Name: 赤血球凝集アッセイを用いて血清の反応性と力価の決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: 学ぶ赤血球凝集アッセイによる血清反応性と抗体価の測定法。U字型プレートを用いた連続希釈法で、視覚的に凝集パターンを判定し、免疫学・血液学研究に応用可能な簡便な手法を習得する。

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著者は、映画撮影のためのテクニックと氏ポールシェパードを実行するためのミスローラマシューズに感謝したいと思います。このプロジェクトは、南オーストラリア大学、研究室医学のプログラムによって資金を供給された。

5倍のベロナール緩衝生理食塩水の調製（VBS） <ol><li>ベロナール緩衝生理食塩水（VBS）を準備するには、3つの別々のソリューションが用意する必要があります。 </li><li>蒸留水の350ミリリットルでナトリウムBarbitoneのNaClおよび0.94gmの21.25gmを溶解して溶液1を準備します。 NaClおよびナトリウムBarbitoneの最終濃度は、それぞれ1.02Mと13mmです。 </li><li>ホット蒸留水の125​​ミリリットルでBarbitoneの1.44gmを溶解して溶液2を準備します。 Barbitoneの最終濃度が62.5mMである。 </li><li>蒸留水の100mlにCaCl 2のMgCl 2と4.41gmの20.33gmを溶解して溶液3を準備。 MgCl 2とCaCl 2の最終濃度は2.18M、それぞれ440mMである。 </li><li>ミックスのソリューション1と2と室温まで冷却。 </li><li>組み合わせた溶液を冷却した後、溶液3の1.25 mlを追加し、1M HClを用いて7.3から7.5にpHを調整する。 </li><li> 5倍のストック溶液を調製するために蒸留水で500ミリリットルに、最終的な音量を調整します。 </li><li> 1Xワーキング溶液を調製するために、蒸留水で株式1:5に希釈する。 </li></ol> Revercellsの希釈<ol><li>静かに転倒混和してRevercellsのストック溶液を再懸濁し、その後4℃で600グラムで5分間細胞および遠心の1mlを取り除く℃に</li><li>遠心後、上清を慎重に除去し、ベロナール緩衝生理食塩液1Xの3ミリリットルで細胞を懸濁します。 </li><li>細胞は現在、4℃で使用時まで保存することができます。 </li></ol>手順<ol><li>行96ウェルU底プレートのA1 - A12に1X VBS 50mlのを転送する。 </li><li>まあA1に、抗血清50μlのを追加し、ピペットを用いてよく混ぜる。 </li><li>新鮮なピペットチップを使用して、よくA1から液体の50μlのを削除してもA2に転送します。完全に混和して、よくA11に到達し、この井戸から最後の50μlのを破棄するまで、このプロセスを繰り返します。 </li><li>血清サンプルは、現在シリアル1:2から1:2048に2倍に希釈されています。これはVBSネガティブコントロールであるため、血清はよくA12に追加されません。 </li><li>複数の血清サンプルを評価する場合、Bなどの行のためのステップ4.1から4.4を繰り返します。 </li><li>一度全ての希釈が行われている、すべてのウェルに1％のRevercells50μlの追加。注：Revercellsは時間をかけて解決し、穏やかにウェルに分注される前に中断されるべきである。 </li><li>軽くマイクロタイタートレイの側面にタップすることによってサンプルを混合、37℃で1時間進行さ血球凝集反応をカバーし、残す℃のインキュベーターまたは適切に加熱室を使用することができます。 </li><li>インキュベーション後、慎重にインキュベーターからトレイを取り外して、赤血球凝集のためのプレートを調べます。 VBSのコントロールは、よくよく調べ最初にしてください。反応が負の場合、結果は有効です。 VBSのサンプルが陽性赤血球凝集の結果が表示されている場合、結果は使用することができるとプロセスを繰り返す必要があります。否定的な反応がウェルの中央のセルの小さな濃厚ペレットとして表示されますが、正赤血球凝集反応は、よくの基盤上に広いシートとして表示されます。中間結果は、ペレット化した細胞の中核と陽性細胞のハローを持つことになります。血清が反応することができますが、抗体の不十分な量が全反応を引き起こすために、いくつかの抗体を持たないので、この結果が発生します。 </li><li>代表的な結果のセクションでは、期待される結果の2つの図式表現を持っています。結果の無効と有効なセットの例が提供されています。抗血清の力価も決定されます。 </li></ol>代表的な結果： ビデオでは、代表的な結果の例が含まれています。 （Fig1および図2）の下には、図式的に示すように、2つの例です。秒が決定される力価を可能にする有効な検定のときに最初の例では、VBSの制御が正であると解釈することができる反応である。 <img src="/files/ftp_upload/1752/1752fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 陽性の結果が失敗した赤血球凝集の1例を図 。上記の図式表現では、heamagglutination反応が受け付けられません。 VBS血清陰性コントロールは井戸の底部にシートを形成することによって証明されるように正の赤血球凝集反応を表示します。これは、エラーが発生し、結果を受け入れることができないことを示します。このケースでは、プロセスが繰り返される。 <img src="/files/ftp_upload/1752/1752fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。陽性の結果が正しく動作していた赤血球凝集の例。図式表現では、heamagglutination反応は有効です。 VBS陰性コントロールは陰性赤血球凝集反応が表示されますsは、井戸の基部に形成されたペレットからも明らか。最後の肯定的な井戸はこの血清サンプルの力価は128（すなわち1 / 128の逆数）であることを示す行7、です。これは、血清中の適度な量で存在する抗体の例になるであろう。

