Name: の精製 M. magneticum株AMB - 1 Magnetosome関連タンパク質MamAΔ41 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-25T16:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学ぶMamAΔ41タンパク質精製法。M. magneticum AMB-1由来マグネトソーム関連タンパク質の親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーを用いた精製プロトコルとオリゴマー状態解析手法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は、彼らのアドバイスやコメントのための彼のサポートとGeula Davidov、ノームGrimbergと陳グットマンのために博士アミールAharoniを認めます。

<ol><li>Faivre, D., Schuler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetotactic+Bacteria+and+Magnetosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes.</a> Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).</li>
<li>D'Andrea, L. D., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPR+proteins%3A+the+versatile+helix%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">TPR proteins: the versatile helix.</a> Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).</li>
<li>Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. lrich, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+folding%3A+localized+functions+of+cytosolic+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">More than folding: localized functions of cytosolic chaperones.</a> Trends Biochem Sci. 28, 541-547 (2003).</li>
<li>Brocard, C., Hartig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+targeting+signal+1%3A+is+it+really+a+simple+tripeptide%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Peroxisome targeting signal 1: is it really a simple tripeptide?</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1565-1573 (2006).</li>
<li>Fransen, M., Amery, L., Hartig, A., Brees, C., Rabijns, A., Mannaerts, G. P., Van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+PTS1-+and+Rab8b-binding+properties+of+Pex5p+and+Pex5Rp%2FTRIP8b%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of the PTS1- and Rab8b-binding properties of Pex5p and Pex5Rp/TRIP8b.</a> Biochim Biophys Acta. 1783, 864-873 (2008).</li>
<li>Baker, M. J., Frazier, A. E., Gulbis, J. M., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein-import+machinery%3A+correlating+structure+with+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein-import machinery: correlating structure with function.</a> Trends Cell Biol. 17, 456-464 (2007).</li>
<li>Mirus, O., Bionda, T., von Haeseler, A., Schleiff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+evolved+discriminators+in+the+3-TPR+domain+of+the+Toc64+family+involved+in+protein+translocation+at+the+outer+membrane+of+chloroplasts+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Model%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily evolved discriminators in the 3-TPR domain of the Toc64 family involved in protein translocation at the outer membrane of chloroplasts and mitochondria.</a> J Mol Model. 15, 971-982 (2009).</li>
<li>Gatsos, X., Perry, A. J., Anwari, K., Dolezal, P., Wolynec, P. P., Likic, V. A., Purcell, A. W., Buchanan, S. K., Lithgow, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+and+outer+membrane+assembly+in+Alphaproteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein secretion and outer membrane assembly in Alphaproteobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 32, 995-1009 (2008).</li>
<li>Tiwari, D., Singh, R. K., Goswami, K., Verma, S. K., Prakash, B., Nandicoori, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+residues+in+Mycobacterium+tuberculosis+protein+kinase+G+play+a+role+in+regulating+kinase+activity+and+survival+in+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Key residues in Mycobacterium tuberculosis protein kinase G play a role in regulating kinase activity and survival in the host.</a> J Biol Chem. 284, 27467-27479 (2009).</li>
<li>Edqvist, P. J., Broms, J. E., Betts, H. J., Forsberg, A., Pallen, M. J., Francis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratricopeptide+repeats+in+the+type+III+secretion+chaperone%2C+LcrH%3A+their+role+in+substrate+binding+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tetratricopeptide repeats in the type III secretion chaperone, LcrH: their role in substrate binding and secretion.</a> Mol Microbiol. 59, 31-44 (2006).</li>
<li>Grunberg, K., Muller, E. C., Otto, A., Reszka, R., Linder, D., Kube, M., Reinhardt, R., Schuler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+proteomic+analysis+of+the+magnetosome+membrane+in+Magnetospirillum+gryphiswaldense%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and proteomic analysis of the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1040-1050 (2004).</li>
<li>Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosome+vesicles+are+present+before+magnetite+formation%2C+and+MamA+is+required+for+their+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 3839-3843 (2004).</li>
<li>Okuda, Y., Fukumori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+a+magnetosome-associated+protein%2C+TPR-containing+MAM22%2C+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of a magnetosome-associated protein, TPR-containing MAM22, in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 491, 169-173 (2001).</li>
<li>Taoka, A., Asada, R., Sasaki, H., Anzawa, K., Wu, L. F., Fukumori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+localizations+of+Mam22+and+Mam12+in+the+magnetosomes+of+Magnetospirillum+magnetotacticum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spatial localizations of Mam22 and Mam12 in the magnetosomes of Magnetospirillum magnetotacticum.</a> J Bacteriol. 188, 3805-3812 (2006).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li>
</ol>

