鋤鼻上皮の多電極アレイ録音

平面マルチ電極アレイを用いて、UL鼻器官からの記録を行います。神経上皮を完全な状態で維持するようにして、マウスからVNOを摘出します。まず、マウスからVNOカプセルを除去します。

次に、神経上皮を骨性カプセル、血管、および基底膜から単離します。組織を、樹状突起のノブ側を上にしてMEAに配置します。このセットアップが完了したら、ロボットアームを使用して組織に液体刺激を与えます。

こんにちは。私はワシントン大学医学部解剖・神経生物学教室のTim Wholly研究室に所属しているHannah Arnonです。同じくWholly研究室のCheyenne Fuです。本日は、V鼻器官のマルチ電極アレイ記録の手順について解説します。

当研究室では、副嗅覚系の感覚特性または受容ニューロンを研究するために、この手順を用いています。それでは開始しましょう。電気記録は、窒化ケイ素で絶縁された10 µmの平坦な窒化チタン電極を備えた平面マルチ電極アレイ（MEA）を用いて取得します。

60個の電極が、中心間距離30 µmの5×6グリッドからなる2つのフィールドに配置されています。MEA 10 60アンプリファイアを使用して、電気信号を増幅します。10 kHzで1000倍の信号増幅が必要です。

データ収集カードとカスタムデータ収集ソフトウェアを使用して、組織をナイロンメッシュでMEA上に固定します。このメッシュは、培養容器内にぴったりと収まるカスタムインサートに取り付けられています。MEAについての説明が終わりましたので、次はVNOの摘出方法について見ていきましょう。摘出を行う前に、MEAウェルにウシ血清アルブミン（BSA）を満たします。次に、温めて気泡を除去したリンガー液でMEAを洗浄し、氷上に置きます。

解剖の準備として、60 × 15 mmのペトリ皿2枚にバブリングしたリンガー液を満たし、氷上に置きます。同様に、同サイズのシルガードコーティング済みペトリ皿2枚にリンガー液を満たし、氷上に置きます。さらに、解剖中に使用するため、バブリングしたリンガー液50 mLを冷却しておきます。

安楽死させたマウスを用い、口端から顎のラインに平行に後頭部に向かって両側に切開を入れます。後頸部で2つの切り口を接合させ、細い剪刀を使用して、下顎をマウスに付けたまま後頭部を切り出します。組織と上顎骨の両側の間の組織を切断し、骨から組織を分離します。

次に、3番ピンセットを用いて口蓋組織を剥離し、小さなはさみまたはメスを使用して上顎の前歯2本の間および両側を切開して鼻腔を露出させ、3番ピンセットで脆弱な鼻嚢を骨から分離させます。平骨部分を持って脆弱な鼻嚢を取り出し、氷上のペトリ皿に入れます。以上の手順から冷やしたリンガー液へのVNO浸漬までを、3分以内に完了させる必要があります。

組織の死滅を防ぐため、反射光で照明した実体顕微鏡下にディッシュを置きます。3番ピンセットを使用して、VNOを1つずつ骨性カプセルから取り出します。片手で骨性カプセルの後端を掴んで固定し、もう一方の手でVNOを傷つけないように注意しながら、VNOから骨を剥がします。

骨を除去した後、vとoをコーティング済みのペトリ皿に移します。残りの皿をもう一方のVNOに使用してください。マイクロシザーズを用いて、照明を透過光に切り替えます。

5番ピンセットを使用します。VNOの縁に沿って切断し、VNOを血管から分離します。この時点で、神経シートが血管から完全に分離されます。

3番鉗子を用いて、VNOの内側を上に向けた状態で配置します。クランプで保持したテフロンコーティングのカミソリ刃の小さな破片を使用し、組織の角でVOをSガードに固定します。ディッシュ表面から30度未満の浅い角度で刃を保持し、神経上皮を基底膜から剥離させます。

ガラスピペットを使用するのが最適です。神経上皮の断片をディッシュからMEAへ移し、樹状突起側を上にして、VNOを電極フィールドの上に配置します。

ピペットで余分なリンガー液を除去し、メッシュ組織ホルダーをアレイのウェルに配置してvnoを固定します。解剖が完了したら、ウェルを冷却したリンガー液で満たします。記録セッションを開始するには、MEAをMEA 10 60アンプリファイアにセットし、ヒータープローブを組織の直上に配置して、ヒーターが適切に機能していることを確認します。

プローブの配置後、50 mMのカリウムを含むリンゲル液で2秒間刺激します。カリウム溶液に対する神経応答の潜時が最小になるように、配置を調整してください。組織には継続的な灌流が必要であり、これはHPLCポンプからリンゲル液を供給することで行われます。

記録に先立ち、加熱したリンゲル液で組織を45分から1時間超灌流し、組織を順化させます。刺激の投与には、Gilson two 15リキッドハンドラーロボットアームを使用します。刺激は、HPLCバルブへの注入を行い、フロースルーとループを切り替えることで提示されます。Gilsonソフトウェアの制御下で、ロボットアームが一定の流速と圧力を維持しながら、灌流ラインに刺激を投与します。

HPLCバルブの状態は電気電圧で表され、データ収集コンピューターによって追加チャネルとして記録されます。神経活動との同期を確実にするため、電気信号はカスタム記録ソフトウェアを用いてディスクに保存されます。それでは、VNOマルチ電極アレイ記録の代表的な結果をいくつか示します。

この手順では電極数が多いため大量のデータが得られ、調製後の安定性は通常約6時間維持されます。以下は、MEAの半分から得られた400ミリ秒間のデータの例です。この手順は、感覚ニューロンのリガンドに対する反応を測定するのに有用であり、ここでは単一電極から記録した100倍に希釈した雌マウス尿への反応を示します。

黒色のバーで示されている通り、10秒間尿を投与しました。刺激提示後の発火の増加に注目してください。以上で、この手順におけるマウスVNOのマルチ電極アレイ記録の方法について説明しました。

忍耐強く行うことが重要であることを忘れないでください。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。