Name: 植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートII：炭水化物 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学ぶ植物細胞壁の炭水化物組成分析法。乾燥試料からマトリックス多糖と結晶性セルロースを抽出し、弱酸加水分解とGC-MSで定量します。バイオ燃料原料の最適化に有用です。

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私たちは、優れた技術サービスとジョンラルフ、貴重なアドバイス、ディスカッション、およびポプラの木のサンプルのウィスコンシン大学のマシューロバートウェザーに感謝しています。この作品は、化学科学、地球科学およびバイオサイエンス部門、基礎エネルギー科学、科学局、米国エネルギー省（受賞なし。DE - FG02 - 91ER20021）と米国エネルギー省（DOE）による五大湖のオフィスによって資金を供給されたバイオエネルギー研究センター（DOE科学BERオフィスDE - FC02 - 07ER64494）。

1。細胞壁の分離<ol><li>挽く約60 - 70mgの空気またはretschmillを（1分、25 Hz）を使用して2ミリリットルザルスタットのスクリューキャップチューブで5.5 mm、ステンレス鋼ボールで乾燥植物材料を凍結。選択肢は、高スループットの研削やロボットと呼ばれるiWallを調剤の使用は、パートI 3に記載されています。 </li><li>細胞壁の分離の手順を続行する前に鋼球を取り除く 細胞壁の材料の準備の詳細なプロトコールは、第I部3に示されています。プロトコルの書かれた手順は、ここに完全を期すために。 </li><li> 1.5 70％エタノール水溶液のmlと徹底的に渦を追加する</li><li>ペレットに10分アルコール不溶性残渣を10,000 rpmで遠心分離</li><li>上清を吸引したり、デカントする</li><li>ペレットを再懸濁するために残渣にクロロホルム/メタノール（1:1 v / v）の溶液1.5mlを加え、よくチューブを振る</li><li> 10分間、10,000 rpmで遠心し、上清を吸引除去したり、デカントする</li><li>アセトン500 ULでペレットを再懸濁します</li><li> 35で空気の流れで溶剤を蒸発させる℃を乾燥するまで 必要に応じて乾燥試料は、さらに処理するまで室温で保存することができます。 </li><li>サンプル0.1 M sodiumacetate緩衝液pH 5.0を1.5 mlの再サスペンドペレットから澱粉の除去を開始する。 </li><li> 20分間ザルスタット管と熱を締めくくる。 80℃の加熱ブロックインチ</li><li>氷の上に、懸濁液を冷却する</li><li>ペレットには、次のエージェントを追加：0.01％Sodiumazideの35μlの場合（NaN 3）を、35μlのアミラーゼ（50μg/1mLH 2 O、バチルス属から、SIGMA）、17μlのプルラナーゼ（菌のacidopullulyticusから18.7単位; SIGMA） 。チューブと徹底的にボルテックスにフタを。 </li><li>懸濁液を37℃で一晩インキュベート°回転シェーカーでC。管を配向させる水平側近は改良混合。 </li><li> 100℃の熱サスペンション° C消化を終了するために加熱ブロックに10分間。 </li><li>遠心（10,000 rpm、10分）とを含む上清を可溶化されたでんぷんを破棄</li><li> 、1.5 mlの水を加えボルテックス、centriguation、および洗浄水をデカンテーションによって、残りのペレット3回洗浄する。 </li><li>アセトン500 ULでペレットを再懸濁します</li><li>乾燥するまで35℃の空気の流れ° Cで溶媒を蒸発させる。それはよりよい乾燥用スパチュラでチューブの材料を分割することも必要になる場合があります。 乾燥した材料は、単離された細胞壁（リグノセルロース）を提示。必要に応じて乾燥試料は、さらに処理するまで室温で保存することができます。 </li></ol> 2。マトリックス多糖類組成このメソッドは本質的にAlbersheim 1によって公表された方法を変更したものです。 <ol><li>壁材の単糖組成を決定するには、手またはiWall、ロボット研削や計量ロボットを用いたハイスループットな方法のいずれかで2ミリリットルstarstedtチューブに細胞壁物質2mgの重量を量る。 </li><li>内部標準としてイノシトール溶液（5mg/ml）の20μlのを追加。 2mgの細胞壁のサンプルでは、​​100μgのを追加することをお勧めします。 </li><li>チューブの底に細胞壁の材料を収集し、空気の流れの下で非常に優しいアセトンを蒸発させるためにアセトン250 ULで管壁を洗う。 </li><li>弱い酸加水分解のために各サンプルに2Mトリフルオロ酢酸（TFA）250 ulを加える。ない材料がチューブの壁にまで飛散されていないことを確認するために慎重にTFAを追加。 </li><li>しっかりとキャップ、121で90分間インキュベート加熱ブロックのC。 </li><li>氷上での加熱ブロックとサンプルを冷却します。 </li><li> 10分間10,000 rpmでチューブを遠心する。 </li><li>ペレットの材料を邪魔しないようにして作るガラススクリューキャップバイアルに単糖由来のマトリックス多糖類を含有する酸性上清の100μlを移す。ペレットは、以下の結晶セルロースのアッセイに使用することができます（3を参照。） </li><li>蒸発装置内の空気の気流下でガラス管でTFAを蒸発させる。 </li><li> 300μlの2 - プロパノール、渦を追加し、25℃蒸発° C（合計3回の繰り返し） </li><li>アルジトールアセテート誘導体化の手順の最初のステップは、それらに対応するアルジトールする単糖の還元を実行することです。この目的のために各乾燥した試料に水素化ホウ素ナトリウム溶液200μlを加える。新鮮な溶液を1M水酸化アンモニウム1mlのあたりの水素化ホウ素ナトリウムの10mgのを使用して、各時間を準備します。 </li><li> 1.5時間室温でガラスバイアルを残す</li><li>氷酢酸150 ulを加えることによってソリューションを中和する</li><li> 25渦と蒸発° C。 </li><li> 250μlの酢酸/メタノール（1:9、v / v）を、渦を追加し、25℃蒸発˚C </li><li> （3回の合計のために繰り返す）250μlのメタノールを加え、そして空気の気流下で蒸発</li><li>アルジトールのアセチル化のために、無水酢酸とピリジン50μlの50μlを加える121℃で20分間ジアミン、渦とインキュベートします加熱ブロックのC。 </li><li>氷のブロックのクールダウンサンプルは、ほぼ室温に温度の低下を待っている間。 </li><li>室温で空気中の穏やかな流れの下で試薬を蒸発させる。注意してください：アルジトールアセテート、揮発性の高いです。 </li><li>空気の下で200μlのトルエンを追加し、蒸発させる（X3） </li><li>最後のステップではアルジトールアセテートが抽出されます。最初に、酢酸エチルと軽く渦を500 ulを加える。 </li><li>水、キャップ管と渦の2 mlを加える。 </li><li>明確な別のレイヤーを取得するために5分間2,000 rpmでチューブを遠心（上に酢酸エチル、底の水） </li><li>インサート付きGC / MSバイアル​​に酢酸エチル層のピペット50μlの。 </li><li> GC -バイアルとキャップにアセトン100 ulを加えることにより希釈する。サンプル濃度が高すぎると試料量と希釈のボリュームは、GC / MSの過負荷を避けるために調整することができます。 GC / MS分析が直ちに行われない場合、GC -バイアルは、4℃で保存することができます</li><li>サンプルは、四重極MSが装備されているGCに注入し、しかし、水素炎イオン化検出器も適しています。スペルコSP - 2380（30ミリメートルX 0.25ミリメートル× 0.25μmの膜厚）の列が4分溶剤遅延と1.5ml/minの流量で使用されます。注入されたサンプルは、次の温度プログラムに供される：160時の初期ホールド℃で2分間、20℃〜200℃/分のランプ℃、5分間保持、20℃〜245℃/分のランプ° Cとホールド12分、270〜スパイク° Cおよび160 ° C 2.26の初期温度に冷却する前に5分間保持）ピークが基準の質量プロファイル及び/または保持時間で識別されます。。単糖類は、標準曲線に基づいて定量化されています。 </li></ol> 3。結晶セルロースのコンテンツこのメソッドは本質的にUpdegraf 8で記述されています。隔離された細胞壁物質（1を参照）または既に2M TFA（2.8参照）のどちらか、残りのペレットすぐに酸処理後の（2.8参照）またはTFAで処理されている壁材：この手順のための出発物質は数多くあります2 - プロパノールで洗浄し、乾燥されたペレット、。 <ol><li>アップダグラフの試薬のスクリューキャップ付きガラス管1ミリリットル（：硝酸：水、午前8時01分02秒V / V酢酸）にTFAペレットに追加します。 </li><li> 100℃の加熱ブロックにしっかりとキャップチューブ、渦、および熱℃で30分間。この治療の結果として、唯一の結晶セルロースは、ペレットに不溶のまま。 </li><li>室温やクーラーに氷の上にブロックでクールサンプル</li><li> 15分間10,000 rpmでサンプルを遠心</li><li>ペレットが乱れていないと削除されたペレットからの材料されていないことを確実に上清を捨てる。