胚脊髄交連軸索アンテナの向きに拡散性のシグナル伝達分子の能力を検定する

ラット胚から背側脊髄の外植片を切り出し、3次元コラーゲンゲル内で培養し、候補となるシグナル分子を発現させた細胞を対置させます。背側脊髄外植片内で成長する軸索を再配向させるシグナル分子の能力を、免疫組織化学を用いて評価します。

こんにちは。私は南カリフォルニア大学生物科学科のサマンサ・バトラー研究室のバージニア・ヘイゼンです。同じくバトラー研究室のキース・ファンです。そして、バトラー研究室のケン・ヤマイです。

本日は、コラーゲンマトリックス内での背側脊髄インプラントおよびトランスフェクションしたコスト細胞の凝集体の培養手順をご紹介します。当研究室ではこの手順を用いて、候補となるリガンド分子が脊髄神経細胞を配向させる能力を評価しています。本実験では、骨形態形成タンパク質（BMP-7）が化学反発物質として機能するかどうかを検証します。

それでは始めましょう。目的の分子である骨形成タンパク質（BMP7）の発現プラスミドを導入したco細胞から、comm choral軸索の走行を阻害するために使用するco細胞凝集塊を調製します。

ディッシュから培地を吸引し、1 mLの1×PBSで細胞を洗浄します。PBSを除去し、0.5 mLの酵素フリー細胞解離培地を加えて15分間処理します。胎児牛血清を含む培地1 mLを添加して反応を停止させます。

1000 µL ピペットチップを用いて、培養皿の表面に細胞が残らなくなるまで繰り返し回収します。細胞を15 mLコニカルチューブに移し、2分間遠心して細胞をペレット化します。2000 RPMで遠心した後、上清を除去し、ピペッティングして再懸濁させます。

35 mm培養ディッシュの蓋の内側に、100 µLの培いを用い、細胞懸濁液を20 µLずつ複数箇所に滴下します。蓋を閉じてディッシュに被せ、インキュベーター内に数時間置き、細胞を凝集させます。背側脊髄インプラントを調製する場合は、採取直後の新鮮な状態で保持してください。

氷上に置いたE 11ラット胚を用意する。L 15培地中で、研磨したタングステン針を用い、各胚の前肢芽の直下の体幹部から4〜6個の体節に相当する領域を切除する。プラスチックピペットを使用して、組織を4ウェルプレートの1ウェルに回収する。

ディッシュを氷上に置きます。すべてのセグメントの解剖が完了したら、ピペットを用いて、L 15培地とジスクペーストを含む別のディッシュのウェルに断片を移します。組織を室温で5分以内にインキュベートします。

細胞死を防ぐため、組織を消化しすぎないようにしてください。5%熱不活化ヤギ血清を含む新鮮なL 15培地 1 mLを、noディッシュの3番目のウェルに加えます。そして、組織片をこのウェルに転移します。

ジススペースでのインキュベーション終了後、組織を氷上で1時間静置します。その後のマイクロ遠心チューブ内での解剖を容易にするため、10倍濃縮最小必須培地 40 µL をコラーゲン 360 µL に加えます。その後、ボルテックスで短時間混合し、ピコ遠心機でスピンダウンさせます。

溶液は黄色になります。コラーゲンが凝固するのを防ぐため、可能な限り氷上で保持してください。コラーゲン溶液がわずかにオレンジ色になるまで、0.8 Mの炭酸水素ナトリウムを各コラーゲンのバッチに滴定します。添加するごとに溶液を混合してください。コラーゲン溶液がこの色になれば、氷上で保持している間は液状のままであり、室温に戻すと凝固する準備が整った状態になります。混合後に溶液がピンク色になった場合は、新しいコラーゲンのチューブを用いて最初からやり直してください。清潔な4ウェルプレートの各ウェルに、コラーゲンを20 µLずつ分注します。

ピペットの先端を使用して、コラーゲンを広げて小さなパッド状にします。コラーゲンを室温で約10分間静置して固めます。解剖顕微鏡下で、新しく研いだタングステン針と精密ピンセットを用い、タングステン針で1つの胚の脊髄周囲の中胚葉を除去し、次に床板の存在によって識別可能な脊髄の腹側部分を除去します。

