クリストファーヒューズ：血管新生の研究のためのin vitroモデル（インタビュー）

こんにちは、私の名前はDr.Christopher Hughesです。私はカリフォルニア大学アーバイン校の教授で、研究室では血管新生について研究しています。そして、私たちは特に血管新生のプロセスを調節する遺伝子に興味を持っています。

私たちは、ネルソンの研究に基づいてin vitroアッセイを最適化し、このアッセイでは、血管新生中に進行しているすべての異なるプロセスを見ることができ、テデックスビーズ、小さなビーズを内皮細胞でコーティングします。次に、これらをフィブリンゲルに埋め込みます。成長因子を提供します。

そして数日の間に、内皮細胞はビーズから発芽します。それらは移動し、整列し、増殖し、チューブを作り、分岐し、吻合を形成します。そのため、約10日で、文化におけるネットワークのような完全な毛細血管ができあがります。

そうですね、envivoおよび血管新生アッセイの問題のいくつか、例えばマウスで行われるものでは、システムを操作するのはそれほど簡単ではないということです。動物の体内でこれが起こっているとき、血管新生が起こっているのを実際に見ることはできないと想像するのは難しいです。また、当社のin vitro培養でシステムを操作したい場合、内皮細胞を遺伝子操作し、遺伝子をオンまたはオフにし、それが血管新生の発芽に及ぼす影響を調べるのは非常に簡単です。

そして、それを動物全体で行うのははるかに困難です。ノックアウトやノックインを作らなければなりません。これが2つの大きな利点です。

それは、操作しやすく、視覚化しやすいです。そのため、長年にわたり、さまざまなin vitro無形成アッセイが開発されてきましたが、それらすべてに長所と短所があります。特によく知られているのは、マトリゲルと呼ばれるこの細胞外マトリックスの上に内皮細胞を配置するマトリックスゲルアッセイです。

そして、そこで問題となるのは、内皮細胞は臍帯のような構造を作りますが、実際には適切なアルミメッキ容器を作ることは決してないということです。発芽も、吻合も見えません。コラーゲンゲルモデルもありますが、これは良いものです。

あなたが内皮細胞の増殖を見ていないものがたくさんあります。あなたは吻合を見る傾向がありません。私たちが開発したフィブリンゲルアッセイは、90年代半ばに発表されたネルソン・カーのモデルに基づいています。

そして今では、血管新生のすべての段階を見ることができるほど劇的に改善されました。私たちは最初の発芽、移動を見ることができます。細胞の増殖、内腔の形成、分岐、そして最終的には吻合を行い、in vitroで完全な血管網を形成します。

ですから、このアッセイは、血管新生のさまざまな段階をすべて見たい場合に最適なin vitroシステムであると私たちは信じています。このin vitroアッセイのもう一つの利点は、レーザーキャプチャー、マイクロダイセクションを行い、培養物をスピンダウンして非常に平らにし、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション顕微鏡を使用できることです。私たちは実際に個々の細胞を取り出すことができますが、特に先端細胞に興味があります。

そこで、それらを切り取ることで、特に先端細胞と体幹細胞、つまり実際に内腔を作っている細胞における遺伝子発現を調べることができます。そして、私たちの仮説は、これら2つの細胞集団間で異なる遺伝子発現が存在するというものです。それを見ることはできますが、in vivoシステムでそれを行うことはほぼ不可能です。

ですから、これもこのin vitroアッセイを使用する大きな利点だと考えています。この中で行われた初期の研究は、ネルソン・レコンが述べたように、微小血管内皮細胞を使用していました。そして、微小血管内皮細胞は、in vivoでは、実際に新しい血管を形成しているのは微小血管ECであるため、このようなアッセイに使用したい細胞であると多くの考えがあります。

私たちはこれをveで試してみることにしました。これらは、いくつかの理由でヒトの臍帯静脈内皮細胞です。その1つは、これらの細胞が非常に簡単に入手できることです。

病院に行ったり、分娩室からへその緒をもらったり、細胞を非常に簡単に分離したりできます。また、これらの細胞は長年にわたって培養に使用されてきました。彼らは非常によく特徴付けられています。

そこで、このアッセイを設定し、最適化することで、これらの細胞をそのような理由で使用できるようにしました。そして興味深いことに、これらの大きな血管内皮細胞であるvexは、微小血管内皮細胞と培養の形をとっているように見えることがわかりました。彼らは、通常は大血管ecによって発現される多くの遺伝子を失い、通常は微小血管内皮細胞に関連する遺伝子を発現し始めます。

