外植片から成長した初代ヒト気管支上皮細胞

本記事では、新鮮に分離したヒト気管支セグメントからのヒト気管支上皮細胞の増殖および拡大プロトコルについて説明します。このプロトコルは、コーディングとスクラッチング、100 mm培養プレート、気管支組織の修復、気管支組織移植の外植え、繊毛を伴い増殖するヒト気管支上皮細胞の継代、トランスウェル上のヒト気管支上皮細胞の5つのセクションで構成されています。開始する前に、すべてのステップを生物学的安全キャビネット内で行うことに注意してください。

特に断りのない限り、「材料、試薬および調製」のセクションを確認し、基本的な準備が整っていることを確認してください。以下のコーティング、ストック溶液の調製、培養、培地、解離液の調製、コーティングおよびスクラッチ処理、および100 mm培養プレートの準備は、事前に完了させておいてください。

すべて無菌状態で操作してください。滅菌済みの100 mm培養プレートとコーティング溶液を用意します。BSTピペットでコーティング溶液を2 mL分取り、100 mmプレート内で円を描くように混ぜて、プレートの底面をコーティングします。

コーティング溶液がプレートの底面を均一に覆っていることを確認してください。残った溶液をピペットで吸い出し、2枚目の100 mmプレートのコーティングに使用します。必要な枚数分、この操作を繰り返してください。

必要なプレートの数は、組織外植片の数によって異なります。コーティング溶液がプレートの底面を均一に覆っていることを確認してください。実演のように行います。

プレートにカバーをかけます。インキュベーター内で1〜2時間乾燥させ、気管支組織の外植えに使用する前に、過剰な溶液を吸引除去します。未使用のコーティング済み培養プレートは、滅菌バッグに入れて4 °Cで保存し、後で使用することができます。

70% ethanolで噴霧洗浄した小型の鋭い鋏、メス、およびピンセットを使用します。BSC内で、メスで強く押し付けることで、1プレートあたり少なくとも4箇所の深く小さなXS状の切り込みをコーティング済みプレートに入れます。切り込みが十分に深くないと、組織片がシリンジ内で安定せず、浮遊してしまいます。BSC外で、組織をP3ディッシュに入れます。単離したヒト気管支組織をBssで十分に洗浄します。

気管支片を開きます。組織をBSに導き、1%抗生物質・抗真菌剤を添加して冷却したDMEM/F12が入った滅菌済みの100 mm組織培養プレートに移します。鋭利な小型ハサミを使用して、組織を2～3 mm角の立方体状に切断します。

ピンセットを使用して、切り出した組織を各Xの中央に1片ずつ配置し、押し付けます。組織片またはX外植片を数秒間、プレートにゆっくりと密着させます。その後、完全培地10 mLを静かに加えます。培地を加えた後に組織が浮いた場合は、ピンセットで組織をXの溝に押し込むか、新しくXを作成してください。溝が十分に深くない場合は、新しくXを作成する必要があるかもしれません。

プレートをインキュベーターに入れ、組織が移植可能になるまで3〜4日ごとに培地を交換します。組織の周囲に十分な上皮細胞が増殖し、1〜2 cmの領域を覆うまで、通常は約4週間かかります。100 mmのコーティング済みおよびスクラッチ処理済みプレートを使用してください。

組織の外植えがすべて成功するとは限らないため、使用するプレートの数は、移植する組織の数に応じて決定します。あらかじめコーティングして4°Cで保存していたプレートを使用する場合は、使用前に室温に戻してください。ピンセットを用いて、元のプレートから組織を慎重に採取し、新しいプレートの中心軸上に置いて軽く押さえます。外向的な成長（アウトグロース）が見られない組織は廃棄してください。

組織をプレートに接着させます。数秒間、培地を加えてインキュベートします。Xの解説で前述した手順を追加します。

したがって、100 mm組織培養プレート1枚につき、トリプシンおよびEDTAストック溶液を2 mL使用します。ストック溶液を滅菌済みの0.01 M PBS 6 mLで希釈します。これにより、ストック溶液2 mLにPBS 6 mLが加えられ、最終濃度はトリプシンが250 µg/mL、EDTAが100 µg/mLとなります。外植体を新しいプレートに移した後、1〜2 cmの細胞リングがあるプレートから培地を吸引します。

温めて希釈したdripsおよびedt溶液を8 mLずつ、100 mmプレートに加えます。その後、37 °Cのインキュベーターに3〜15分間置き、頻繁に状態を確認してください。

トリプシンを作用させすぎると細胞が損傷します。顕微鏡下でプレートを確認し、ほとんどの細胞が剥離していることを確認してください。細胞は、8倍の拡大図に示すように、丸くなって剥離します。トリプシンおよびEDTA溶液を不活性化させるため、プレートあたり10% FBS含有培地を加えてください。

