Name: 鋤鼻上皮の多電極アレイ録音 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-01T16:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶマウスの鋤鼻上皮の多電極アレイ録音法。神経上皮を分離しロボットアームで液体刺激を与え、感覚ニューロンの電気活動を記録します。この手法はフェロモン検出と感覚処理の研究に有用です。

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私たちは、聖研究室のメンバーに感謝したいと思います。この作品は、聴覚障害とコミュニケーション障害研究所（R01 DC005964まで）とNSF IGERT 0548890（HAA）によってサポートされていました。 動物実験は米国の動物福祉の行為と健康ガイドラインの国立研究所に準拠して行われたとワシントン大学の動物実験委員会によって承認された。

パート1。電気的記録計<ol><li>我々は、窒化ケイ素で絶縁さ10μmの平坦な窒化チタン電極を有する平面多電極アレイを（ALAサイエンティフィックインスツルメンツ）を使用します。 60電極が30μmの中心間距離と5X6のグリッドで構成される二つのフィールドに配置されています。 （その他の構成も可能です。直径の記録面は10μmで電極が単一ニューロンの活動を分離するという点で大きな電極よりも優れています。） </li><li>電気信号は、MEA 1060アンプ（ALAサイエンティフィックインスツルメンツ）を使用して（1000倍の増幅）増幅されています。信号は、データ集録カード（ナショナルインスツルメンツ）と、カスタムデータ集録ソフトウェア（1つにも商用ソフトウェアを購入できます）を使用して10 kHzで取得されています。 </li><li>組織はMEAの培養チューブのリングの内側にぴったり合うカスタムインサートに接続されているナイロンメッシュ（53ミクロン）、によってMEAを下に開催されます。 </li></ol>パート2。液体供給計装<ol><li>組織は、我々はリンゲル溶液（115 mM塩化ナトリウム、5mMの塩化カリウム、2mMの塩化カルシウム、2mMの塩化マグネシウム、25mMの重炭酸ナトリウム、10mMのHEPES、10 mMのD -（+を供給することにより保証する連続的な灌流を必要とし、 HPLCポンプから） - グルコース）。刺激はHPLCバルブに注射を行うとフロースルーとループとの間で切り替えることにより表示されます。 HPLCポンプとインジェクションのロボットのシリンジポンプの両方は、リンゲル液に付属しています。 </li><li>リンゲル液は、実験全体を通して42℃温水槽（ISOTEMP 105）° Cに保持され、連続して95％O 2 / 5％CO 2でバブリングする。グルコースのないリンゲルの別のフラスコにシリンジポンプをバックアップ用に準備されています。リンゲル溶液を3mL /分の速度で307 HPLCポンプ（ギルソン）を使用して組織に配信されます。典型的な5〜6時間の実験では、各リンゲル溶液1Lで十分です。 </li><li>実験全体を通して、組織は継続的に37℃のリンゲル液で灌流される。ヒータープローブが直接組織上方に位置している。 </li><li>刺激はギルソン215液体ハンドラロボットアームを使って配信されます。刺激はゴムキャップ付きガラスバイアルに保存され、一定の流量と圧力が維持されている間ギルソンソフトウェアの制御下で、ロボットアームは、灌流ラインに刺激を提供しています。 </li><li> HPLCバルブ（ループが従事/従事していない）の状態は、神経活動との同期を確実にするために付加的なチャネルとして、買収のコンピュータによって記録される電気の電圧で表されます。 </li></ol>第3部。 MEAと刺激の配信デバイスの準備<ol><li>解剖を実行する前に、室温で少なくとも5分間dH2OでBSAとMEAの井戸を埋める。 </li><li>ウォームバブルリンガー溶液を用いてMEAをすすぎ、氷上にMEAを置きます。 </li><li>プライム液体ハンドラとHPLCは、製造元の指示に従ってポンプ。 </li></ol>パート4。 VNOの解剖<ol><li>解剖を行う前に、氷の上で泡立てリンゲル液と場所で2 60x15ミリメートルのペトリ皿を埋める。また、氷の上でリンゲル溶液と場所と同じサイズの2 Sylgardコーティングされたシャーレを埋める。解剖時に使用するためのウォームバブリングリンゲルの追加の50mLのを冷やします。 </li><li>マウスは頚椎脱臼に続くCO 2窒息を経由して犠牲にされています。 </li><li>頭の後ろに、顎のラインと平行に走る、口の側面から二国間の切開を加えます。首の後ろに沿って2カットに参加して、マウスに接続されている下顎を残して、頭部の背の部分を削除してください。 </li><li>細かいハサミを使用して、組織や骨から組織を分離するために上顎骨の両側の間にカット。 </li><li>鼻腔を公開するために口蓋の組織を剥がし、第3位鉗子を使用する。 </li><li>小さなはさみや骨から鋤鼻カプセルを解放する間、および上位2前歯の両側にカットメスを、使用する。 </li><li> ＃3鉗子を使用して、氷の上でペトリ皿の平らな骨と場所によって鋤鼻カプセルを拾う。浸漬を通ってステップは3分未満で実行する必要があります。 </li><li>反射光で照らされた、実体顕微鏡下で皿を置きます。 ＃3鉗子を使用して、一度VNOから骨嚢を取り除く。 、離れてVNOから骨剥離する尾方端と他方の把持VNOを傷つけないように配慮して骨のカプセルを安定させるために片手で行ってください。 </li><li>骨が除去されると、SylgardコーティングしたシャーレにVNOを転送する。他のVNOの残りの皿を使用してください。透過光に照明を切り替えます。 </li><li>マイクロシザーまたは＃5ピンセットを使用して、VNOの端に沿って切断することにより血管からVNOを分離。この時点では、なります完全に血管から分離された神経のシートを持っている。 </li><li>内部（樹）面を上にVNOを置きます。 ＃3鉗子を使用して、組織の隅にSylgardにVNOを固定。クランプで開催されたテフロンコーティングされたかみそりの刃の小さな断片を用いて基底膜からの神経上皮ピール。浅い角度（&lt;30 °皿の表面から）でブレードを保持することが最善の方法です。 </li><li>ガラスピペットを用いて、皿からMEAへの神経上皮の一部を譲渡する。上樹側で電極のフィールドの上にVNOを置きます。ピペットと過​​剰リンゲル液を取り外します。場所にVNOを保持し、冷却したリンゲル液で格納する配列のウェルにメッシュティッシュホルダーを置きます。 </li></ol>第5部。録画<ol><li> MEA 1060アンプと位置を直接組織上のヒータープローブでMEAを置きます。 </li><li>適切なヒータープローブの配置を確認するには、リンゲル溶液が2秒間50 mMリン酸カリウムを（等モルナトリウムの代わりに）を含むと刺激する。カリウム溶液への神経応答の待ち時間を最小限に抑えるために位置を調整。 </li><li>組織が順応できるように、記録前の1時間に45分間加熱したリンゲル液で組織を表面かん流する。 </li><li>電気信号は、カスタムレコーディングソフトウェアを使ってディスクに保存されています。 </li></ol>第6部。データ解析<ol><li>オフラインデータ解析は、生の電極の録音を使用して行うことができます。例えば、我々は、特定のリガンドに反応して記録された細胞の発火率の変化を測定する。結果のデータセットが大きく、さまざまな質問に対処するために使用することができます。プログラミングや解析言語（C言語、MATLAB、R、Pythonの、または類似の）の熟知が必要です。 </li></ol>パート7。代表的な結果この準備は、通常、データ（60の電極から記録の6時間）を大量にもたらして、6時間から記録するのに十分安定しています。 <img src="/files/ftp_upload/1845/1845fig1tmb.jpg" alt="図1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：配列の半分にわたって同時活動のスナップショットが表示されます。時間ウィンドウは、400ミリ秒に広がっています。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1845/1845fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1845/1845fig2tmb.jpg" alt="図2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2典型的な実験では、我々は10秒間、関心のある特定の化合物で刺激する。このトレースは、100倍希釈した雌マウスの尿中への応答の例です。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1845/1845fig2.jpg">ここをクリックして</a>図2の拡大バージョンを参照すること。

