Name: 抗体標識用ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャの準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学ぶ ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャ調製法。Drosophila melanogasterの唾液腺を解剖し、乳酸酢酸溶液で圧縮して抗体標識に適した染色体標本を作製する技術を解説。遺伝子発現研究に有用です。

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私たちは、ハエの株式の維持のために氏V. Lephartに感謝この作品は、健康補助金（GM62916）と国立科学財団の助成金（MCB0817107）のための国立研究所によってサポートされていました。

多糸染色体のスカッシュの準備のための以下のプロトコルは、ヨハンセン氏らに記載された手順から構成されている。 （2009）。 1。三齢ショウジョウバエの幼虫の文化高品質のスカッシュの準備に最適な多糸染色体を得るために、混雑していない培養条件は、（すなわち、20産卵標準4のメスのハエが"毎日新しいボトルにボトルや変更を飛ぶ程度の場所）が不可欠です。太った人を選択します。彼らはまださまよっている間に3齢幼虫を登るの最初の収穫からではなく、蛹化直前に我々日常的に文化で21 ° C、18 ° Cはバンドは/例えばのようないくつかの目的にはより適している可能性がありますファット染色体が得られますバンド間の領域は、高分解能で可視化する必要があります。 2。多糸スカッシュ材料<ul><li>ドラモンド郭清の鉗子（2） </li><li>ペトリ皿（60 × 15 mm）の</li><li>曇らされた顕微鏡スライド（フィッシャー番号12-544-3）（ポリ-リジンコート） </li><li> 22 × 22 mmの15号のカバースリップ（フィッシャー番号12 - 520B）（Sigmacoteでコーティングした、シグマ＃SL2） </li><li> 22 × 40mmの15号のカバースリップ（フィッシャー番号12 - 530B） </li><li>金、ワイプ</li><li> 20倍対物レンズと位相差顕微鏡</li><li>小さなデュワー（例えば、真空フラスコまたは魔法瓶） </li><li>長い鉗子</li><li>剃刀の刃</li><li>コプリンジャー</li><li>ラバーメイドやタッパーウェアトレイ（または同等の密閉式トレイ） </li><li>パラフィルム（22 mmの正方形にカット） </li><li> 175グラムの重み</li></ul> 3。固定液とソリューション<ol><li> 5Xホルムアルデヒドの株式。 0.74 gの新鮮な溶液を調製しますのdH 2 O 4.0 mlのと1N KOHの28μLとパラホルムアルデヒド。 65℃くらいまで温めパラホルムアルデヒドを溶解し、氷上で保存する。 </li><li>固定液1。 5Xホルムアルデヒドの在庫から0.5ミリリットル10 × PBS、50μlのトリトンX - 100、3.45ミリリットルのdH 2 Oおよび1.0 mlの新鮮な溶液を調製します。トリトンX - 100を分散し、1時間以内に使用して暖かい。 </li><li>固定剤2。 1.5ミリリットルのdH 2 O、2.5ミリリットル氷酢酸、および1時間以内に5倍のホルムアルデヒドの株式や使用から1.0mlの新鮮な溶液を調製します。 </li><li> Lactoacetic酸溶液。 1ミリリットル乳酸、2ミリリットルのdH 2 O、および3mLの酢酸溶液を調製します。 </li></ol> 4。多糸染色体のスカッシュの準備： <ol><li>水で幼虫をすすぎ、解剖のための組織培養皿にPBSに移す。 </li><li>口の先端が鉗子一対のフック、他のペアと方法ダウンの約2 / 3体を保持つかみ、そして口を引っ張らないので唾液腺が露出しているフック。唾液、脳から腺と目触角ディスクを分離し、腺から脂肪体および他の関連する組織を離れて分析する。 </li><li>つのよくうつ病のスライドと同様に2〜固定液2の200から300マイクロリットルの最初のウェルに固定液1の200マイクロリットルを追加。よくいずれかの固定液を1に一度唾液腺の一つのペアを転送し、通常1〜2分程度の標的エピトープに必要な時間、インキュベートする。 （注：そのようなヒストン修飾のほとんどのようないくつかのエピトープは、、5分以上固定が必要な場合があります。） </li><li>使用して鉗子は、ウェル2の固定剤2に唾液腺を転送し、2分間インキュベートする。 </li><li>クリーンSigmacotedカバースリップ上でLactoacetic酸溶液の10〜30μlに腺を転送する。静かにカバースリップ上にポリリジンでコーティングされた顕微鏡スライドを下げると、腺がスライドとカバースリップの間になるように垂直方向の圧力を適用せずに、カバースリップを拾う。 直ちに慎重に一辺上にピンセットでカバーグラスを把握し、細胞溶解と拡散染色体を容易にするゆっくりと組織上の任意の縦の圧力を最小化しようとし、少し前後に移動する。あるいは静かに前後にカバースリップを移動するにも消しゴム鉛筆の側面や指先を使う。前後にカバースリップを移動するの遅れは、彼らがLactoacetic酸溶液に曝されると、より剛性になる傾向があるので染色体腕の広がりを減少させる可能性があることに注意してください。