この目的のために約残す。チューブの上清の150μlを。 </li><li> 、遠心分離機を振る、水1.5mlを追加し、上記で行ったように上清を捨てる</li><li>洗浄手順のアセトン1.5mlを用いてさらに3回繰り返す</li><li>空気乾燥した空気と非常に穏やかにペレット、または一晩ベンチに乾燥させる</li><li>ペレットは、（結晶セルロース）Saemanの加水分解と呼ばれるもので、今グルコースに完全に加水分解される。この目的は、ザルスタットのチューブに175μlの72％の硫酸を加えるために</li><li>別の15分間、30分間、渦とインキュベート室温でインキュベート</li><li> 825μLの水と渦を追加する</li><li> 5分間10,000 rpmでサンプルを遠心する。チューブに残っているいくつか茶色の不溶性物質、リグニン、あるかもしれません。 </li><li>上清のグルコース含有量は、比色アントロンアッセイを用いてアッセイされる。このアッセイは96ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレートで実行されます。 </li><li>標準曲線は、1mg/mlグルコースの株式を（0 ° Cで保存されている）を使用して、0、2、4、6、8、10 ulのピペッティングして0、2、4、6、8、および10μgの規格を重複作成するための別の適切なウェルに。水で100μlを各ウェルに埋めます。 </li><li>別々のセルに、標準のと同じマイクロタイタープレート上に各サンプルの上清10μlと水90 mlを加える。 </li><li>作りたてのアントロン試薬（濃硫酸に溶解したアントロン、2 mgをアントロン/ mlの硫酸）の200μlを加える</li><li> 80℃30分間熱板オーブンで° C（アルミのヒートスプレッダ）。グルコースを含む試料は黄色から青緑色に変わります。 </li><li>室温にプレートが冷ますと徹底的に振る。 </li><li>マイクロタイタープレートリーダーを用いて625ミリメートルで、プレートの吸収を読み取る。 </li><li>グルコース（それゆえ、結晶セルロースの含有量）は同じプレート上で確立された標準曲線と比較して吸光度に基づいて計算されます。 </li></ol> 4。代表的な結果壁の解析の例を図2に示す。この場合にはポプラの幹（木）は、プロトコルのセクションで概説、様々な手順で分析した。行列POlysaccharide組成物を植物細胞壁における典型的な砂糖の存在を識別する例のクロマトグラムで強調表示されている、フコース、ラムノース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノースとグルコース（および内部標準イノシトール）。高キシロースの含有量によって示されるようにポプラの主要なヘミセルロース成分はキシランである。しかし、これらの糖の存在量は、原料のused4によって異なります。この分析でグルコースは、ヘミセルロースのキシログルカンとアモルファスセルロースから導出されます。分析によるデータは、モル％またはUG / mgの壁材（または乾燥重量）として提示することができます。結晶セルロースの含有量は自明である、一つの壁乾燥重量の20〜50％の間の値を期待することができます。ここに示された結果に基づいており、パートI3にポプラ​​材のリグノセルロース系組成は21％のリグニン、30％のヘミセルロース、および41％の結晶セルロースである。残りは灰になる。 <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：。リグノセルロースの分析の概要細胞壁（リグノセルロース）は、原油乾燥植物材料から分離されています。壁材は、アリコートに重み付けをし、様々なアッセイのために分割されます。マトリックス多糖組成物は、弱酸（2M TFA）と壁材を扱う彼らのアルジトールアセテートに結果の可溶化単糖類を誘導体化し、GC - MSによる分析の後に確立されます。弱い酸処理の残渣を背後のみ不溶性crystllineのセルロースを残し、いわゆるアップダグラフの試薬で洗浄する。セルロースを硫酸で溶解し、グルコースの含有量を決定する比色分析によって定量化される。パートI 3で説明したように並行して、リグニンの含有量と組成を決定することができます。 <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：ポプラ（ ポプラtremoloides）からポプラ樹木木材チップの包括的なリグノセルロースの分析は、記載されたプロトコールを行った。 左上：マトリックス多糖組成物;フコースフコース、RHAラムノース、荒アラビノース、キシロースXYL、マンノースマン、ギャルガラクトース、グルコースのグルコース、イノシトール内部標準。