<ol><li>Dulac, C., Torelo, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals%3A+from+genes+to+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li>
<li>Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+Vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Responses of Vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li>
<li>Nodari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfated+steroids+as+natural+ligands+of+mouse+pheromone-sensing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons.</a> J Neurosci. 28, 6407-6418 (2008).</li>
</ol>

多電極アレイの録音は、私たちの神経細胞の大集団の同時活動を監視する能力を許可する。これは特に、VNOの感覚系の特性をプロービングするための便利なツールです。主嗅覚系とは異なり、VNOは、液相中で刺激を検出します。さらに、VNOは異種の組織です。おそらく別の応答プロファイルとマウス1の受容体の約300の異なる種類があります。 MEAの録音は、私たちは確実にニューロンとアイデンティティ電気生理学的応答の大規模かつ多様な人口に液体の刺激を提供できるようにロボットアームと組み合わせる。さらに、in vitroでの VNOの安定性は、刺激の複数の繰り返しのための時間を確保できます。 以前は、この手法は、尿中3に存在する個々のリガンドを同定するための信頼性の高いアッセイとしてとして2マウスの尿に反応してVSNの官能特性を調査するために使用されています。将来的には、この手法は非常にさらに配位子の発見に有用とVNOの官能特性を特徴づけるのかもしれない。

鋤鼻上皮の多電極アレイ録音

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

神経回路を理解することの方法は同時に多数のニューロンから記録する必要があります。の<em&gt; in vitroで</em&gt;研究、一方、現在利用可能な技術は、平面多電極アレイ（MEA）の記録である。ここでは受容体の数百種類を表現する感覚ニューロンの多様な人口を介したフェロモンと社会的手がかりの発見に重要な役割を果たしているマウスの鋤鼻器官（VNO）を、勉強するMEAの使用を文書化する。化学的刺激を提供するロボット液体ハンドラとMEAの記録を組み合わせることで、ニューロンの大規模かつ多様な人口の感覚応答を記録することができます。準備は、私たちは、マウスからVNOの無傷の上皮を除去し、数時間のための神経細胞の電気的活動を監視しながら、化学物質または潜在的リガンドのバッテリーを刺激することができます。したがって、この手法は、リガンド活性を評価するだけでなく、受容体の神経細胞の性質を探求するための有用な方法として機能します。私たちは、鋤鼻上皮、MEAの記録、および化学的刺激を準備するために必要なテクニックを紹介。

多電極アレイ（MEA）の録音は、神経細胞の大規模な集団の電気的活動を研究するための方法を提供する。同時に組織を刺激しながらここで、我々はマウス鋤鼻上皮からのレコードにMEAの準備の詳細を示す。

神経回路を理解するには、多くのニューロンから同時に記録を行う手法が必要です。in vitro研究において、現在利用可能な技術の一つが...

