ロボロリーパインからのRNA分離の改良法（ P. taeda L.）及びその他の針葉樹種

以下は、ジョージア大学およびワーネル林業・天然資源大学院の研究者によって作成されました。このデモンストレーションビデオでは、米国において林産物生産に最も重要な針葉樹種である、一般にロブロンパインとして知られる Pinus Teta からの木部および師部組織の採取、およびその後の RNA 分離について解説します。樹木（本例では樹齢40年の個体）を伐採した後、主幹を約 50 cm の長さのボルト状に切断します。

次に、樹皮の剥離を容易にするため、チェーンソーを用いてボルトに沿って縦方向に数箇所切り込みを入れます。ハンマーとノミを使用して、樹皮が部分的に剥がれるまで持ち上げます。その後、流管組織を手で取り除き、樹皮セクションの内側から剥ぎ取り、直ちに液体窒素に浸漬させます。

樹皮を除去した後、片刃のカミソリでボルト表面を削ることで、二次 xylem の薄い層を回収できます。水分を多く含む xylem 組織は、直ちに液体窒素に入れます。今回の採取では、主幹から枝を切断する前に、一般に圧縮材および対向材と呼ばれる反応材のサンプルも回収しました。

まず、肢の向きにスプレー塗料で印を付け、肢の上部にある引張材（opposite wood）と下部にある圧縮材（compression wood）の2種類の組織が含まれる領域を特定できるようにします。樹皮の除去に際しては、まずチェーンソーを用いて圧縮材と引張材の境界線に沿って切り込みを入れ、主幹のボルトと同様に樹皮を除去します。ただし、反応材の種類に対応する領域の樹皮のみを除去します。

採取される材は、任意のタイミングで除去されます。一般的に、これらの細い枝から大きな樹皮部分を除去することはより困難です。二次 xylem の反応材サンプルは、通常の二次 xylem と同様に、カミソリで削り取り、直ちに液体窒素に浸漬させる方法で採取します。

圧縮材に特徴的な赤褐色の色調に注目してください。大木から複数のサンプルを採取し処理する場合、RNAの分解を抑制するために、各担当者が指定されたタスクを遂行し、すべての組織タイプを同時に採取することが重要です。液体窒素で凍結させたサンプルは、その後ラベル付きの保存袋に移され、研究室への輸送のためにドライアイス上に置かれます。最初のステップとして、Spec Model 68 50 フリーザーミルを使用して組織を粉砕します。乳鉢と乳棒で研磨する場合と比較して、この工程は液体窒素でサンプルの低温状態を維持しながら、木本組織サンプルのRNA抽出収量を大幅に向上させます。

まず組織を手で細かく砕き、サンプルチャンバーに入れます。チャンバーをキャリアに挿入して固定し、サンプルを2分間ミル処理します。最終産物は粗い粉末状になります。

RNA抽出プロトコルは2日間の工程で行います。1日目は、凍結組織2.5 gを65 °Cに加熱したRNA抽出バッファーに加えます。サンプルを激しく振盪して混合し、同量のクロロホルムを加えて、緩やかに転倒混和させることで再度サンプルを混合します。

次に、試料を回転ホイールに載せて5分間回転させます。その後、試料を高速遠心分離用のテフロン製Oakridgeチューブに移し、SS 34ローターを用いて12,000 RPMで5分間遠心分離します。上層の水相分画を新しいチューブに回収し、0.5倍量のクロロホルムを加えます。

サンプルを1分間ボルテックスし、再度回転ホイールに5分間置きます。2回目の遠心分離後、水層を再び50 mlの高速度ポリプロピレンチューブに分取し、10,000 RPMで20分間遠心分離します。残留した微粒子を除去するため、サンプルを50 mlのFalconチューブにデカンテーションし、サンプルの4分の1量に相当する10 molar 塩化リチウムを加えます。

試料を振とうして混合し、4 °Cで一晩静置します。翌日、塩化リチウムで沈殿させた試料を、まず4 °C、11,000 RPMで30分間遠心分離します。

上澄みを捨て、チューブをキムワイプの上に1分間倒立させます。過剰な液体を除去した後、視認できるはずのRNAペレットを、65 °Cに予熱した800 µLの高温SSTEバッファーで再懸濁します。ペレット全体が完全に溶解するように、ピペッティングを数回繰り返し、ペレットの周囲全体に行うようにしてください。

次に、再懸濁したRNAを2 mL以上のRNAフリーマイクロ遠心チューブに移します。サンプルを65 °Cのウォーターバスで1〜2分間加熱し、その後ボルテックスにかけてサンプルが完全に再懸濁していることを確認します。必要に応じて、この操作を繰り返してください。

次に、同量の緩衝フェノール・クロロホルムを加えます。サンプルを15〜20秒間ボルテックスし、14,000 RPMで3分間遠心分離します。水層を新しいマイクロ遠心チューブに回収し、同量を加えます。

サンプルは、前回の抽出と同様にボルテックス処理およびマイクロ遠心分離を行います。最終的な有機抽出段階において、ロックゲルチューブをまず11,000 RPMで2分間マイクロ遠心分離します。

次に、前段階の抽出で得られたRNAサンプルをフェーズロックゲルに加え、さらに半量分のクロロホルムを加え、ピペッティングで静かに混合します。その後、サンプルを11,000 RPMで5分間遠心分離し、水層のRNAサンプルを新しいAmbion RNA-freeマイクロ遠心チューブに回収します。次のステップでは、サンプルに1/10量分の3 M 酢酸ナトリウム (pH 4.8) と2量分の100% ethanolを加え、簡便なRNA沈殿を行います。

サンプルをボルテックスし、-80 °Cのフリーザーに30分間短時間放置した後、4 °Cで30分間遠心分離します。上清を注意深く吸引し、小さな白いペレットを氷冷した70%エタノール 1 mLで洗浄して吸引します。最終的な吸引後、エタノール洗浄を繰り返します。チューブをベンチ上に5分間開けたままにして、残留エタノールを蒸発させます。

RNAペレットを100 µLのDEPC処理水に懸濁し、ボルテックスおよび65 °Cでの加熱により再懸濁させます。必要に応じてこの操作を繰り返します。その後、サンプルの濃度を測定します。

分光光度計を用いて262/280および262/230の比率を算出し、サンプル中のタンパク質および糖質の混入程度を推定します。1% AGROSゲル電気泳動を行い、ゲノムDNAの混入およびRNAの分解状態からサンプル品質を定性的に推定します。重要なサンプルの完全性については、Agilent 2100バイオアナライザーを用いてリボソーム28S/18S比およびRNA整合性番号（RIN）を測定し、さらに評価します。Loblolly pineからの組織サンプルの採取および全RNA抽出に関するビデオをご視聴いただき、ありがとうございました。

本トレーニングビデオの撮影および制作は、以下の方々が担当されました。