Name: クリストファーヒューズ：血管新生の研究のためのin vitroモデル（インタビュー） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 学ぶ血管新生のin vitroモデル。繊維芽細胞と血管内皮細胞の相互作用を用いて、管腔形成と吻合を伴う血管ネットワーク構築のメカニズムを解明する方法です。

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クリストファーヒューズ：血管新生の研究のためのin vitroモデル（インタビュー）

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

クリストファーCWヒューズは、in vitroでの血管新生を研究するための彼の培養システムのユーティリティについて説明します。彼は、ブランチ、適切なルーメンを形成する、とanastamosisを受けることを内皮細胞が培養中の血管を形成するための重要な、まだ未確認の、可溶性因子を分泌する線維芽細胞の重要性を説明しています。

Christopher C.W. Hughesが、in vitroでの血管新生研究における自身の培養系の有用性について解説します。彼は、……である線維芽細胞の重要性について説明します。

こんにちは、クリストファー・ヒューズ博士です。私はカリフォルニア大学アーバイン校の教授であり、私の研究室では血管新生の研究を行っています。私たちは特に、血管新生のプロセスを制御する遺伝子に関心を寄せています。当社ではNelsonらの研究に基づいたin vitroアッセイを最適化しました。このアッセイを用いることで、血管新生中に起こるあらゆる異なるプロセスを観察することが可能です。まず、Tedexビーズという小さなビーズに血管内皮細胞をコーティングします。次に、これらをフィブリンゲルに封入し、成長因子を添加します。そして数日かけて、内皮細胞がビーズから発芽します。細胞は移動し、整列し、増殖して管を形成し、分枝して吻合を形成します。これにより、約10日後には、培養液中に完全な毛細血管のようなネットワークが構築されます。例えば、マウスを用いて行われるin vivoの血管新生アッセイには、システムの操作が非常に困難であるという問題があります。動物の体内で何が起きているかを可視化することは難しく、血管新生が進行する様子を直接観察することはほぼ不可能です。一方、in vitro培養であれば、内皮細胞を遺伝的に操作して遺伝子のオン・オフを切り替えることが容易であり、それらが出芽性血管新生に及ぼす影響を詳細に検証することができます。そして、個体全体でそれを行うことははるかに困難です。ノックアウトやノックインを作成する必要があります。したがって、これらが2つの大きな利点となります。操作が容易であり、視覚化もしやすいため、長年にわたり数多くの異なるインビトロ血管新生アッセイが開発されてきました。それらにはそれぞれ長所と短所があります。特に有名なものとして、Matrigelと呼ばれる細胞外マトリックスの上に血管内皮細胞を配置するマトリジェルアッセイが挙げられます。そこでの問題は、血管内皮細胞が索状構造を形成するものの、適切に腔化された血管を形成しないことです。出芽や吻合は見られません。これに対し、有効な手法としてコラーゲンゲルモデルがあります。多くの場合、内皮細胞の増殖は見られません。また、吻合が起こる傾向もありません。私たちが開発したフィブリンゲルアッセイは、90年代半ばにNelson Karによって発表されたモデルに基づいています。そして現在、私たちはそれを大幅に改善し、血管新生のすべての段階を観察できるようになりました。初期の発芽や遊走を観察できます。また、細胞の増殖や管腔形成を確認でき、分枝が起こり、最終的に吻合することで、in vitroで完全な血管ネットワークが形成されます。したがって、このアッセイは、血管新生のこれらすべての異なる段階を観察したい場合に、現在利用可能な最高の実験室系（in vitro system）であると考えています。このin vitroアッセイのもう一つの利点は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）が実施可能であることです。培養物を遠心分離して非常に平坦にした後、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション顕微鏡を使用します。これにより、個々の細胞を実際に取り出すことができ、特に私たちはチップ細胞（tip cells）に関心を寄せています。このようにそれらを切り出すことで、特に先端細胞（tip cells）と、実際に管腔を形成している幹細胞（trunk cells）における遺伝子発現を調べることができます。我々の仮説では、これら2つの細胞集団間で遺伝子発現に差異があると考えています。生体内（in vivo）システムではほぼ不可能な解析ですが、この方法であれば検討することが可能です。したがって、このin vitroアッセイを使用することには、もう一つの大きな利点があると考えられます。前述のNelson Reconらによる初期の研究では、微小血管内皮細胞が使用されていました。