平面マルチ電極アレイを用いて、UL鼻器からの記録を行います。まず、神経上皮を維持した状態で、マウスからVNOを除去します。最初に、マウスからVNOカプセルを取り出します。次に、神経上皮を骨性のカプセル、血管、および基底膜から分離します。組織を樹状突起 knob 側を上にして MEA に配置します。このセットアップが完了したら、ロボットアームを使用して組織に液体刺激を与えます。こんにちは。ワシントン大学医学部解剖・神経生物学教室のTim Wholly研究室のHannah Arnonです。同じくWholly研究室のCheyenne Fuです。本日は、V鼻器のマルチ電極アレイ記録の手順について解説します。当研究室では、副嗅覚系の感覚特性または受容ニューロンを研究するためにこの手順を用いています。それでは始めましょう。電気生理学的記録は、窒化ケイ素で絶縁された10 µmの平坦な窒化チタン電極を備えた平面マルチ電極アレイ（MEA）を用いて行います。60本の電極が、中心間距離30 µmの5×6グリッドからなる2つのフィールドに配置されています。MEA 10 60アンプを用いて電気信号を増幅します。10 kHzにおいて1000倍の信号増幅が必要です。データ収集カードとカスタムデータ収集ソフトウェアを使用し、組織をナイロンメッシュでMEA上に固定します。このメッシュは、培養容器にぴったりと収まるカスタムインサートに取り付けられています。MEAについて説明しましたが、次にVNOの解剖方法について見ていきましょう。解剖を行う前に、MEAのウェルに牛血清アルブミン（BSA）を満たします。次に、温めて気泡を除去したリンガー液でMEAを洗浄し、氷上に置きます。解剖の準備として、60×15 mmのペトリ皿2個にエアレーション済みのリンガー液を満たし、氷上に置きます。同様に、同サイズのシルガードコート済みペトリ皿2個にリンガー液を満たし、氷上に置きます。さらに、解剖中に使用するため、エアレーション済みのリンガー液50 mLを冷却しておきます。犠牲にしたマウスを用い、口の横から顎のラインに沿って後頭部まで両側に切開を入れます。首の後ろで2つの切開線を合わせ、精巧な鋏を使用して、下顎をマウスに残したまま頭部の背面部分を取り除きます。組織と上顎骨の両側の間を切断し、組織を骨から分離します。次に、3番ピンセットを用いて口蓋組織を剥離し、小鋏またはメスで上の前歯2本の間および両側を切開して鼻腔を露出させ、3番ピンセットで脆弱な鼻嚢を骨から切り離します。平骨部分を持って脆弱な鼻嚢を取り出し、氷上のペトリ皿に置きます。以上の手順からVNOを冷却したリンゲル液に浸すまでを、3分以内に行う必要があります。組織の死滅を防ぐため、反射光で照明した実体顕微鏡下にディッシュを置きます。3番鉗子を用いて、VNOを1つずつ骨性カプセルから取り出します。片手で骨性カプセルの尾側端を把持して固定し、もう一方の手でVNOを損傷させないように注意しながら、VNOから骨を剥離させます。骨を取り除いた後、vとoをコーティング済みのシャーレに移します。もう一方のVNOには、残りのシャーレを使用してください。マイクロ鋏を使用し、照明を透過光に切り替えます。5番のピンセットを使用します。VNOの縁に沿って切断し、VNOを血管から分離します。これで、神経シートが血管から完全に分離されます。3番鉗子を用いて、VNOの内側を上に向けた状態で配置します。クランプで保持したテフロンコーティングのカミソリの破片を使い、組織のコーナー部分でVOをSガードに固定します。ディッシュ表面から30度未満の浅い角度でブレードを保持し、基底膜から神経上皮を剥離します。ガラスピペットを使用する方法が最適です。神経上皮片をディッシュからMEAへ移し、樹状突起側を上にしてVNOを電極領域の上に配置します。ピペットを用いて余分なリンガー液を取り除き、次にメッシュ組織ホルダーをアレイのウェルに配置してvnoを固定します。解剖が完了したら、ウェルを冷却したリンガー液で満たします。記録の手順を確認しましょう。記録セッションを開始するには、MEAをMEA 10 60アンプリファイアに装着し、ヒータープローブを組織の直上に配置して、ヒーターが適切に機能していることを確認します。プローブを配置し、50 millimolarのカリウムを含むリンガー液で2秒間刺激します。カリウム溶液に対する神経応答の潜時を最小限にするように、位置を調整してください。組織には持続的な灌流が必要であり、これはHPLCポンプからリンガー液を供給することで行います。記録を開始する45分から1時間前に、加温したリンガー液で組織を灌流し、組織を順化させます。刺激はGilson two 15リキッドハンドラーロボットアームを用いて投与します。刺激は、HPLCバルブへの注入を行い、フロースルーとループを切り替えることで提示されます。Gilsonソフトウェアの制御下で、ロボットアームが流速と圧力を一定に維持しながら灌流ラインに刺激を投与します。HPLCバルブの状態は電気電圧によって表され、データ収集用コンピュータによって追加チャネルとして記録されます。神経活動との同期を確実にするため、電気信号はカスタム記録ソフトウェアを用いてディスクに保存されます。それでは、VNOマルチ電極アレイ記録の代表的な結果をいくつか示します。この手順では、電極数が多いため大量のデータが得られ、通常、調製物は約6時間安定した状態を維持します。以下は、MEAの半分から得られた400ミリ秒分のデータの例です。この手順は、感覚ニューロンのリガンドに対する応答を測定するのに有用であり、ここに示すのは単一電極で記録した100倍希釈の雌マウス尿に対する応答です。黒いバーで示されている通り、10秒間尿を投与しました。刺激提示後の発火の増加に注目してください。以上で、この手順を用いてマウスのVNOでマルチ電極アレイ記録を行う方法を説明しました。忍耐強く取り組むことが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を祈っております。

