胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

このビデオでは、胚脊髄からcomm choralニューロンを分離し、培養する方法を解説します。まずE 13ラット胚を採取し、脊髄を切り出します。分離の際、脊髄を屋根板（roof plate）に沿って開き、「オープンブック（開いた本）」状に準備します。

背側の組織片を切り出し、チューブに回収します。この背側組織をトリプシンによる処理と物理的な破砕によって単一細胞懸濁液に解離させます。その後、交連ニューロンをポリリシンコートしたガラスカバースリップまたは組織培養皿で培養します。

これらを用いて、軸索の伸展およびガイダンスの細胞・分子メカニズムを研究することができます。こんにちは、モントリオール臨床研究センター、神経発達分子生物学研究室のセバスチャンです。こんにちは、同じく神経発達分子生物学研究室のスティーブ・モエンです。

本日は、胚脊髄から交連ニューロンを分離し、培養する手順について解説します。当研究室では、軸索ガイダンスの細胞的および分子的なメカニズムを研究するためにこの手法を用いています。それでは、始めていきましょう。

本日は、解剖の間中 L 15 medium の入ったディッシュに浸した、採取したばかりの E 13 ラット胚から脊髄を摘出します。胚と溶液は常に氷上で保持することが重要です。すべての解剖工程において、脊髄を無理に伸ばさないことが極めて重要です。無理に伸ばすと、完全に無傷な脊髄の単離が妨げられる可能性があるためです。

解剖顕微鏡下で、胚をすべての胚外組織および胚膜から分離します。次に、胚を1つ解剖皿に置きます。マイクロ剪刀を用いて、ここに示す角度で頭部と後部を切り離します。

これにより平らな面ができ、脊髄に容易にアクセスできるよう胚を配置することが可能になります。胚の腹側を下にし、前方（頭側）を遠い方向に向けて配置します。ピンセットを使用して、胚の一側をしっかりと固定します。

ピンセットを強く挟んだり離したりしないでください。そうしないと、もう一方のピンセットで組織を保持している部分が破れてしまいます。脊髄の側面の皮膚を把持します。保持用ピンセットの先端をわずかに動かします。

胚の背側を覆っている皮膚を剥ぎ取り、髄膜に包まれた脊髄を露出させ、脊髄の右側の組織を部分的に剥離させます。閉じたピンセットを使用して、保持用ピンセットと同じ高さから組織を突き刺します。脊髄に触れないよう注意しながら、可能な限り脊髄に近づけてください。

脊髄に沿ってこの操作を数回繰り返します。これにより、いくつかの後根神経節が回収され、腹側の器官が切断されます。前方端から始めて、前方端と後方端に組織を一部残しておきます。

フック状のタングステン針を用いて髄膜を切断し、屋根板に沿って脊髄を開きます。胚を180度回転させ、同様の方法で残りの側から組織を破壊します。

次に、脊髄の左側、つまり元々右側にあった破損部位のある側の組織を完全に切り離します。脊髄を横向きに置き、ピンセットを使用して、残っている間葉系組織と後根神経節の大部分を除去します。ピンセットを用いて、髄膜の短いフラップを剥離して開きます。この時点で、髄膜と脊髄は2枚のシート状の組織が重なったサンドイッチ状になります。

ピンセットを使用して、脊髄の前端にある大きな部分を固定します。分離した2つのセグメントをピンセットで掴み、髄膜を剥離します。剥離が不均一だと、髄膜層や脊髄が損傷する可能性があるため、滑らかに一定の動きで剥離してください。

牽引中に髄膜層が破れた場合、髄膜に付着したままの脊髄部分は通常回収不能となります。ただし、回収可能な場合もあります。さらに多くの胚を処理する前に、プラスチック製パイペットを用いて、単離した脊髄を10%熱不活化馬血清含有L 15培地を入れた氷上のディッシュに慎重に移してください。

胚を冷却し、組織の完全性を維持するために、解剖皿中の培地を冷却したL 15に交換することを忘れないでください。背側脊髄の解剖に進む前に、すべての胚から脊髄を採取します。背側脊髄の解剖を開始するには、新鮮に分離した脊髄1本を、10%の熱不活化馬血清を含むL 15が入ったペトリ皿に入れます。

