外植片から成長した初代ヒト気管支上皮細胞

この記事では、新たに単離されたヒト気管支セグメントからのヒト気管支上皮細胞の成長と拡大のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、コーディングとスクラッチ、100ミリメートル培養プレート、気管支組織の修復、気管支組織移植の説明、繊毛で成長するヒト気管支上皮細胞の通過、トランスウェル上のヒト気管支上皮細胞の5つのセクションで構成されています。始める前に、すべての手順が生物学的安全キャビネットで行われることに注意してください。

特に明記されていない限り、資料、試薬、および調製セクションを読み、適切に準備されていることを確認してください。次のコーディング、ストックソリューションカルチャー、ミディアム解離ソリューション、コーティングとスクラッチ。100ミリメートルの培養プレートはBSTで行う必要があります。

すべてを無菌状態に保ちます。滅菌した100mm培養プレートとコーティング溶液を置きます。BSTピペットでは、2ミルのコーティング溶液と100mmプレートが渦巻いてプレートのベースをコーティングします。

コーティング液がプレートの底面を均一に覆っていることを確認してください。残った溶液をピペットで取り出し、それを使用して2番目の100ミリメートルプレートをコーティングします。必要な数のプレートについて繰り返します。

必要なプレートの数は、組織外植片の数によって異なります。コーティング液がプレートの基部を均一に覆っていることを確認してください。示されているように。

プレートを彼らのカバーで覆います。プレートをインキュベーターで1〜2時間乾燥させ、使用前にアクセス溶液を吸引します 気管支組織の説明のために。未使用のコーティングされた培養プレートは、滅菌バッグに入れて、後で4°Cで保存することができます。

スプレークリーン、小さくて鋭いはさみ、メス、70%エタノールの鉗子を使用し、メスでしっかりと押してBSCスクラッチコーティングプレートに持ち込み、プレートごとに少なくとも4つの深い小さなXSを形成します。傷が十分に深くない場合、ティッシュピースはシリンジに沈殿せず、BSCの外部に浮遊します。分離されたヒト気管支組織をBssで十分に洗い流します。

気管支片を開きます。組織をBSに持ち込み、DM EMハムF 12と1%の抗生物質抗真菌剤を添加した無菌の100ミリメートル組織培養プレートに移します。鋭利な小さなハサミを使用して、組織を2〜3ミリメートルの立方体に切ります。

鉗子で各Xの中央に切断した組織を1枚置き、押します。ティッシュ片またはX外植片をプレートに数秒間静かに接着させます。次に、10ミルの完全な培地を静かに追加します 組織が浮かぶ場合 培地を追加した後、鉗子を使用して組織をXの隆起に押し込むか、隆起が十分に深くない場合は新しいXを作るために新しい X.It を作る必要がある場合があります。

プレートをインキュベーターに置き、3〜4日ごとに培地を交換し、組織を移植する準備が整います。組織の周囲に1〜2センチメートルの領域をカバーするのに十分な上皮細胞が成長した場合、これには約4週間かかります。100ミリコーティングされたプレートと傷のあるプレートを使用してください。

一部の組織の説明が成功しない可能性があるためです。プレートの数は、移植する組織の数によって異なります。以前にコーティングされ、摂氏4度で保管されたプレートを使用している場合は、使用前に室温に戻してください 鉗子を使用して、元のプレートから組織を慎重に拾い上げ、新しいプレートの軸の中心に配置し、静かに押します 成長のない組織は廃棄する必要があります。

ティッシュをプレートに接着させます。数秒間、培地を加えてインキュベートします。X explanで前述した追加。

だから、トリップの2ミルとEDTAストックソリューションは、各百ミリメートルの組織培養プレートのための。6ミルのステリル0.01モルPBSと2ミルのストック溶液でストックを希釈し、トリプシンの最終濃度を50マイクログラム/ミルあたり2マイクログラムで、EDTAを100マイクログラム/ミルで調整します。Explantsを新しいプレートに移動した後、1〜2cmのセルリングを持つプレートから培地を吸引します。

8ミルの温かい希釈ドリップを加え、100mmプレートごとに溶液を注ぎます。そして、インキュベーターを摂氏37度で3〜15分間置きます。頻繁に確認してください。

トリプシンを長時間放置すると、細胞が損傷します。顕微鏡でプレートをチェックして、ほとんどの細胞が持ち上げられ、細胞は8ミルの暖かさで示されているように丸められて分離します。プレートあたりのメディア中の10%FBSは、EDT溶液を不活性化します。