<ol><li>Albersheim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+analysis+of+sugars+in+plant+cell+wall+polysaccharides+by+gas-liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography.</a> Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).</li>
<li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulosic+Biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellulosic Biofuels.</a> Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).</li>
<li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+%28Lignocellulosic+biomass%29%2C+Part+I%3A+Lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).</li>
<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant-cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward a systems approach to understanding plant-cell walls.</a> Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).</li>
<li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterisation+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar%3A+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endotransglycosylases%5BTitle%5D)+AND+%22Biocatalysis+and+Biotransformation%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li>
<li>UPDEGRAF, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEMIMICRO+DETERMINATION+OF+CELLULOSE+IN+BIOLOGICAL+MATERIALS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS.</a> Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).</li>
</ol>

記載された方法は、リグノセルロース系植物バイオマスの組成の迅速な定量的評価を有効にしてください。方法は、すなわちマトリックス多糖類ヘミセルロースの糖組成、結晶セルロースの含有量を含むような材料の組成の決定が可能になります。お一人様、様々な分析手法のスループットが異なります。ここに記載されているプロトコルを使用して、20サンプルは、結晶セルロースの含有量のための行列の多糖組成物および30で処理することができます。データに最適な原料作物の定量的な性質のために、様々なまたは遺伝子型は、バイオ燃料生産のためのその適合性の観点で評価することができる。

<table><tbody><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>myo-イノシトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>水素化ホウ素ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>ピリジン</td><td>JT Baker</td><td>3348-01</td><td></td></tr><tr><td>無水酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Spectromax Plus 384</td><td>Molecular Devices</td><td>Plus384</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>7890A GC/5975C MSD</td><td></td></tr><tr><td>5.5mm ステンレスボール</td><td>Salem Ball Company</td><td>(N/A)</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート用ヒートスプレッダー</td><td>Biocision</td><td>Coolsink 96F</td><td></td></tr><tr><td>レッチミル</td><td>Qiagen</td><td>TissueLyser II</td><td></td></tr><tr><td>ヒーティングブロック</td><td>Techne</td><td>Dri-block DB-3D</td><td></td></tr><tr><td>サンプル濃縮機</td><td>Techne</td><td>FSC400D</td><td></td></tr></tbody></table>

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートii：炭水化物

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

産業と社会のための再生可能エネルギー、カーボンニュートラル、そして持続可能な原材料の必要性は、21世紀の最重要課題の一つとなっている。これは輸送用液体燃料の生産のための工業用原料としての植物製品の使用に関心を再燃させたている<sup&gt; 2</sup&gt;このようなbiocomposite材料として他の製品<sup&gt; 6</sup&gt;。植物バイオマスは地球上で最大の未開発の埋蔵量の一つである<sup&gt; 4</sup&gt;。それは主にセルロース、様々なヘミセルロース、およびポリフェノールリグニンを含むエネルギーリッチなポリマーで構成されている細胞壁で構成されています<sup&gt; 5</sup&gt;そのため、時にはリグノセルロースと呼ばれる。しかし、植物の細胞壁は、壁は強度とプラント全体の構造的完全性に広く貢献して劣化に手に負えないように進化してきた。その必要な剛性にもかかわらず、細胞壁は、代謝的に活性であり、そのような植物の成長や分化などの多くの細胞活動において重要な役割を果たしている非常に動的なエンティティです。<sup&gt; 5</sup&gt;。壁の様々な機能が原因で、単一工場内の異なる植物種や細胞タイプの城壁内に巨大な構造の多様性がある<sup&gt; 4</sup&gt;。したがって、作物種、作物​​の品種、又は植物組織がバイオリファイナリーのために使用されているものによっては、化学/酵素的プロセスと液体バイオ燃料への様々な糖のその後の発酵による解重合のための処理手順を調整し最適化する必要があります。この事実を支える植物のバイオマス原料の徹底した特性評価のための必要性。ここでは、リグノセルロースの組成の決定を可能にし、ハイスループット分析への培地（図1）を受けやすい包括的な分析方法を説明します。このメソッドはdestarched細胞壁の材料を準備してから始まります。結果として得られるリグノセルロースは、そのヘミセルロースの単糖類組成と他の行列polysaccharides1、及び結晶セルロースのその内容を決定するために分割されます<sup&gt; 7</sup&gt;。リグノセルロース系バイオマスのリグニン成分を分析するためのプロトコルは、私はパートで説明されています<sup&gt; 3</sup&gt;。