ソリューションの混濁は、多くの場合、細胞分離の良い兆候です。ゆっくりと数回にも広がって染色体を助けることができる鉛筆の消しゴム側で（垂直方向の圧力を避けるために）斜めにカバースリップをタップします。 </li><li>すぐに染色体が十分に広がっているかどうかを判断するために20または40倍の目標との位相差顕微鏡下で組織を調べます。 </li><li>拡散染色が十分であるときに、きれいな金 - ワイプのスタック上にカバースリップの側でスライドを下に設定します。せん断の場合とカバースリップのいずれかの水平移動を避け、第二の上に金がワイプとカバースリップが配置されている場所の上に親指を置き、しっかりと押すことで染色体を平坦に置きます染色体。 </li><li>準備が意図した目的に適しているかどうかを判断するために顕微鏡下で再びスライドを調べます。染色体が退治時に大幅に移動した場合は、あなたのその後の準備にLactoacetic酸溶液の少ない量を使用してください。適当なスライドの十分な数が得られるまで繰り返し、4.1から4.8を繰り返します。スライドのカバースリップ上175グラムのウェイトを置きます。 </li><li>液体窒素で小さなデュワー（例えば、魔法瓶を）埋める。長い鉗子を使用して、液体N 2へのディップスライドは、沸騰が停止するまで、スライドを削除し、そして即座にカバースリップをオフに反転する一角で、きれいなカミソリの刃のエッジを使用してください。 4℃のPBSでコプリンジャーにスライドをすぐに使用する場合、場所℃にそうでなければ95％エタノールで満たされたコプリンジャーにスライドを収集する。霜が組織をス​​ライドに付着し、カバースリップで残っていないことを確認するために離れて昇華した後にカバースリップを調べます。すべてのスライドをPBS（数時間内で使用する）または、エタノール（長期保管用）のいずれかに格納されるまで、スライドの残りの部分で繰り返します。 </li></ol>代表的な結果高品質の多糸押しつぶし標本を得るための最初の重要なステップは、大きな唾液腺の核と脂肪幼虫を成長させることです。二つ目はある程度の練習がかかる場合が拡散手続き、との良好なテクニックです。改良された拡散成功のための一つの先端は潰しステップ中lactoacetic酸溶液の最小限の量を見つけることです。これまでは染色体の腕を洗うこと、過度のストリーミング力を発生させることなく染色体の広がりを十分推進していきます。また、前後にカバースリップを動かす上でのいかなる遅延もLactoacetic酸溶液にさらされたとき、彼らはより剛性になるように染色体の腕の広がりを減少させることは注目に値する。 すべてがうまくいけば、多数のよく広がった多糸染色体があるはずです。図1は、二重緑のバンド間の領域のためのマーカーとし、色素で標識された、そのような準備の例を示している汚れ青の縞模様の地域。不十分な拡散が得られた場合、染色体は、図2に示すように、小さなボールのようになります。一方、あまり拡散が発生した場合、chomosomesは薄すぎると、拡張または図3に示すように、細かく断片化いくつかのケースになります。 <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> ダブルJIL - 1ヒストンH3S10キナーゼ（赤）とヘキスト（青色）に対する抗体で標識図1。多糸スカッシュの準備。 <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 不十分な拡散と図2。多糸スカッシュ。 <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。すぎる広がりを持つ多糸スカッシュ。

<ol><li>Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-mediated+transcription+at+active+loci+does+not+require+histone+H3S10+phosphorylation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila.</a> Development. 135, 2917-2925 (2008).</li>
<li>DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+GFP-fusion+proteins+on+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Dros.+Inf.+Serv%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes.</a> Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).</li>
<li>Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+transcription+and+epigenetic+chromatin+modification+in+Drosophila+polytene+chromosome+squash+preparations+using+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies.</a> Methods. 48, 387-397 (2009).</li>
</ol>