そして、彼らは完全に毛細血管を芽のように形成し、内腔を作り、世界中の文化が本物の毛細血管のように見えるものにすることができます。ですから、彼らは使いやすく、veは使いやすく、私たちが彼らにしたいことをします。彼らは芽を出し、そして彼らは適切なアルミメッキ容器を作ります。

このアッセイを定量したい場合、実際にはいくつかの方法があります。芽の数、芽の長さ、芽の直径、分岐点の数、吻合の数など、非常に定量的な基準を見ることができますが、定性的な基準も見ています。そして、私たちは彼らがルーメンを形成しているのを見ることができますか?

そして、それはおそらく私たちが最も興味を持っていることなのでしょう。私たちが行う多くのアッセイでは、それらの適切な内腔形成が行われています。そして、それは実際には定性的な評価ですが、血管が大きくなるにつれて、実際にはそれらの内腔の直径も測定することができます。

だから私たちは使用します 線維芽細胞 これらの文化では。ビーズをフィブリンゲルに埋め込み、ゲルの上に線維芽細胞をプレートします。線維芽細胞は、適切な発芽と内腔形成に絶対に不可欠です。

線維芽細胞がないと、いくらかの発芽が起こります。しかし、内皮細胞は互いに付着したままではない傾向があります。何が起こるかというと、彼らはお互いから離れて移動するのです。

そのため、この芽で開発している構造はバラバラになりがちです。そして数日後、内皮細胞はアポトーシスを起こします。つまり、線維芽細胞は、少なくともこのin vitroシステムでは、血管新生に不可欠な因子を作っているようです。

そして、私たちはそれらの要因が何であるかを知ることに非常に興味を持っていました。私たちが発見したのは、線維芽細胞が培地に何かを分泌するので、線維芽細胞から状態培地を取ることができ、それが適切な発芽と内腔形成をサポートするということです。ですから、私たちは間違いなく可溶性因子を扱っているのです。

ですから、線維芽細胞がこのシステムの血管新生にとって非常に重要なものを作っているものが何であるかを知ることに非常に興味があります。私たちは、すべての通常の容疑者を試しましたが、VEGF、基本的なfg Fは、培養され、さらに追加しても線維芽細胞の代わりにはなりません。また、アンジオポエチン1、TGFベータ、H、GFなども試しました。

これまでのところ、私たちは重要な要素を見つけていません。ですから、私たちが今やっているのは、線維芽細胞から状態培地から因子を精製することです。そこで、条件を中程度をさまざまなカラム、陽イオン、交換、サイズ除外に配置し、活性を持つその一部を取得しています。

そして、私たちは今、その活動を追跡し、それらのフラクションを取り、どのフラクションがアクティブであるかを見つけ、そこからそれらをゲル上で実行し、ゲル上に比較的少数のバンドがあることを確認し、それらを切り取って質量分析によって配列決定することができます。そして、それが私たちに多くの興味深い日々を与えてくれています。現在、かなりの数の候補遺伝子があり、それらが実際に私たちが探している要因であるかどうかを個別にテストしています。

そのため、多くの既知の血管新生因子をテストし、このアッセイで適切な発芽のためには、ベジGFと基本的なFGFが実際には不可欠であることを知っています。しかし、それだけではありません。先ほど述べたように、重要な派生因子があり、これを検討する一つの方法は、生体内で血管新生性の高い腫瘍細胞を取り上げ、マウスに大きな腫瘍を生成し、高度に血管新生することです。

そして、これらの腫瘍細胞を調べたところ、非常に高レベルのベジフを発現し、それらを培養に取り入れました。そのため、これらの腫瘍細胞で線維芽細胞を置き換えましたが、このアッセイでは、線維芽細胞は堅牢な血管新生をサポートしていません。そして、それは非常に興味深いことです。

それが示唆しているのは、これは他の人々によっても示唆されていますが、腫瘍、S間質、つまり組織内の線維芽細胞やその他の支持細胞と内皮細胞との間にクロストークがあるということです。また、腫瘍細胞は、内皮細胞に直接作用するいくつかの因子を産生するだけでなく、線維芽細胞や他の間質細胞を刺激して、堅牢な血管新生をサポートする因子を作る他の因子も産生している可能性があります。