植物バイオマスは、バイオ燃料の生産に使用できる主要なカーボンニュートラルな再生可能な資源です。植物バイオマスは、主に細胞壁、リグノセルロースと呼ばれる構造的に複雑な複合材料で構成されています。ここでは、壁由来の炭水化物の含有量と組成の包括的な分析のためのプロトコルについて説明します。

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートII：炭水化物

産業および社会にとって、再生可能でカーボンニュートラルかつ持続可能な原材料への需要は、21世紀において最も差し迫った課題の一つとなっています。

植物細胞壁のマトリックス多糖組成および結晶性セルロース含有量の測定は、乾燥させた植物試料から開始し、さまざまな抽出処理を行います。得られた試料は細胞壁のみで構成されており、その後、マトリックス多糖組成を決定するために分割されます。細胞壁試料を弱酸で処理し、非結晶性多糖（主にヘミセルロース）を単糖に加水分解します。その後、単糖類を対応する揮発性アルドール酢酸に誘導体化し、ガスクロマトグラフ質量分析計で分析・定量することで、結晶性セルロースの決定を行います。細胞壁は、非結晶性の壁成分を除去する酸の混合物であるグラフ試薬で処理します。残った結晶性セルロースを単量体であるグルコースに分解し、これを比色法で測定します。リグニン含有量および組成の測定については、別のJoVEビデオ出版物「Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part One Lignin」で詳しく説明しています。こんにちは。ミシガン州立大学のGreat Lakes Bioenergy Research Centerにて、Cell Wall分析施設の責任者を務めているMarcus Pauleyです。私はCell Wall分析施設のマネージャーを務めているCliff Fosterです。本日は、さまざまなホモセルロースにおけるセルロースである植物細胞壁材料に存在する多糖類の組成を決定する方法について説明します。ここグレートレイクス・バイオエネルギー研究センターでは、これらの糖をバイオ燃料に変換する技術を開発しています。最適な植物原料を特定するためには、まずこのバイオマスにどのような種類の糖がどの程度含まれているかを評価する必要があります。「植物細胞壁の包括的な組成分析：パート1 リグニン」と題された別のビデオでは、ポリフェノール分析に焦点を当てます。それでは始めましょう。まず、細胞壁を単離することからこの手順を開始します。乾燥させた植物試料約60～70 mgを、2 mlのSAR TEDスクリューキャップチューブ内で、5.5 mmのステンレス製ボールを用いて粉砕します。ハイスループットな代替手段としてREMミルを使用する場合は、パート1で説明したeyewallと呼ばれる粉砕・分注ロボットを使用してください。粉砕が完了したら、ステンレス製ボールを取り出します。パート1に示され、付随する書面プロトコルに記載されている通りに、細胞壁の単離と残留デンプンの除去を継続します。2 mgのDSデンプン細胞壁物質を2 mLサレッドチューブに量り取ります。この作業をハイスループットに行うには、eyewallロボットが有効です。ロボットが粉砕した植物試料を含むチューブを取り出し、チューブの底に穴を開けます。穴を開けたチューブをVIフィーダーにセットします。空のチューブを天秤に載せ、振動によってVIフィーダーの下へ移動させます。試料が上のチューブの穴から浸透して下の空チューブに入り、所定の量が蓄積されるまでこの操作を繰り返します。内部標準として100 µgのアセトールを添加します。チューブ壁をアセトンで洗浄して、細胞壁物質をチューブの底に回収し、気流下でアセトンを非常に緩やかに蒸発させます。次に、弱酸加水分解を行います。各サンプルに2 Mのトリクロロ酢酸またはTFAを250 µL慎重に加え、チューブの壁面に液が跳ね上がらないようにしてください。チューブの蓋をしっかりと閉め、ヒーティングブロックを用いて121 °Cで90分間インキュベートします。その後、ヒーティングブロックとサンプルを氷上で冷却し、チューブを10,000 RPMで10分間遠心分離します。マトリックス多糖類の可溶化糖を含む酸性上清100 µLを、ペレットを乱さないように注意しながらスクリューキャップバイアルに分注します。このペレットは結晶性セルロース分析に使用できます。蒸発装置を用い、ガラスチューブ内のTFAを緩やかな空気流で蒸発させます。過剰な酸を除去するために、2-プロパノールを300 µL加え、ボルテックスして25 °Cで蒸発させます。この操作を計3回繰り返します。ガスクロマトグラフィーで単糖類を同定できるようにするため、アルドール酢酸エステル誘導体化を行います。