腹側の最端にある底板は、背側の端にある蓋板よりもわずかに厚くなっています。この例では、脊髄の腹側を下にして置いています。底板と平行に注意深く組織を切断し、脊髄の腹側5分の1を廃棄してください。

針を使用して、背側脊髄外植片を垂直に二等分します。切り口が可能な限りきれいになるようにし、必要に応じて再トリミングを行ってください。直径0.5mmのガラスキャピラリー管を装着した口ピペットを用いて、それぞれの外植片を別々のコラーゲンパッド上に転移させます。

タングステン針を用いて、トランスフェクションしたco細胞の凝集塊を、背側脊髄の側縁とほぼ同じ幅の正方形に切り出します。口ピペットを使用して、切り出した正方形の一つをx explanを含むコラーゲンパッド上に転移させます。口ピペットを用いて、余分な液体を吸引して取り除きます。

少量の液体がその後のコラーゲン塗布を容易にするため、吸引しすぎないように注意し、プライミング済みのコラーゲンを4 µLパッド上に塗布します。タングステン針を用いて、組織に直接触れないようにコラーゲンをインプラント上へと移動させます。コラーゲンの中で針を動かし、co細胞凝集塊が外縁に隣接するように各x explanの向きを調整します。

コラーゲンを15〜20分間静置して凝固させます。次の胚に移る前に、組織培養フード内でさらに4 µLのコラーゲンを塗布し、x explanが完全にコラーゲンに包まれていることを確認します。0.5 mLの培地を加え、インキュベーター内で30〜40時間培養します。ドラフト内にて、0.5 mLのPBS調製4%パラホルムアルデヒド溶液を用いて外植体を45分間固定します。組織を氷上に保持したまま、0.5 mLのブロッキングおよび透過化溶液（PBTN）で2回洗浄します。

x 外植片をブロッキング溶液中で 4 °C で、好ましくは一晩インキュベートします。ピンセットを用いて X 外植片を 4 ウェルプレートから切り出し、48 ウェルディッシュの各ウェルに 1 つずつ配置します。

各ウェルに一次抗体を200 µLずつ加えます。comm choral軸索を可視化するにはマウスanti ttag抗体を使用し、細胞間のトランスフェクションが成功したかを確認するには、テスト対象の分子に対する抗体を含めてください。4 °Cで一晩インキュベートします。

各サンプルをPBTNブロッキング溶液で、4°Cで1回1時間、計5回洗浄します。PBTNを除去し、各ウェルに二次抗体200 µLを加えます。退色を防ぐためアルミ箔で遮光し、4°Cで一晩インキュベートします。

以前と同様に、サンプルをPBTNで5回洗浄します。各外植体を3ウェル凹型スライドに転送します。過剰な液体を除去し、Invecta Shield封入剤を滴下してカバーガラスで封します。

顕微鏡で観察するまで、スライドを遮光フォルダまたはボックスに入れ、4°Cまたは-20°Cで保存します。ここで、培養、固定、染色を行い、共焦点顕微鏡で撮影したx外植片の代表的な画像を示します。パネルAは、白線で囲まれたroof plateのX外植片が、tag one陽性の脈絡神経軸索を自身から遠ざけるように方向転換させており、roof plateが軸索化学反発物質の供給源であることを示しています。パネルBは、M tactシグナル分子である骨形態形成タンパク質（BMP 7）を分泌するco細胞が、roof plateと同様に脈絡神経軸索を反発させることができることを示しています。

発現プラスミドのみを分泌する細胞と共培養した軸索は、軸索の配向に影響を与えません。ここまで、脊髄のX explanを切り出し、配向させ、培養する方法、および細胞凝集塊を用いて候補となるシグナル分子に軸索再配向活性があるかどうかを判定する方法について説明しました。この手順を行う際は、コラーゲンを可能な限り氷上で保持し、explanをコラーゲンで完全に包み込み、培養液に直接触れないようにすることが重要です。

最後に、軸索がx explanの腹側端まで伸展するのに必要な時間だけ培養してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。