植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートII：炭水化物

植物細胞壁のマトリックス多糖類組成と結晶性セルロース含有量の決定は、さまざまな抽出にかけられる乾燥植物材料から始まります。得られた材料は細胞壁のみで構成され、その後分割されてマトリックス多糖類の組成が決定されます。壁材は、主にヘモセルロースをそれらの単糖類にしている非結晶性多糖類を加水分解するために弱酸で処理されます。

次に、単糖類は対応する揮発性アルドールアセテートに誘導され、質量分析計と組み合わせたガスクロマトグラフィーによって分析および定量され、結晶性セルロースが測定されます。内容物の壁は、非結晶性壁成分を剥ぎ取る酸の混合物であるグラフ試薬で処理されます。残りの結晶性セルロースは、そのモノマーグルコースに分解され、これは測定法で分析することができます。

リグニンの含有量と組成の測定は、Jのビデオ出版物「Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part One Lignin」で実証されています。こんにちは、私はマーカス・ポーリー、ここミシガン州立大学の五大湖バイオエネルギー研究センターの壁分析施設の責任者です。私はCliff Fosterで、Cell Wall Analytical施設のマネージャーです。

今日は、さまざまなホモセルロースのセルロースである植物細胞壁材料に存在する多糖類の組成を決定する方法を示します。ここ五大湖バイオエネルギー研究センターでは、これらの糖をバイオ燃料に変換する技術を開発しています。最適な植物原料を特定するためには、まず、このバイオマスに存在する糖の種類と豊富さを評価する必要があります。

「Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part one Lignin」と題された別のビデオでは、ポリフェノール分析に焦点を当てます。それでは始めましょう。この手順は、細胞壁を分離することから始めます。

約60〜70ミリグラムの乾燥植物材料を5.5ミリメートルのステンレス鋼球で2ミルSARTEDスクリューキャップチューブで粉砕します。ハイスループットの代替手段としてREMミルを使用する場合は、パート1で説明したように、アイウォールと呼ばれる研削およびディスペンシングロボットを使用します。研削が終わったら、鋼球を取り出します。

引き続き細胞壁を分離し、パート1で示され、添付の書面によるプロトコルに記載されているように、残留デンプンを除去します。2ミリグラムのDSデンプン細胞壁材料を2ミルのサレドチューブに計量します。このタスクを実行するための高スループットの方法は、アイウォールロボットです。

ロボットは、地面の植物材料が入ったチューブを取り、チューブの底に穴を開けます。次に、穴を開けたチューブをVIフィーダーに配置します。空のチューブを天秤上に置かれ、VIフィーダーの下に移動させ、振動材料が装填された上部チューブの穴から空の下部チューブに浸透し、目的の量の材料が蓄積されます。

100マイクログラムのアセトールを内部標準として追加します。チューブ壁をアセトンですすいで、チューブの底に細胞壁材料を集め、エアフロー下でアセトンを非常に穏やかに蒸発させます。次に、弱酸加水分解を行います。

250マイクロリットルの2モルトリクロロ酢酸またはTFAを各サンプルに慎重に追加し、チューブの壁に材料が飛び散らないようにします。チューブにしっかりと蓋をし、摂氏121度で加熱ブロック内で90分間インキュベートします。次に、加熱ブロックとサンプルを氷上で冷却し、チューブを10、000 RPMで10分間遠心分離します。

マトリックス多糖類の可溶化糖を含む酸性上清100マイクロリットルをスクリューキャップバイアルに移し、ペレット材料を乱さないようにします。ペレットは結晶性セルロースアッセイに使用できます。蒸発装置内の穏やかな空気の流れの下で、ガラス管内のTFAを蒸発させます。

300マイクロリットルの2つのプロパノールを加えて余分な酸の渦を取り除き、摂氏25度で蒸発させます。合計3回繰り返します。ガスクロマトグラフィーによる単糖類の同定を可能にするために、アルドールアセテート誘導体化を行います。

まず、単糖類を対応する開放環アルドールに還元し、次にアセチル化します。詳細な手順については、付属の書面によるプロトコルを参照してください。手順の各ステップは、前述のプロトコル、すなわち、空気の流れの下での試薬インキュベーション蒸発の添加、続いて種々の洗浄ステップによる過剰な試薬の除去という手順に従います。