従来のスカッシュ固定プロトコルの酢酸と乳酸を含めることは、拡散バンド間分解能と染色体腕の両方を促進するが、残念ながら、いくつかのエピトープは、この治療を生きていけない。そのようなエピトープの例は、H3S10ph（カイら 、2008）である。酸処理はまた、GFPタグ融合タンパク質、DiMario らの固有の蛍光を消光するという欠点を持っているので。 （2006）最近、GFP -抗体標識なしと同様に酸感受性エピトープの抗体検出のための多糸染色体上にGFP -融合タンパク質の直接可視化を可能にするホルムアルデヒドベースの&quot;酸無スカッシュの技術&quot;を開発。この手順の変更は、さらにヨハンセンらに詳細に記載されている。 （2009）。代表的な酸は二重抗体で標識された多糸押しつぶし標本を固定するためにJIL - 1ヒストンH3S10キナーゼ及びヘキストは、図に示されています。 1。

抗体標識用ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャの準備

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

ショウジョウバエは、長いクロマチン構造と三齢幼虫の巨大な唾液腺多糸染色体で提供される細胞診の利点のための遺伝子調節の関係を研究するためのお気に入りのモデルのシステムとなっています。この組織では染色体は、約1000枚を生じさせる細胞分裂がない場合の複製の多くのラウンドを受ける。 DNAは、特定のタンパク質の局在化とクロマチン形態を相関させるユニークな機会を提供大幅に拡大された染色体で、その結果、各複製サイクルの後に整列されたまま。その結果、別の遺伝子で、転写プロセスの異なる段階で存在するエピジェネティックな修飾を定義することに関心の高いレベルがあった。このような研究のための重要なツールは、酵素に対する抗体を持つ多糸染色体のラベリング、転写因子、または関心のヒストン修飾です。このビデオプロトコルは、抗体の標識にショウジョウバエ多糸染色体を準備するヨハンセンの実験室で使用されているスカッシュのテクニックを示しています。

このビデオプロトコルは準備するヨハンセン実験室で使用されているスカッシュのテクニックを示しています。<em&gt;ショウジョウバエ</em抗体標識用&gt;多糸染色体。

ショウジョウバエ（Drosophila）は、その細胞学的特性から、クロマチン構造と遺伝子調節の関係を研究するための好ましいモデルシステムとして長らく利用されてきました。

