構成されています。リグニン成分の組成をGCMSで分析した。

ピークは、テトラコーン内部標準を使用して相対保持時間によって、またはsgモノマーとhモノマーのそれぞれ2、99 MZ、2、69 MZ、および2 39 MZの特性質量スペクトルアイコンによって識別されます。リグニン成分の組成は、総ピーク面積を100%に設定することで定量化されます組成分析は、この特定のサンプルが主にストリングまたはSユニットを含んでいることを示しています。ただし、ゴヤやアオール、Gユニットも豊富です。

明らかに、量とモノラルユニットの組成は、植物の組織や種によって異なります。多糖類の分析のために、植物材料のリグニン含有量と組成を決定する方法を示しました。パート2に進んでください。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。