最後のステップでは、酢酸アルドールが抽出されます。まず、500マイクロリットルの酢酸エチルを加えて軽く渦巻きます。次に、2ミルの水を加え、チューブとボルテックスをキャップし、チューブを2000RPMで5分間遠心分離して、上部に酢酸エチルとアルデトールアセテートを含む上部に酢酸エチルと水、下部ピペットに50マイクロリットルの酢酸エチル層をGCMSバイアルに含んだ透明な別々の層を得るGCMSバイアルに100マイクロリットルのアセトンをGCバイアルに追加して希釈し、GCバイアルを摂氏4度で保存することができます。

GCMS分析がすぐに進行しない場合は、4重質量分析計を備えたガスクロマフォトグラファーにサンプルを注入します。実行の列と詳細については、添付の書面によるプロトコルを参照してください。結晶性セルロース含有量を決定するための出発材料は、酸処理の直後に、または保存可能な乾燥形態のいずれかで、単離された細胞壁材料または弱酸TFAで既に処理された壁材料であり得る。

前に示したようにイソプロパノールで余分なTFAを取り除いた後、酢酸、硝酸および水からなるアップデグラ試薬の1つのMをチューブに2つのM sarsのTFAペレットに加え、体積に対する体積比を8対1対2で加えます。チューブをしっかりと渦巻き、摂氏100度の加熱ブロックで30分間加熱します。この処理の結果として、ペレットには結晶性セルロースのみが残ります。

他のすべての多糖類は、氷上のブロック内で冷たくなったサンプルを室温またはそれより低温に加水分解されます。次に、遠心分離後15分間、サンプルを10、000 RPMで遠心分離し、上清を捨てて、ペレットが乱されず、ペレットから材料が除去されないようにします。この目的のために、約150マイクロリットルの上清をチューブに残し、ペレットを水で数回洗います。

次に、同じことを行い、濃硫酸で加水分解して、結晶とセルロースペレットを完全にグルコースに加水分解します。サルタチューブに175マイクロリットルの72%硫酸を加えることから始め、室温で30分間インキュベートします。最初のインキュベーション後、サンプルをボルテックスし、さらに15分間インキュベー

次に、825マイクロリットルの水とボルテックスを加え、サンプルを10、000 RPMで5分間遠心分離します。茶色の可溶性物質がいくつかある可能性があり、主にリグニンがチューブ内に残っていますが、ブドウ糖は上清にあります。上清のグルコース含有量は、Colormetricアントンアッセイを使用してアッセイされます。

このアッセイは、96ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレートで行います。グルコース標準曲線を、添付の書面によるプロトコルの指示に従って重複して修復します。各サンプルの10マイクロリットル、スーパーナット、および90マイクロリットルの水を、調製して投入したばかりの試薬200マイクロリットルを標準仕上げと同じマイクロタイタープレートの別々のウェルに組み合わせてサンプルを調製します。

次に、アルミニウム製ヒートスプレッダーを備えたオーブンでプレートを摂氏80度で30分間加熱します。加熱が完了すると、グルコースを含むサンプルが黄色から青緑色に変わるのを観察します。プレートを室温まで冷まし、よく振ってください。

マイクロタイタープレートリーダーを使用して、625ナノメートルでの吸収を読み取ります。グルコースの含有量は、セルロースのビルディングブロックであり、同じプレート上に確立された標準曲線と比較した吸光度に基づいて計算されます。ここでは、ポプラ材の多糖類分析の代表的な結果をご紹介します。

ガスクロマトグラムのピークは、標準試料の質量プロファイルや保持時間によって識別されます。単糖類は、標準曲線に基づいて定量化されます。マトリックス多糖類の糖分析では、ヘミセルロースxamを表すキシロースが豊富に存在していますが、他の糖も存在します。

分析によると、ポプラ材の40%は結晶とセルロースで構成されています。これらの内容物および組成物は、植物ごと、または異なる植物の解剖学的構造間で異なる場合があることに留意されたい。ポリフェノールリグニンの分析のためのリニャーナノセルロース系バイオマスの多糖類含有量と組成分析を決定する方法を示しました。

パート1をご覧ください。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。