タンパク質の精製は、任意のタンパク質生化学的または構造的な研究の主要なステップです。それぞれの蛋白質がそれ自身の動作と一意であるため、人はそのプロパティを定義し、それに応じてその精製を変更する必要があります。蛋白質のターゲットは、バイオインフォマティクスのツールを使用して精製するための第一歩として分析する必要があります。彼らは、環境と特殊なイオン/配位子の必要性を減らす/酸化性の必要性を評価し、目標等電点を計算するために使用されています。ターゲットの一意性を反映して我々のプロトコルのいくつかの重要な変更があります。これらの変更は、バッファ、動作温度とカラムの調整が含まれています。 最初の重要な変更は、使用中のバッファである（3.3節）このようなバッファは、正しいpH範囲、イオン/リガンドとタンパク質の安定性や機能に必要なイオン強度を反映するように変更する必要があります。ターゲットが不安定の兆候（劣化、降水量や機能の損失）を示す場合、1つは、テストおよび他のより適切なバッファを検索する必要があります。別の重大な問題は、精製のスピードと動作温度です。タンパク質分解（プロテアーゼまたはタ...

<table><tbody><tr><td>フレンチプレス</td><td>機器</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-078A</td><td></td></tr><tr><td>プレッシャーセル</td><td>機器</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr><tr><td>超遠心機</td><td>機器</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>Discovery 90SE</td><td></td></tr><tr><td>ローター</td><td>機器</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Ti60</td><td></td></tr><tr><td>超遠心機チューブ；PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml</td><td>機器</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>BC-355618</td><td></td></tr><tr><td>直径2.5cm ガラス製エコノカラムクロマトグラフィーカラム</td><td>機器</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2521</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA His Bind レジン</td><td>機器</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>M0063428</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>機器</td><td>Amersham</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>石英キュベット</td><td>機器</td><td>Hellma</td><td>104-QS</td><td></td></tr><tr><td>高速液体クロマトグラフィー- AKTA purifier 10</td><td>機器</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>イオン交換カラム &amp;#8211; MonoQ 4.6/100 PE</td><td>機器</td><td>GE Healthcare</td><td>10025543</td><td></td></tr><tr><td>サイズ排除充填済みカラム-HiLoad 26/60 Superdex 200</td><td>機器</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1071-01</td><td></td></tr><tr><td>Centricon - Vivaspin15 &amp;#8211; 10,000 MWCO</td><td>機器</td><td>Sartorius AG</td><td>VS1501</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心機</td><td>機器</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>IEC CL30R</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>機器</td><td>Bruker Corporation</td><td>Reflex IV</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (ヒドロキシメチル)アミノメタン</td><td>試薬</td><td>BioLab</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>試薬</td><td>FRUTROM</td><td>235553470</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>試薬</td><td>Alfa Aesar</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8849</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I (デオキシリボヌクレアーゼ I)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>ウシ由来トロンビン</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP25432</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>試薬</td><td>BioLab</td><td>07132391</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>試薬</td><td>BioLab</td><td>19822391</td><td></td></tr><tr><td>β-メルカプト&amp;#8211;エタノール</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>試薬</td><td>Expedeon</td><td>1SB01L</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler プレステイン プロテインラダー</td><td>試薬</td><td>Fermentas</td><td>SM0671</td><td></td></tr></tbody></table>

の精製 m. magneticum株amb - 1 magnetosome関連タンパク質mamaΔ41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

