胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化
May 25th, 2010
このビデオでは、E13ラット背側脊髄から交連神経細胞を細かく分析し、文化に方法を示しています。解離交連ニューロンの軸索成長とガイダンスの細胞および分子メカニズムを研究するのに便利です。
このビデオでは、胚性脊髄からコミュニケーションコーラルニューロンを解剖して培養する方法を紹介しています。この手順は、E 13ラットの胚を採取し、脊髄を解剖することから始まります。解剖中、脊髄はルーフプレートに沿って開き、オープンブック構成で準備されます。
背側組織ストリップを解剖し、チューブに集めます。背側組織は、トリプシンと機械的破壊によって単一細胞懸濁液に解離されます。次に、交連ニューロンをポリリジンコーティングされたガラスカバースリップまたは組織培養皿で培養します。
その後、軸索の成長と誘導の細胞および分子メカニズムを研究するために使用できます。こんにちは、モントリオール臨床研究所の神経発達分子生物学研究室のセバスチャンです。こんにちは、同じくMolecular Biology of Neural Development LaboratoryのSteve Moenです。
今日は、胚性脊髄から交連ニューロンを解剖して培養する手順を紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、アクセントガイダンスの細胞および分子メカニズムを研究しています。それでは始めましょう。
今日、解剖全体を通して L 15 培地の皿に置かれた、採取したばかりの E 13 ラット胚から脊髄が解剖されます。胚と溶液を氷の上に保つことが重要です。すべての解剖ステップにおいて、脊髄をニッケルストレッチしないことが重要であることを覚えてお
いてください。解剖顕微鏡下で、すべての余分な胚組織および胚膜から胚を分離します。次に、1つの胚を解剖皿に入れます。マイクロハサミを使用して、ここに示されている角度の頭と後部を切り取ります。
これにより、胚が脊髄に簡単にアクセスできるように配置するのに役立つ平らな表面が作成されます。胚の腹側を下にして、前方を向いて配置します。鉗子を使用して、胚の片側をしっかりと固定します。
鉗子をつまんだり離したりしないと、2組目の鉗子で組織が裂けます。脊髄の側面の皮膚をつかみます。保持鉗子の先端をTweします。
胚の裏側を覆っている皮膚をはがして、髄膜に包まれた脊髄を露出させ、脊髄の右側にある組織を部分的に剥離します。閉じた鉗子を使用して、保持鉗子のレベルから組織を突きます。脊髄に触れずにできるだけ脊髄に近づけてください。
脊髄に沿って数回繰り返します。これにより、後根神経節が付着し、腹側臓器が破壊されます。前端から始めて、前端と後端に組織を付着させたままにしておきます。
フック型のタングステン針を使用して髄膜を切断し、屋根板に沿って脊髄を開きます。胚を180度回転させ、残りの側から組織を破壊します。同じ方法を使用します。
次に、脊髄の左側の組織を完全に剥離し、もともと右側にあった側に脊髄を配置し、鉗子を使用して残りの間葉系組織と後根神経節の大部分を切除します。鉗子を使用して、髄膜の短いフラップをはがします。この時点で、髄膜と脊髄は2枚のサンドイッチ組織です。
鉗子を使用して、前端の脊髄の大部分を固定します。分離した2つのセグメントを鉗子でつかみ、髄膜を剥がします。滑らかで一定の動きでは、不均一な剥離により髄膜層や脊髄が破損する可能性があります。
引っ張っている間に髄膜層が壊れると、髄膜に付着したままの脊髄の部分は通常回復できません。それは時々可能ですが。プラスチック製のパイプを使用して、分離された脊髄を氷上の10%熱不活化ウマ血清を含むL 15培地の皿に優しく移してから、さらに胚を処理します。
解剖皿の培地を冷やしたL 15に変えて、胚を冷たく保ち、組織の完全性を保つことを忘れないでください。背側脊髄解剖に進む前に、すべての胚から脊髄を採取します。背側索解剖を開始するには、10%の熱と活性化ウマ血清を含むL15を含むペトリ皿に、新たに分離された脊髄を1つ入れます。.