in vivoにおいて実際に新しい血管を形成するのは微小血管内皮細胞であるため、このようなアッセイには微小血管内皮細胞を用いるべきであるという考えが広く普及しています。私たちは、いくつかの理由からこれをHUVECを用いて行うことにしました。その理由の一つは、これらの細胞が非常に容易に入手できることです。病院へ行き、分娩室から臍帯を入手することで、非常に簡単に細胞を単離することができます。また、これらの細胞は長年培養に使用されており、特性が非常によく解析されています。そこで、上述の理由からこれらの細胞を使用できるよう、本アッセイを構築し最適化しました。興味深いことに、これらの大血管内皮細胞は、培養下で微小血管内皮細胞のような形態をとることが分かりました。大血管内皮細胞で通常発現している多くの遺伝子が消失し、通常は微小血管内皮細胞に関連する遺伝子の発現が始まります。そして、これらの細胞は毛細血管のような出芽を形成し、管腔を作り、培養下においてあらゆる面で本物の毛細血管のように見える構造を構築する能力を十分に備えています。そのため、扱いやすく、目的とする動作を正確に実行します。つまり、出芽し、適切な管腔を持つ血管を形成するのです。このアッセイを定量化する場合、いくつかの方法があります。発芽数、発芽の長さ、発芽の直径、分岐点の数、吻合の数などの定量的な指標を確認することもできますが、定性的な指標も確認します。例えば、ルーメンが形成されているかなどを確認します。そして、それこそがおそらく私たちが最も関心を持っている点です。私たちが実施する多くのアッセイにおいて重要なのは、適切な管腔形成が行われているかということです。これは実質的に定性的な評価になりますが、血管が大きくなるにつれて、それら管腔の直径を実際に測定することも可能です。したがって、これらの培養には線維芽細胞を使用します。ビーズをフィブリンゲルに埋め込み、ゲルの上に線維芽細胞を播種します。線維芽細胞は、適切なスプラウティングおよび管腔形成に不可欠です。線維芽細胞が存在しない場合、ある程度の出芽（sprouting）は見られます。しかし、血管内皮細胞は互いに接着し続ける傾向がありません。実際には、内皮細胞が互いに離れて移動してしまいます。そのため、このスプラウト上で形成される構造は崩壊しやすくなります。そして数日後には、血管内皮細胞がアポトーシスを起こします。したがって、少なくともこのin vitroシステムにおいては、線維芽細胞が血管新生に不可欠な因子を産生していると考えられます。そして、私たちはそれらの要因が何であるかを知ることに非常に強い関心を寄せてきました。そこで判明したのは、線維芽細胞が培地中に何かを分泌しているということです。したがって、線維芽細胞からの条件培地を回収して使用することで、適切な発芽と管腔形成を促進させることができます。つまり、私たちは間違いなく可溶性因子を扱っているということになります。したがって、このシステムにおける血管新生に非常に重要な、線維芽細胞が産生している物質が何であるかを知ることは極めて重要です。VEGFや塩基性FGFといった通常考えられる候補をすべて試しましたが、これらは培養液中に存在しており、さらに添加しても線維芽細胞の代わりにはなりませんでした。また、アンジオポエチン1、TGF-β、HGFなども試行しました。これまでのところ、重要な因子の特定には至っていません。そこで現在は、線維芽細胞の条件培地から因子の精製を行っています。具体的には、条件培地を陽イオン交換カラムやサイズ排除カラムなどのさまざまなカラムにかけ、活性を持つ分画を回収しています。現在はその活性を追跡しており、各フラクションを回収してどれに活性があるかを確認しています。そこからゲル電気泳動を行い、ゲル上のバンド数が比較的少数であることを確認した後、それらを切り出して質量分析によるシーケンシングを行います。これにより、多くの興味深いデータが得られています。現在は、我々が探索している因子であるかどうかを確認するため、個別にテストしている候補遺伝子がいくつかあります。私たちは多くの既知の血管新生因子をテストしており、このアッセイにおいて適切な発芽を誘導するには、VEGFおよびbFGFが不可欠であることが分かっています。しかし、それらだけですべてが説明できるわけではありません。前述のように、重要な派生因子も存在します。そこで、in vivoで強力な血管新生能を持ち、マウスにおいて高度に血管化した大きな腫瘍を形成する腫瘍細胞を用いて、この点について検討しました。これらの腫瘍細胞を観察したところ、非常に高レベルのvegfを発現していたため、それらを培養系に導入しました。つまり、線維芽細胞をこれらの腫瘍細胞に置き換えたのですが、このアッセイにおいて、これらの細胞は強固な血管新生をサポートしませんでした。これは非常に興味深い結果です。このことが示唆しているのは、（そしてこれは他の研究者によっても指摘されていますが）、腫瘍と、組織内の線維芽細胞やその他の支持細胞であるストロマ（間質）、そして内皮細胞との間にクロストークが存在することです。腫瘍細胞が内皮細胞に直接作用する因子を産生している可能性は十分にありますが、同時に線維芽細胞やその他の間質細胞を刺激して、強固な血管新生をさらにサポートする因子を産生させる別の因子も産生していると考えられます。

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