まず、単糖を対応する開環アルドールに還元し、次にアセチル化します。詳細な手順については、付属の書面によるプロトコルを参照してください。手順の各ステップは、先に示したプロトコルに従い、試薬の添加、インキュベーション、気流下での蒸発を行い、その後、さまざまな洗浄ステップによって過剰な試薬を除去します。最終ステップとして、アルドール酢酸エステルを抽出します。まず、500 µLの酢酸エチルを加え、軽く回旋させます。次に、2 mLの水を加え、チューブに蓋をしてボルテックスし、2000 RPMで5分間遠心分離します。これにより、上層にアルドール酢酸エステルを含む酢酸エチル層、下層に水層という明確な二層分離が得られます。酢酸エチル層から50 µLをインサート付きのGC-MSバイアルにピペットで分取します。GCバイアルに100 µLのアセトンを加えて希釈し、このGCバイアルを4 °Cで保存することが可能です。GC-MS分析をすぐに開始できない場合は、四重極質量分析計を備えたガスクロマトグラフにサンプルを注入してください。カラムおよび分析の詳細については、付属の書面によるプロトコルを参照してください。結晶性セルロース含有量を決定するための出発材料は、単離した細胞壁材料、または弱酸であるTFAで処理済みの壁材料（酸処理直後、または保存可能な乾燥状態のいずれか）を使用できます。前述のようにイソプロパノールで過剰なTFAを除去した後、2 Mのsars内のTFAペレットに、酢酸、硝酸、水で調製した1 Mのup degra試薬を、体積比8:1から2:1で加えます。チューブの蓋をしっかりと閉め、ボルテックス後、ヒーティングブロックを用いて100 °Cで30分間加熱します。この処理により、ペレット内には結晶性セルロースのみが残ります。その他のすべての多糖類は加水分解します。ブロックを用いて、サンプルを氷上で室温またはそれ以下まで冷却します。次に、サンプルを10,000 RPMで15分間遠心分離します。遠心分離後、ペレットを乱さず、またペレットの一部を除去しないように注意して上清を捨てます。このため、チューブ内に上清を約150 microliters残し、ペレットを水で数回洗浄してください。次に、結晶およびセルロースペレットを完全にグルコースまで加水分解するため、濃硫酸を用いて酸加水分解を行います。まず、sartaチューブに72%硫酸を175 µL加え、室温で30分間インキュベートします。最初のインキュベーション後、サンプルをボルテックスし、さらに15分間インキュベートします。次に825 µLの水を加え、ボルテックスした後、サンプルを10,000 RPMで5分間遠心分離します。チューブ内には、主にリグニンと思われる茶色の可溶性物質が残る可能性がありますが、グルコースは上清に含まれます。上清中のグルコース含量をアントロン比色法を用いて測定します。このアッセイは、96ウェルポリスチレン製マイクロタイタープレートを用いて行います。付属の書面プロトコルの指示に従い、グルコース標準曲線をデュプリケートで作成します。各サンプルの上清10 µLと水90 µLを混合し、標準試料と同じマイクロタイタープレートの別々のウェルに分注してサンプルを調製します。最後に、調製直後の試薬200 µLを加えて完了します。次に、アルミ製ヒートスプレッダーを用いたオーブン内で、プレートを80°Cで30分間加熱します。加熱完了後、グルコース含有サンプルが黄色から青緑色に変化することを確認してください。プレートを室温まで冷却し、十分に振とうします。マイクロプレートリーダーを用いて625 nmにおける吸光度を測定します。セルロースの構成単位であるグルコースの含有量は、同一プレート内で作成した標準曲線に基づいた吸光度から算出します。以下に、ポプラ材の多糖類分析における代表的な結果を示します。ガスクロマトグラムのピークは、標準物質のマスプロファイルおよび／または保持時間によって同定されます。単糖類は標準曲線に基づいて定量します。マトリックス多糖類の糖分析では、ヘミセルロースを示すキシロースが多量に検出されましたが、その他の糖も存在しています。分析によれば、ポプラ試料の40%が結晶およびセルロースで構成されています。これらの含有量および組成は、個々の植物間や、同一植物内の異なる部位によって異なる場合があることに注意してください。以上で、ポリフェノールリグニンの分析に向けた、リグノセルロース系バイオマスの多糖類含有量の決定および組成分析の方法を説明しました。パート1をご覧ください。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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生物学