後脳の一部を含む幅の広い前部を切り取ります。次に、脊髄を平らに置き、開いた本のように広げます。背側組織は、L字型のタングステン針を使用してまっすぐなタングステン針でコードを固定しながら、開いた本の脊髄の最も外側の部分に位置し、ストリップを約5分の1に切り取り、幅の広いストリップを切断する脊髄の半分の幅は、収量を増加させますが、培養の純度を低下させます。
複数の背側ストリップを、10%馬の血清を含むL 15培地を含む15ミリリットルの円錐形チューブに移し、チューブを氷の上に置きます。.残りの手順は、組織培養フードの近くまたは内部で行われます。これらの培養物では、通常は解剖前に、溶液と機器を事前に準備することが重要です。
テーテーションステップでは、直径が元のサイズの半分とわずかに小さいサイズの2つのサイズのファイヤーポリッシュパスタパイプを使用します。コーティングを開始する前に、2本のファイヤーポリッシュパイプにメディウムを含む血清をパイプに吸引して30秒間放置します。これにより、イオン中にガラスに付着する細胞の数が減少します。
背側ストリップがチューブの底に落ち着いていることを確認することから始めます。ラミナフローフードの下で、ペットごとにプレーンパスタでSUPナタントのほとんどを取り除きます。3ミリリットルの冷たいマグネシウムとカルシウムを含まないHBSSですばやく洗ってください。
背側神経管ストリップを2分間落ち着かせます。次に、パスタと一緒にHBSSを取り外します。容量を最大4.7ミリリットルにします。
温かいHBSSを使って、0.15%Tryinの最終濃度を与えるために2.5%トリプシンの0.3ミリリットルを加え、穏やかに37°Cの水浴で7分間インキュベートします。インキュベーションの途中で一度穏やかに混合します。インキュベーションが終了したら、DNAを添加して最終濃度を1ミリリットルあたり150単位にし、硫酸マグネシウムで最終濃度を0.15%にし、短時間混合します。
これで、背側神経管切片が断片化されているはずです。組織片を200 Gで4分間遠心分離します。パスタパープでSUP上清を取り除き、チューブの底に約50〜100マイクロリットルの液体を残します。
チューブを軽くフリックしてペレットを緩めます。次に、5ミリリットルの温かいHBSSを追加して細胞を洗浄します。細胞を室温で2分間沈殿させます。
スピンダウンして、細胞を再度洗浄します。今回は、温かいHBSSを2ミリリットルで懸濁して蘇生します。半径のファイヤーポリッシュピペットを使用して、4〜6回ゆっくりとピペッティングして細胞を回転させ、チューブの側面に液体をピペで固定して大きな塊を分解し、細胞死を減らします。
泡を作らないようにし、食べ過ぎないでください。最小のファイヤーポリッシュガラスパスタパーペを使用して、同じ方法でゆっくりとピペッティングを3〜4回行うことにより、細胞をさらに解離させます。凝集体が破片中に死細胞を形成する傾向があるため、すべての細胞塊を解離する必要はありません。
組織の断片を1分間沈殿させます。次に、血液ナトリウムでカウントするための懸濁細胞を含むべきSUP被覆体の20マイクロリットルを除去し、ニューロンはトライアンブルーイオンプレートによって少なくとも95%生存可能でなければなりません。神経基礎プレーティング培地中のニューロンは、お客様のアプリケーションに適した濃度で
調製されています。16〜18時間後、中原体を神経基礎増殖培地に変更して、脱落を防ぎます。ニューロンは、真空ポンプで吸引するのではなく、ピペットで媒体を穏やかに除去します。PLLコーティングされたガラスカバースリップにメッキされた単離された交連ニューロンの代表的な結果は次のとおりです メッキの4時間後にニューロンがメッキの30時間後に表面に付着しました。
ほとんどのニューロンは、目に見える成長円錐を持つ拡張軸索を持っています。これらのニューロンは、免疫蛍光実験に容易に使用することができます。この例では、微小管は緑、赤はfアクトン、NAは青で標識されています。
胚性脊髄から交連ニューロンを解剖して培養する方法を紹介しました。この手順を行うときは、交連ニューロンの純度が、解剖される背側ストリップの厚さに依存することを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
このビデオは、E13ラットの背側脊髄から交差ニューロンを解離し、培養する方法を示しています。解離した交差ニューロンは、軸索の成長と誘導の細胞および分子メカニズムの研究に有用です。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- 交差ニューロンは神経系の発達に重要な役割を果たしています。
- それらの成長と誘導メカニズムを理解することは、神経発達の洞察に不可欠です。
- これらのニューロンを解離して培養することで、詳細な細胞研究が可能になります。
- この方法は、脊髄損傷の潜在的な治療戦略を探ることに役立ちます。
研究の目的
- ラットの胚から交差ニューロンを分離する信頼性の高い方法を提供すること。
- 制御された環境で軸索の成長と誘導の研究を促進すること。
- 神経発達に関わる細胞メカニズムの理解を深めること。
使用した方法
- E13ラットの胚を収穫すること。
- 脊髄を解離し、オープンブック形態で準備すること。
- トリプシンと機械的破壊を用いて背側組織を単一細胞懸濁液に解離すること。
- ポリリジンコーティングされた表面上で交差ニューロンを培養すること。
主な結果
- E13ラットの脊髄から交差ニューロンの成功的な分離と培養。
- さらなる実験研究のための培養ニューロンの実行可能性の証明。
- 軸索の成長と誘導を研究するための再現可能な方法の提供。
- 研究室環境での細胞および分子メカニズムの探索を可能にすること。
結論
- 記述された方法は、交差ニューロンの解離と培養に効果的です。
- このアプローチは神経発達の研究に大きく貢献できます。
- 将来の研究は、これらの培養ニューロンを用いて治療介入を調査することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables the isolation of highly enriched commissural neuron cultures from embryonic spinal cord, providing a reductionist system to study axon guidance mechanisms. Such preparations support target validation in neurodevelopmental research by allowing mechanistic interrogation of guidance cue responses in a controlled, reproducible setting. The approach contributes to preclinical de-risking by generating quantitative, phenotype-based readouts for pathway modulation studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to axon guidance pathways through functional assays on purified commissural neurons.