赤血球凝集アッセイは、時間の短い期間内に評価される血清サンプルの多数を可能にするとても簡単なテクニックです。それが適している目で、特殊な装置を必要とせずに読み取られるという利点もあります。この手法はまた、赤血球凝集阻害試験の一環として、尿中のヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモンの存在の検出のため変更することができます。標準血球凝集試験に関連して、ケアが正しく実行されるアッセイのために考慮する必要があるいくつかの領域があります。まず、このテクニックは、凹面上のセルのセトリングに基づいています。このように、それがU -または丸底マイクロタイタープレートが使用されていることが不可欠である。負と正の反応が同一の表示されるように、一般的にELISAのために使用されるように平らな底板の使用は、適切ではありません。それはまた別の血清サンプルが使用されているときに、反応性抗体は、異なる濃度で存在している可能性があることを理解すべきである。高い抗体濃度で、抗原（Revercells）が制限されることがありますし、プロゾーンの効果が観察されることがあります。これは陽性反応が最後に目撃された最後の幸福として決定されるので、しかしこれは、力価の値の決定には影響しま...

<table><tbody><tr><td>Revercells</td><td>CSL</td><td>02490201</td><td>最終濃度1%で使用</td></tr><tr><td>抗A血清</td><td>CSL</td><td>02611305</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルU底プレート</td><td>TRP</td><td>92097</td><td>U底であること</td></tr><tr><td>ベロナール緩衝生理食塩水</td><td></td><td></td><td>最終濃度1xで使用</td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C室/インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨て手袋</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

赤血球凝集アッセイを用いて血清の反応性と力価の決定

Determining the Reactivity and Titre of Serum using a Haemagglutination Assay

赤血球凝集は凝集の特定の形式であり、抗体が粒子状抗原として​​機能する赤血球、にバインドするときに使用されます。赤血球は、容易に入手できるように特に有用な標的であると凝集は肉眼を用いて観測される。この手法は、一般的に血液型判定およびウイルス定量のために、抗体（Ab）の力価を決定するために使用されます。このビデオでは、赤血球凝集アッセイの準備と実行に必要なステップは、血液型抗原は、赤血球（Revercells）に追加するに特異的な抗体を用いて示されています。抗血清は、シリアルRevercellsの懸濁液を添加された96ウェルU底マイクロタイタートレイ、中に希釈される。サンプルを混合し、その後60分間37℃でインキュベートする。この時間後、次いで、試料を容易にVE、+ VEと中間(-/+)の赤血球凝集反応のために得点することができます。このアプローチは、迅速かつ簡単な手法を用いて評価される血清サンプルの反応性と力価が可能になります。ビデオは、アッセイを変更する方法、力価が決定される方法、結果を読み、どのように解釈されるか、分析の背後にある理論をカバーし、この技術の使用に関連するあらゆる問題になります。

赤血球凝集は、抗体が赤血球に結合凝集の形式です。赤血球は、両方とも容易に入手可能であり、結果は容易に肉眼を使って観測している。このビデオでは、結果を解釈し、力価を決定する、赤血球凝集アッセイに必要な手順を示しています。

血球凝集は凝集反応の特異的な形態であり、粒子状抗原として機能する赤血球に抗体が結合する場合に用いられる。赤血球...