走磁性細菌は、地磁気のフィールドに沿って自分自身をオリエンテーションすることができる水生微生物の多様なグループを構成。この動作は、適切な環境のための彼らの検索を支援するために考えられている<em&gt;（1）</em&gt;。この機能はmagnetosomeにより付与され、脂質の直鎖アセンブリから構成される細胞内小器官は、マグネタイトまたはグレイジャイトの〜50 nmの結晶をbiomineralizeと囲むようにそれぞれができるように小胞。機能的な小胞の形成に必要なことが示されmagnetosomeの主成分はママです。ママは最も特徴付けmagnetosome関連タンパク質の一つである非常に豊富magnetosome関連タンパク質である<em&gt; in vivoで</em&gt;<em&gt;（2-6）</em&gt;。この記事では、ママの浄化に焦点を当てている研究されているにもかかわらず<em&gt; in vivoで</em&gt;、明確な機能的または構造的細部​​は、それのために同定されていない。バイオインフォマティクス解析には、ママがタンパク質を含むテトラ- tricopeptideリピート（TPR）であることが示唆された。 TPRは、蛋白質の広い範囲で大きな倍のようなまたは一部を形成するように見られる構造モチーフである、それはタンパク質 - タンパク質相互作用を媒介多タンパク質複合体のテンプレートとして機能<em&gt;（7）</em&gt;。 TPRsは、真核細胞オルガネラのプロセスと多くの細菌の経路で、多くの重要なタスクに関与している<em&gt;（8-14）。</emママ、タンパク質を含む独自のTPRを理解する&gt;ためには、高度に精製されたタンパク質は、最初のステップとして必要です。この記事では、我々はより安定したママ欠失変異体（MamAΔ41）の精製のプロトコールを提示<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB - 1。

ママはmagnetosome活性化に関与することが示されていたユニークなMagnetosome関連するタンパク質である。ここでは、からママ欠失変異体（MamAΔ41）の精製のプロトコールを提示<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB - 1。

の精製 M. magneticum株AMB - 1 Magnetosome関連タンパク質MamAΔ41

磁気細菌は、地磁気に従って自身の方向を定めることができる水生微生物の多様なグループで構成されています。この挙動は……

精製プロセスは、Mame. Delta 41組み換えタンパク質を発現している細胞ペレットから始まります。細胞膜を破壊した後、可溶性画分と不溶性画分を分離します。可溶性組み換えタンパク質を抽出するため、アフィニティークロマトグラフィーを用いて、タグ付き組み換えタンパク質を他の細胞タンパク質から分離します。イオン交換クロマトグラフィーにより、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー後に残存する他の細胞タンパク質からmamma Delta 41を分離します。さらにクロマトグラフィーを用いてmamma Delta 41を分離し、そのオリゴマー状態を明らかにします。最後に、リコンビナントタンパク質の純度および均一性を分析します。こんにちは。私はベノン大学ネガティブ学部ライフサイエンス学科のXVA研究室で責任者を務めているRazaです。そして、Z研究室のNatalieです。本日は、組換えタンパク質精製の手順について解説します。当研究室では、磁性に関連するタンパク質の研究にこの手順を用いています。それでは、プロトコルを開始しましょう。まず、MAME Delta 41タンパク質を10-His融合タンパク質として発現させます。BL 21 E. coli細胞を、Epi Brazilinを含む自動誘導培地を用い、310 Kで3時間培養します。その後、培養温度を300 Kに下げ、48時間インキュベートします。インキュベーション後、遠心分離により細胞を回収し、上清を捨てて得られた細胞ペレットの重量を測定します。8 Lの培養液から、約60 gの湿潤細胞ペレットが得られるはずです。タンパク質精製に先立ち、4 Mの塩化リチウム、5 Mの塩化ナトリウム、および1 Mのtris HCl (pH 8) のストック溶液をそれぞれ200 mLずつ調製します。2回蒸留水（DDW）を用い、溶液が透明になるまでボルテックスし、0.22 µmのフィルターでろ過します。ストック溶液から新鮮に調製し、本ビデオに付随する書面プロトコルに記載されている通りにバッファーAからFまでをろ過してください。タンパク質精製を開始するには、細胞重量とバッファー容量の比率を1:2として、細胞をバッファーAで再懸濁します。細菌10 gにつき、サンプル中のDNA断片を消化するためのDNAseを10 µL添加します。次に、プロテアーゼ阻害剤カクテルであるEDTAを1 mL添加します。細菌20 gにつき、溶液を氷上で20分間インキュベートします。インキュベーション後、25,000 PSIでフレンチプレスを2サイクル行い、細胞を溶解させます。温度上昇を防ぐため、使用前にピストンを氷上で10分間冷却してください。溶解した細胞を25 milliliterの超遠心管に移します。チューブのネックラインまでバッファーAを満

purification-m-magneticum-strain-amb-1-magnetosome-associated-protein

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、免疫磁気ターゲティングと末梢血単核細胞懸濁液からの分離によってB細胞を精製する方法を説明しています。この方法では、特定の細胞表面タンパク質を標的とする特異的な抗体またはリガンド(磁性粒子に結合)で不要な細胞タイプを標識し、磁気分離によって不均一な細胞懸濁液から枯渇させます。...