- Operational Value: Provides a standardized, high-purity neuronal culture system (>90% purity) for consistent target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a disease-relevant system for screening compounds that modulate axon turning, growth cone dynamics, or guidance cue sensitivity.
- Operational Value: Supports assay standardization through defined dissociation, plating, and maturation timelines, facilitating reproducible compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a mechanistic de-risking platform to assess target engagement and pathway modulation in a human-relevant developmental context.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by providing quantifiable axonal outgrowth and turning assays as translational biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early-stage hypothesis testing and assay development for neurodevelopment targets, with outputs informing lead identification and preclinical progression decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by enabling direct observation of axonal responses to guidance cues such as netrins, slits, and morphogens.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-ready readouts (axon length, growth cone morphology, turning angles) suitable for automated or high-content screening formats.
- Analytics: Generates measurable dependent variables including axon extension rates, trajectory fidelity, and marker expression (DCC, LH2, TAG1) for statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conserved axon guidance mechanisms, allowing cross-species extrapolation of target modulation effects.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal preparation platform applicable across multiple guidance cue studies and compound screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing biological noise through highly enriched neuronal cultures.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized dissection, dissociation, and plating protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by providing early mechanistic insights into target modulation effects on axon guidance.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neurodevelopment targets based on functional validation in a physiologically relevant neuronal model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic tissue dissection and sterile neuronal culture techniques.
- Depends on access to timed-pregnant embryos, dissection microscopes, and trypsin-based dissociation equipment.
- Necessitates standardization across teams for dorsal strip width selection to balance yield and purity.
- Requires adaptation of plating density and maturation time for different assay formats (e.g., immunofluorescence vs. biochemical analysis).
- Limited by the embryonic origin of the tissue, which restricts longitudinal studies beyond early developmental stages.