ヘマグルチニン法を用いて血清の反応性とタイターを決定します。凝集反応とは、可溶性抗体と粒子状抗原との間で起こる反応です。これらには、細胞や担体分子が含まれます。キャリア表面のエピトープにより、抗体が結合してキャリア同士を架橋することで、抗原抗体複合体と呼ばれる複雑な格子状構造が形成されます。血球凝集は凝集の一種であり、粒子状抗原として機能する赤血球に抗体が結合することによって起こります。赤血球は容易に入手でき、かつ結果を肉眼で容易に確認できるため、標的として有用です。血清サンプルを段階希釈し、96ウェルU底プレートに分注します。次に、赤血球懸濁液を加えます。高濃度の抗体が存在する場合、赤血球との結合が起こり、大きな格子構造が形成されます。この格子状の構造が重力によって沈降すると、U底プレートの形状に沿って広がります。上から見ると、赤血球が広範囲にわたるシート状に広がっているのが観察されます。これがヘマグルチニン反応陽性です。抗体価が低い場合、格子構造が形成されず、赤血球はU底プレートの形状に従って底辺に集まり、小さなペレットを形成します。これは血球凝集反応陰性です。この図は陽性反応を示しています。細胞は沈降するにつれて格子状に形成され、U底プレートの形状に沿って配置されます。左右の画像は上面からの視野であり、赤血球が広範囲にわたってシート状に広がっているのが見えます。中程度の量の抗体が存在する場合、一部にレター形成（letters formation）が観察されます。血球凝集法を用いることで、既知の抗原に対する異なる血清サンプルの反応性を試験することも可能です。また、血清サンプルのタイター（抗体価）を決定することもできます。タイターとは、陽性反応が認められた最後の希釈倍率のことです。通常、血清サンプル中の抗体濃度が高ければ高いほど、タイターは高くなります。この図は陰性の血球凝集反応を示しています。赤血球を架橋させるのに十分な抗体が存在していません。細胞が重力によって沈降すると、ウェルの壁面に沿って滑り落ち、底面に密なペレットを形成します。右の図は、赤血球を上方から見た様子を示しています。この実験では、U底の96ウェルプレートが1枚必要になります。平底プレートでは細胞がペレット状に沈降せず、解析が不可能になるため、必ずU底プレートを使用してください。ピペットを用いて、各列のウェルに50 µLのテスト血清、1%のRiva細胞懸濁液、および1回分のverone緩衝生理食塩水溶液を分注します。1から12まで、50 µLのroal緩衝生理食塩水を分注してください。これを希釈液として使用します。次に、50 µLの血清をウェルA1に入れます。これが2倍希釈の最初の検体となります。パーペットを用いて、血清サンプルを十分に混合してください。混合後、ウェルA1から50 µLを分注し、ウェルA2に移します。これにより2倍希釈を2回繰り返すことになり、最終的に4倍希釈となります。ウェル3から11までを用いて、この希釈系列を続けます。ウェル12はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の陰性対照であるため、血清は加えないでください。次に、十分に混合した1%のRiva細胞懸濁液を用意し、ウェルA1からウェルA12まで50 µLずつ分注します。細胞を添加した後、プレートに蓋をし、プレートを軽く叩いてサンプルと細胞が十分に混合するようにします。次に、37 °Cで60分間インキュベートします。加湿インキュベーターの使用が適切です。60分間のインキュベーション期間中に、抗原抗体反応が起こり、細胞が沈降し始めます。ご覧いただいているビデオ映像は、この60分間全体のタイムラプス写真です。これはウェル5から10のクローズアップです。すでに、今回のVBSコントロールである12番ウェルを確認しました。細胞が密なペレットを形成しており、アッセイが適切に機能したことが示されています。5番と6番のウェルは、正の血球凝集の例です。ウェル7は中間的な凝集結果の例であり、ウェル8、9、および10は血球凝集陰性です。この結果に基づき、陽性反応が観察された最後のウェルであるウェル7の希釈倍率に基づいてタイターを決定します。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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すべてのインフルエンザA型の定量的な分析シンプルなスロットブロットアッセイでユニバーサル抗体を用いたウイルスHemagglutininsとノイラミニダーゼ

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標的抗原に対する血清抗体を検出するためのヘマググルチン化阻害アッセイ

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インフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価測定法

血清中のインフルエンザノイラミニダーゼ(NA)阻害抗体価を測定するための酵素結合レクチンアッセイ(ELLA)について説明します。このアッセイでは、ピーナッツ凝集素を使用して、フェチュインコーティングされた96ウェルプレートからNAがシアル酸を除去したときにアクセス可能になるガラクトース残基を定量します。...

酵素結合レクチンアッセイによってインフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価を測定します

示されたプロトコルでは、インフルエンザ ワクチン接種者の血清サンプルからインフルエンザ特異抗体価を定量化する赤血球凝集抑制法を実行する方法について説明します。最初のアッセイは、凝集によって最適なウイルス抗原濃度を決定します。2 番目の分析は,...

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インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンを対象とする抗体による Fc を介したエフェクターの機能の活性化を測定する手法を提案します。この試金は、Fc...

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試金を使用して SIAT1 MDCK 細胞のインフルエンザ a (h3n2) ウイルス中和によるひと血清中の抗体を中和することを測定

この記事では、ニューカッスル病ウイルス血清学的検査のために4つの赤血球凝集ユニット抗原を調製するための簡略化された方法を紹介します。抗原の赤血球凝集力価を正確に決定し、より厳密なバック滴定法と明確に定義された調整プロセスを組み合わせることで、検査効率を高め、偽陽性を減らし、家禽の疾患監視を改善します。...

ニューカッスル病ウイルス血清学の血球凝集阻害アッセイのための抗原調製物の最適化

古典経路は、抗体によって活性化し、標的細胞の溶解で最高潮に達しますれる。...

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赤血球凝集アッセイを用いて血清の反応性と力価の決定

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