後脳の一部を含む、幅の広い前方部分を切り出します。次に、脊髄を平らに置き、開いた本のように広げます。タングステン製の直線針で脊髄を固定しながら、L字型のタングステン針を用いて、脊髄半分の幅の約5分の1の帯状に切り出します。この際、背側組織は開いた脊髄の最も外側に位置しています。より広い帯状に切り出すと収量は増加しますが、培養の純度は低下します。

複数の背側ストリップを、10%馬血清を含むL 15培地が入った15 milliliterコニカルチューブに移し、チューブを氷上に置きます。以降の手順は、組織培養フードの付近または内部で行います。これらの培養では、通常は解剖前に、あらかじめ溶液と器具を準備しておくことが重要です。

tationステップでは、2種類のサイズの火炎研磨済みパスタパイプを使用します。一方は元のサイズの半分の直径で、もう一方はそれよりもわずかに小さいものです。開始前に、パイプに培地を吸引して30秒間静置し、血清含有培地で2本の火炎研磨済みパイプをコーティングします。これにより、ation中にガラスに付着する細胞数を減らすことができます。

まず、背側ストライプがチューブの底に沈殿していることを確認します。ラミナーフローフード内で、プラスチックピペットを用いてSUP上清の大部分を除去します。冷やしたマグネシウムおよびカルシウム不含HBSS 3 mLで速やかに洗浄します。

背側神経管ストリップを2分間静置させます。その後、パスタを用いてHBSSを除去します。液量を4.7 millilitersまで補充してください。

温めたHBSSを用い、最終濃度が0.15% Trypsinとなるように2.5% Trypsinを0.3 milliliters加え、穏やかに混合します。37 degree Celsiusの恒温水槽で7分間インキュベートし、その途中で一度穏やかに混合します。インキュベート終了後、最終濃度が150 units per milliliterとなるようにDNAsを、最終濃度が0.15%となるようにmagnesium sulfateを加え、短時間混合します。

背側神経管の切片が断片化されているはずです。組織断片を 200 G で 4 分間遠心分離します。パステールピペットを用いて上清を除去し、チューブの底に 50 ～ 100 µL の液体を残します。

チューブを軽く弾いてペレットを緩めます。次に、5 mLの温めたHBSSを加えて細胞を洗浄します。室温で2分間静置し、細胞を沈殿させます。

遠心分離し、細胞を再度洗浄します。今回は、2 mLの温めたHBSSで再懸濁します。直径半分のファイアポリッシュピペットを使用し、ゆっくりと4～6回ピペッティングして細胞を分散させます。この際、大きな凝集塊を解消して細胞死を軽減するため、チューブの壁面に沿って液体をピペッティングしてください。

気泡が発生しないように注意し、過剰にピペッティングしないでください。火炎処理した最小口径のガラスパステールピペットを用い、同様の手順でゆっくりと3〜4回ピペッティングして、さらに細胞を分散させます。死細胞やデブリによる凝集塊が形成されやすいため、すべての細胞塊を完全に分散させる必要はありません。

組織片を1分間静置させます。その後、hemo soterでの計数用に浮遊細胞を含むSUP上清を20 µL分取します。trypan blue染色プレートによるニューロンの生存率は95%以上である必要があります。ニューロンを、用途に適した濃度のneurobasalプレーティング培地に懸濁させます。

16～18時間後、剥離を防ぐために培地を神経基底成長培地に変更します。ニューロンを扱う際は、真空ポンプで吸引するのではなく、ピペットを用いて慎重に培地を除去してください。以下は、PLLコーティングされたガラスカバースリップ上に播種した分離交連ニューロンの代表的な結果です。播種から4時間後、および播種から30時間後にニューロンが表面に接着した様子を示しています。

ほとんどのニューロンは、可視化可能な成長円錐を持つ長い軸索を有しています。これらのニューロンは、免疫蛍光実験に容易に利用できます。この例では、微小管を緑色、アクチンを赤色、NAを青色で標識しています。

以上で、胚脊髄から交連ニューロンを分離し、培養する方法について説明しました。この操作を行う際は、交連ニューロンの純度が、切り出す背側ストリップの厚さに依存することに注意してください。以上で終了です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。