すべてのプレートのボリュームを1つのチューブに結合するか、異なる組織の別々のチューブに結合します。Hema Cytometer遠心分離機で100 Gで5分間細胞をカウントします。細胞ペレットがチューブの基部に形成され、細胞ペレットを完全な培地に再懸濁し、目的の細胞濃度にします。

T 75フラスコあたり200万から300万個の細胞をそれぞれ配置し、必要に応じて完全な培地を添加します。培地をインキュベートして交換します。3〜4週間ごとに、細胞はD 75フラスコでサブコンフルエンスまで成長します。

約4週間で、細胞を持ち上げて増殖させるか、セネを防ぐためにサブコンフルエンスで使用する必要があります。まず、トランズウェルの透過性メンブレンの準備から始めます。24ウェルのマルチウェルプレートに収まる6.5mmのインサートを使用してください。

メンブレンの両側にメディウムを追加します。下部に6ミル、上部に0.1ミルを示します。細胞培養インキュベーターで1時間インキュベートします。

メンブレンの両側からメディウムを慎重に取り除きます。最初に基底容積から慎重に始めると、メンブレンが簡単に損傷する可能性があります。したがって、培地を培養インサートの側面にピペットで固定し、推奨容量を使用してください。

そうしないと、細胞を播種するために他の井戸に培地が漏れてしまいます。透過性支持体のプレインキュベーション後、細胞懸濁液をメンブレンのエピカル側にピペットで移し、6.5 mmウェルのメンブレンのエピック側に0.1 milの細胞懸濁液を注入します。ピペット0.6 M、メンブレンの基底側に中程度。

エピカル側と基底側から細胞を10日間供給します。明確に差別化された文化交流を確立するために、週に2回媒体。実証された方法を使用して、基底容積を除去します。

まず、エピカルボリュームを交換し、メンブレンの基底側に0.6ミルの培地を追加します。この方法は、細胞の膜への接着を促進し、細胞が長時間空気にさらされるのを防ぎます。メディアをすばやく交換し、インキュベーターに戻します。

10日目にAAL培地を取り外し、メンブレンの基部側にある0.6ミルの培地を交換して、空気液体界面を作成します。細胞を空気液界面に6週間保持し、週に2回培地を交換します。繊毛細胞は、耳の作成から4週間後に現れ始めます。

液体インターフェース。細胞は繊毛細胞に均一に分化します。耳の液体インターフェースの作成から6週間後。

explanおよび移植からの健康な上皮細胞を持つヒト気管支セグメント。私たちの研究では、気管支組織の説明から成功した培養が9つの組織のうち8つで行われました。エクスプランの培養物の1つが感染すると、上皮細胞のリングは3〜4週間で半径1〜2センチメートルに達しました。

成功したX explanは、最大6回まで再度培養されました。成功したすべての培養は、移植開始から48時間以内に細胞移動の証拠を示す、またはB細胞に示されているようにX explanは、Bに示されているように、これらの上皮細胞に対して異なる丸石の外観を有する。その後の図では、explanからの細胞およびカバースリップに播種された細胞のシトシン調製物の免疫染色により、すべての細胞が上皮特異的サイトケラチンに対して陽性であることが明らかになった。 サブコンフルエンスまで増殖したヒト継代培養気管支細胞とT 75フラスコをここに示します。丸石の外観に注意してください。

ヒト継代培養気管支細胞は、ケリンに対して均一な陽性免疫染色を示し、他の細胞タイプに対する特異的抗体によるE.Can him免疫染色は、線維芽細胞、間葉系、または内皮細胞による培養物の汚染の兆候を示さなかった。詳細については、図5およびその凡例のテキスト中の細胞を透過性ポリエステル膜またはトランズウェル上で培養した細胞、またはここに示すように繊毛上皮に分化した液体界面を有する細胞、廃棄する細胞およびそれらの細胞または移植、またはここで示したように異なる形態を有する細胞が現れ始める。このプロトコールでは、初代ヒト気管支上皮細胞の培養と増殖のための詳細な方法を提示しました。

ヒト肺疾患メカニズムの重要な経路を決定し、新薬の毒性および薬理学的スクリーニングには、ヒト細胞ベースの研究が必要です。ここで説明する方法により、外植片からヒト気管支上皮細胞を培養し、これらの細胞を研究システムで使用することが促進されることを願っています。ありがとう、そして頑張ってください。