ネガティブ免疫磁気選択:末梢血単核細胞からB細胞を精製する方法

この動画では、磁性マイクロビーズを用いて標的生体液からエクソソームを単離する手順を実演します。この手順により、エクソソームの迅速な捕捉が可能になり、下流の分析に使用できます。...

磁気ビーズを用いたエキソソーム抽出:生体液から特定のエクソソームを単離する技術

このビデオでは、磁気活性化細胞ソーティングを使用してマウスの子犬の脳からミクログリアを含むCD11b細胞を単離するためのプロトコルについて説明します。脳組織をホモジナイズして単一細胞懸濁液を得ると、抗CD11b抗体でコーティングされたマイクロビーズとインキュベートした後、磁気カラムベースの分離によりCD11b+細胞集団を精製します。...

マウスの仔脳からのミクログリアの磁気分離

我々は、天然水に適用できる磁性細菌（MTB）を収集する方法を示しています。...

当然のことながら環境から磁性細菌の発生の収集、分離、濃縮

この手順では、成体マウスの脳ミトコンドリア関連のER膜またはMAMSとMAMSとミトコンドリア調製物からスフィンゴ糖脂質に富むマイクロドメイン画分から単離する方法を示しています。...

ミトコンドリア関連のER膜（MAMS）とスフィンゴ糖脂質マイクロドメインエンリッチド（GEMS）：マウス脳から単離

エクソソームは、重要な疾患識別バイオマーカーを潜在的に運ぶ生体液内に見られる微小胞構造です。ここでは、エキソソームを特異的に抽出し、不均一な電気環状矩形波を使用してエキソソームの破壊後に両方のRNA/タンパク質標的のエキソソームカーゴを迅速にテストするための新しい方法が使用されます。...

電界誘起リリースおよび測定によるエキソソームのバイオマーカーの検出（EFIRM）

コバルトドープマグネトフェリチンの合成とカチオン化のためのプロトコールと、カチオン化マグネトフェリチンで幹細胞を迅速に磁化する方法が紹介されています。...

細胞の超高速磁化のためのカチオン化Magnetoferritinの合成

この原稿は、PEI / MNPベクター及びその磁化により内皮細胞へのmiRの効率的な、非ウイルス送達を記載しています。このように、遺伝的改変に加えて、このアプローチは、磁気細胞ガイダンスやMRIの検出能が可能になります。技術は、治療用細胞製品の特性を改善するために使用することができます。...

準備と<em&gt;インビトロ</em磁化のmiR修飾内皮細胞の&gt;キャラクタリゼーション

ここで説明する方法は、外因性の抗原クロス...

外因性の抗原クロス プレゼンテーション内の小胞体関連分解膜コンパートメントの精製

本稿では、天然の細胞外小胞(EV)の生物学的起源と構造、形態、タンパク質組成が類似する新しいタイプのエクソソーム模倣体(EM)として、エンドソーム由来ナノベシクルの大規模生産のための磁気分離支援高速ホモジナイズ法について述べる。...

エンドソーム由来小胞の大量生産のための磁気分離支援高速均質化法

本プロトコルは、フィコエリスリン(PE)標識されたフローサイトメトリー抗体と抗PEマイクロビーズを用いて、高価な細胞選別機や標的特有のカスタムビーズを必要とせず、試験条件下で高い後選定標的マーカー陽性率とCCK-8ベースの増殖・代謝活性を維持する特定の間葉幹細胞サブポピュレーションを分離する磁気ビーズベースの選別法を説明しています。...

間接磁気ビーズ戦略を用いたポドプラニン陽性間葉質幹細胞サブポピュレーションの単離と検証

学ぶMamAΔ41タンパク質精製法。M. magneticum AMB-1由来マグネトソーム関連タンパク質の親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーを用いた精製プロトコルとオリゴマー状態解析手法を解説します。

の精製 M. magneticum株AMB - 1 Magnetosome関連タンパク質MamAΔ41

さらに動画を探す