この手順は、フライボトル内で、脂肪分が多く這行性のショウジョウバエ3齢幼虫を培養することから始まります。2組のピンセットを用いて、幼虫から唾液腺を解剖して取り出します。その後、2ウェルの凹型スライドガラスを用いて、2種類の異なる固定液で唾液腺を固定します。最後に、腺を乳酸酢酸溶液中でカバーガラスと顕微鏡スライドガラスで押し潰します。こんにちは、アイオワ州立大学の生化学・生物物理学・分子生物学部で研究しているKristen Johansen博士です。こんにちは、Johansen研究室の大学院生TAです。本日は、抗体標識に適したショウジョウバエの多糸染色体スクワッシュ標本の作製手順をご紹介します。当研究室では、この手法を用いてエピジェネティックなヒストン修飾と、クロマチン構造および遺伝子発現との関係を研究しています。それでは、始めていきましょう。高品質なスクワッシュ標本を作成するために最適なポリテン染色体を得るには、混雑のない培養条件が不可欠です。標準的な4インチのショウジョウバエボトルに、産卵期のメスを約20匹入れ、毎日新しいボトルに更新してください。ほとんどの目的には21°Cでの培養で十分ですが、18°Cでインキュベーションすると、より太い染色体が得られます。これは、バンド間領域を高解像度で可視化する必要がある場合など、一部の実験に適しています。第1回に脱皮した3齢幼虫の中から、最も太った個体を選別します。幼虫は、摂食を停止する直前の徘徊期に、ボトルの壁面の餌より上の位置で容易に確認できます。ピンセットを用いて、幼虫を組織培養皿に移してください。潰し操作を1回行うごとに、2〜3匹の幼虫を水で一緒にすすぎ、解剖用にPBSを入れた清潔なシャーレに移します。PBSは幼虫が浸かる量を用意しますが、時間に制約はありません。幼虫はこのような条件下で数時間生存できるため、PBSを入れた幼虫のシャーレを解剖顕微鏡のステージ上に置き、ピンセットを1組用意します。体を保持しながら、口鉤の先端を掴みます。別のピンセットで、口鉤から約3分の2下の位置を挟み、口鉤を引っ張って唾液腺を露出させます。唾液腺を脳、眼、およびtenal discsから分離し、脂肪体およびその他の関連組織を切り出します。2ウェル陥凹スライドの1番目のウェルに200 µLの固定液1を、2番目のウェルに200～300 µLの固定液2を加えます。ピンセットを用いて、唾液腺を1ペアずつウェル1の固定液1に移し、標的エピトープに必要な時間（通常は約1～2分）インキュベートします。唾液腺を、ウェル2の固定液に転送し、2分間インキュベートします。ピンセットを使用して、腺を、10から30 µLの調製したばかりの乳酸酢酸溶液が入った清潔なシグマコートカバーガラスに転送します。ポリリシンコートした顕微鏡スライドを、カバーガラスの上にそっと下ろします。液体がガラスに密着していることを利用して、垂直方向に圧力をかけないように注意しながら、カバーガラスを巻き込んでスライドを慎重に持ち上げます。染色体を即座に分散させるため、ピンセットでカバーガラスの端を慎重に掴み、ゆっくりとわずかに前後に動かします。組織への垂直方向の圧力を最小限に抑えつつカバーガラスを揺らすことが、唾液腺の個々の細胞を適切に分離させるために重要です。鉛筆の消しゴム側でカバーグラスを斜めに軽く叩くと、溶液の広がりを助けることができます。溶液が白濁していることは、多くの場合、細胞が分離している良い指標となります。位相差顕微鏡で速やかに組織を観察し、染色体腕が明確に分離・伸展しており、染色体が十分に分散していることを確認してください。一度目の操作で染色体が十分に分散していない場合は、再度調整を行ってください。十分な広がりが得られるまで、カバーガラスを軽く叩く操作を繰り返してもかまいません。スライドを、カバーガラス側を下にして清潔なキムワイプの束の上に置きます。プレパレーションの上に清潔なワイプを置きます。カバースリップの位置に親指を置き、まっすぐ強く押し下げます。染色体をせん断させる恐れがあるため、水平方向の動きは避けてください。顕微鏡でスライドを再確認し、現在の実験に適しているか判断します。十分な数のスライドを得るために、解剖と染色体押し潰し標本の作製を繰り返します。長いピンセットを使用して、スライドのカバーガラスの上に175 gramの重りを置きます。準備したスライドを少量の液体窒素に浸し、沸騰が止まるまでそのまま保持します。スライドを取り出し、直ちに清潔なカミソリの刃の端をカバーガラスの角の下に入れ、跳ね上げるようにして取り除きます。すぐに使用する場合は、冷PBSを満たしたコプランジャーに、長期保存する場合は95% ethanolを満たしたコプランジャーにスライドを回収してください。霜が昇華した後、カバーガラスを確認し、組織がスライドに付着したままであることを確認します。高品質なINEスクワッシュ標本を作成するための最初の重要なステップは、大きな唾液腺核を持つ太った幼虫を育成することです。2つ目は、展延操作における適切な技術であり、これにはある程度の練習が必要な場合があります。展延の成功率を高めるためのヒントの一つは、スクワッシュのステップにおいて、乳酸酢酸溶液の最小容量を見つけることです。これにより、染色体腕を洗い流してしまうような過剰なストリーミング力を発生させることなく、染色体を十分に広げることができます。また、カバースリップを前後に動かす操作に遅れが生じると、乳酸酢酸溶液にさらされた染色体腕が硬くなるため、広がりが悪くなることに注意してください。各スライドの操作が適切に行われれば、十分に広がった多数の多糸染色体が観察されるはずです。ここでは、インターバンド領域を赤色で、バンド領域を青色で染色した、このような二重標識標本の例を示します。十分に展展されなかった場合、染色体はここに示すように小さな球状に見えます。一方で、展展されすぎた場合、染色体は細長く伸びすぎたり、場合によってはここに示すように小さな断片に分断されたりします。以上で、ショウジョウバエの唾液腺染色体潰し標本の作製方法を説明しました。この手順を行う際は、太った幼虫から始めることが重要であるという点に注意してください。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。

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