すべてのプレートの液量を1本のチューブにまとめるか、組織ごとに別々のチューブにまとめます。Hema Cytometerを用いて細胞数をカウントします。100 Gで5分間遠心分離します。チューブの底部に細胞ペレットが形成されるので、細胞ペレットを完全培地で懸濁し、目的の細胞濃度に調整します。

T 75フラスコに細胞を200万〜300万個ずつ分注し、必要に応じて完全培地を加えます。インキュベートし、培地を交換します。3〜4週間ごとに、細胞はT 75フラスコ内でサブコンフルエントまで増殖します。

約4週間後に、細胞を剥離して継代するか、あるいは細胞老化を防ぐため、コンフルエントになる前に使用してください。まず、トランスウェルの透過性メンブレンを準備します。24ウェルマルチウェルプレートに適合する6.5 millimeterのインサートを使用してください。

メンブレンの両側に培地を加えます。底部に0.6 mL、上部に0.1 mLを加えます。細胞培養インキュベーターで1時間インキュベートします。

メンブレンの両側から培地を慎重に除去します。まず基底層の容量から始めてください。不注意に操作するとメンブレンが容易に損傷する可能性があるため、推奨される容量を用い、培養インサートの側壁に沿って培地をピペットで吸い出してください。

そうしないと、培地が隣のウェルに漏れ出し、細胞が播種されてしまいます。透過性支持体を予備インキュベートした後、細胞懸濁液を注意深く、6.5 mm ウェルの膜の頂端側（apical side）に 0.1 mL ずつ分注します。次に、膜の基底側（basal side）に 0.6 mL の培地を分注します。

細胞の頂端側および基底側から10日間給餌します。十分に分化した培養を確立するために、培地を週に2回交換してください。実演した方法に従い、基底側の容量を除去します。

まず、上層の液量を置換します。メンブレンの基底側に0.6 mLの培地を加えます。この方法は、細胞のメンブレンへの接着を促進し、細胞が長時間空気にさらされるのを防ぎます。迅速に培地を交換し、インキュベーターに戻します。

10日目に、AAL培地を除去し、メンブレンの基底側の培地を0.6 mLに交換して、気液界面（air liquid interface）を形成させます。気液界面の状態で細胞を6週間維持し、培地交換を週2回行います。気液界面の形成から4週間後に、繊毛細胞が現れ始めます。

気液界面。細胞は繊毛細胞へと均一に分化します。耳の気液界面を作成してから6週間後。

摘出および移植された健康な上皮細胞を含むヒト気管支セグメント。本研究では、気管支組織の摘出物から得られた培養の8/9で成功しました。摘出物培養の1例で感染が発生しましたが、上皮細胞のリングは3〜4週間で半径1〜2 cmに達しました。

成功したX外植片は、最大6回まで再培養されました。すべての成功した培養例では、移植開始から48時間以内に細胞遊走の証拠が認められたか、あるいはB細胞に示されるように、これらの上皮細胞に特徴的な石畳状の外観を呈するX外植片が確認されました。また、以降の図において、外植片由来の細胞およびカバーガラス上に播種した細胞のサイトシン調製の免疫染色を行った結果、すべての細胞が上皮特異的なサイトケラチンに対して陽性であることが明らかになりました。ここでは、T 75フラスコ内で亜合流密度まで増殖させたヒト気管支サブカルチャー細胞を示しています。石畳状の外観に注目してください。

ヒト気管支細胞のサブカルチャーでは、ケラチンおよびE-カドヘリンに対して均一な陽性免疫染色が認められました。他の細胞型に対する特異的抗体を用いた免疫染色では、線維芽細胞、間葉系細胞、または内皮細胞による培養物の混入は認められませんでした。詳細については、本文中の図5およびその凡例を参照してください。透過性ポリエステルメンブレンまたはトランスウェル上で培養し、本手法で示したように気液界面で分化させた細胞において、本手法で示したものとは異なる形態の細胞が現れ始めた場合は、細胞およびその移植片を廃棄してください。本プロトコルでは、ヒト初代気管支上皮細胞の培養および増殖に関する詳細な方法を提示しました。

ヒト肺疾患メカニズムの重要な経路の特定や、新規薬剤の毒性および薬理学的スクリーニングには、ヒト細胞を用いた研究が必要です。ここで説明する手法が、外植片からのヒト気管支上皮細胞の培養を促し、これらの細胞をご自身の研究システムで活用される一助となることを願っております。ご清聴ありがとうございました。それでは、研究の成功をお祈りいたします。