植物バイオマスは、バイオ燃料の生産に使用できる主要なカーボンニュートラルな再生可能な資源です。植物バイオマスは、主に細胞壁、リグノセルロースと呼ばれる構造的に複雑な複合材料で構成されています。ここでは、コンテンツとポリフェノールリグニンの組成の包括的な分析のためのプロトコルについて説明します。...

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートI：リグニン

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共焦点ラマン顕微鏡法に基づく方法は、ラベルフリー植物細胞壁中のリグニンの可視化と異なる組織、試料や種の木質化の比較に支払うよう提示される。...

ラベルフリーその場で</em植物細胞壁の木化の>イメージング

マイクロアレイを用いた植物細胞壁ポリマーの糖鎖プロファイリング

本研究の目的は、nanocelluloseフィブリル、希水性懸濁液から組み立てられた単離されたリグニンのレイヤーバイレイヤーアセンブリを使用して合成植物細胞壁組織を形成することであった。水晶振動子マイクロバランスおよび原子間力顕微鏡の表面測定技術は、ポリマー - ポリマーナノ複合材料の形成をモニターするために使用した。...

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のリグニンダウンレギュレーション<em&gt;トウモロコシ</em&gt; dsRNAiとクラソンリグニン分析によって

植物の細胞壁の構造と化学的特性が評価され、バイオ燃料とバイオマテリアルの理想的な原料を特定します。標準メソッドを大規模なデータセットに適用すると、制限があります。これらのハイスループット前処理法、酵素糖化法、および熱分解分子ビーム質量分析法は、実験時間とコストを削減しながら、大量のバイオマスサンプルを比較します。...

リグノセルロース系バイオマス中の反抗バリエーションのハイスループットスクリーニング：総リグニン、リグニンモノマー、および酵素シュガーリリース

このプロトコルは、ラマンイメージングおよび多変量解析を用いて、植物細胞壁のリグニン、セルロースおよびヘミセルロースを視覚化するための一般的な方法を提示することを目的とする。...

ラマンイメージングと多変量解析を組み合わせて、植物細胞壁のリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを視覚化する

マンナン ペースを用いた植物細胞壁多糖の構造解析

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真菌の準備、動的核偏極固体 NMR を用いた構造解明のための植物素材

Updegraff法はセルロース推定に最も広く用いられている方法です。本デモの主な目的は、植物バイオマスサンプル中のセルロース含有量を推定するための詳細なUpdegraffプロトコルを提供することです。...

Updegraff法による植物バイオマスの結晶セルロース含有量の推定

学ぶ植物細胞壁の炭水化物組成分析法。乾燥試料からマトリックス多糖と結晶性セルロースを抽出し、弱酸加水分解とGC-MSで定量します。バイオ燃料原料の最適化に有用です。

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートII：炭水化物

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