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空気相Electroolfactogram記録を用いたマウス嗅覚神経細胞の分析応答

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プロトコルビデオは、マウスの鋤鼻器官(VNO)の感覚ニューロンからの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立について説明しています。蛍光標識された感覚ニューロンを備えた冠状VNOスライスを記録セットアップに配置します。標識されたニューロンは、化学刺激に応答して電気生理学的記録のために、全細胞構成の記録ピペットでパッチされます。...

鋤鼻感覚ニューロンからの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立

2異なる脳neuropilesまたは2つの異なる解剖学的管から同時に細胞外の長期的な記録は、ミツバチに設立された。これらの録音は、単一のニューロンでだけでなく、行動する動物でのアンサンブルのレベルで異なる脳領域間での神経処理の時間的な側面の調査を可能にする。...

行動するミツバチの二つの神経の処理段階での同時長期レコーディング

マウス副嗅球（AOB）は、感覚コーディングのコンテキストで勉強することは困難であった。ここでは、AOBニューロンは、マウスのフェロモンとカイロモンの情報処理の研究を容易にする、その周辺の入力に機能的に接続されたままでいるエクスビボ製剤を生成する解剖を示す。...

無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

ここでは、人間のてんかん皮質組織のマルチ電極アレイの録音を実行する方法について説明します。発作と発作事象の癲癇組織切除、スライス標本と多電極アレイ記録は詳細に実証される。...

人間のてんかん術後皮質組織の多電極アレイ録音

嗅覚ニューロンの生理学的特性の分析には、まだ技術的な限界があります。ここでは、遺伝子標的マウスの嗅上皮の無傷の準備で穴あきパッチクランプを介してそれらを記録します。この技術により、特定の嗅覚受容体を発現するニューロンの特定のリガンドに対する膜特性と応答の特性評価が可能になります。...

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

ここでは、マウスの鋤鼻器官の急性冠組織切片における感覚ニューロンの定義された集団の同定と詳細な分析を可能にする生理学的アプローチについて説明します。...

マウス鋤鼻器官の急性組織スライスで定義された細胞集団の中で、深さ生理学的解析

本研究では、脳、心電図、筋電図、局所電界電位の同時計測と自由行動ラットの信号を呼吸するためのメソッドを紹介します。この技術は、実験のコストを削減し、データの分析を簡素化は、脳と末梢器官との間の相互作用の理解に貢献します。...

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