Name: 胚脊髄交連軸索アンテナの向きに拡散性のシグナル伝達分子の能力を検定する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学ぶBMP7による脊髄交連軸索の再配向アッセイ法。ラット胚背側脊髄エクスプラントとCOS細胞凝集塊をコラーゲンゲルで共培養し、免疫組織化学で軸索配向を可視化します。神経発生機構の解明に有用です。

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このプロトコルは、ジェーンドッド、トーマスJessellとアンドリューラムズデンの研究室で開発されました。コンラートバスラー、アンCalof、トーマスエドランド、フィルハミルトン、Domna Karagogeos、アリエルルイス私Altabaと俊哉山田を含む多くの人々は、どのようにコラーゲンの脊髄の文化の外植片に決定。 Marysia Placzekとマルクテッシェ-ラヴィーンは、軸索ガイダンスの分子を識別する手段として、生体外植片からで軸索の成長を使用してのテクニックを開拓してきました。バトラーの実験室での作業は、NIH / NINDSからダイムの月とR01 NS063999からの補助金によってサポートされています。

パート1：ハンギングドロップを使用してトランスフェクトしたCOS細胞の集合体の調製<ol><li>種子のCOS - 7（COS）35ミリメートル培養皿中の細胞。彼らは、製造業者のプロトコルに従ってLipofectamine2000を用いて細胞に発現プラスミドの80％コンフルエント、トランスフェ1μgのに到達したとき。 </li><li>吊り滴を準備するには、トランスフェクション培地を吸引し、1Xリン酸緩衝溶液（PBS）を1mlでトランスフェクトしたCOS細胞をすすいでください。 15分間酵素無細胞解離培地の0.5ミリリットルを持つ細胞を扱う。反応を停止するのOpti - MEM + 1Xペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン（P / S / G）+ 10％ウシ胎児血清（FBS）の溶液の1mlを追加します。 </li><li>培養皿の表面からそれらを削除し、15ミリリットルコニカルチューブに移すために細胞をひいて粉にする。細胞をペレットに2000Kで2分間スピン。のOpti - MEM + 1 × P / S / G + 10％FBSの100μlの上清とペレットを再懸濁しますを削除します。 </li><li>皿の底の上に蓋と場所反転、35培養皿のふたの内側に複数の20μlのドロップを特定し、細胞集合体になるまで数時間、37℃のインキュベーターに残す。 </li></ol>パート2：背側脊髄の外植片の調製<ol><li>母親の子宮からE11のラット胚を摘出し、必要になるまでL15培地には氷上に置きます。 </li><li>シャープタングステン針で、すぐに前肢芽の下の領域から、それぞれの胚の幹から4〜6セグメントのセクションを削除します。プラスチック製のピペットを使用して、4ウェルNunc社製皿の1つのウェルに組織片を収集し、氷上に置きます。 </li><li>すべての胚のセグメントが解剖されているときは、1ミリリットルL15のソリューション+ヌンク料理のほか秒で1mgのディスパーゼに作品を転送するためにプラスチック製のピペットを使用してください。 5分よりもはや室温でインキュベートする。以上ディスパーゼで組織片をインキュベートしないでください。 </li><li>インキュベーションの間に、ペトリ皿と混在させる渦にL15の約10ミリリットルに熱不活性化正常ヤギ血清（HIGS）の0.5ミリリットルを追加します。第3のウェルNunc社製シャーレの中にこの溶液を1mlを移し、インキュベーションが終わったときに、この溶液中に組織片を転送する。氷上に置きます。注：組織片が時間氷上に&quot;残り&quot;が許可されている場合、後続の解離が容易になる。 </li></ol>パート3：プライミングコラーゲン<ol><li> 360μlコラーゲンに40μlの10倍の最小必須培地を追加して、チューブを軽く叩いたり、簡単にボルテックスで迅速かつ十分に混ぜる。 picofugeで急速にスピンダウン。溶液は黄色になります。 可能な限り氷の上に置かないでください。 </li><li> （下記の注を参照）少しオレンジコラーゲン溶液を回すのに十分な0.8M炭酸水素ナトリウム（NaHCO 3を ）追加する。再び、フリックで急速に、徹底的にミックス、そしてpicofugeで簡単にスピンダウン。解決策は、混合後のピンク色のままの場合、あなたはあまりにも多くのNaHCO 3を追加し、コラーゲンの新しいチューブを再び開始する必要があります。 </li><li>この時点で、コラーゲン溶液が準備されている。それは氷の上に液体のままですが、室温時に持って約5分（ピンクを回す）内に固化される。 </li><li> 4ウェルNunc社製ディッシュの各ウェルにおけるコラーゲンのスポット20μlの。あなたのピペットの先端を使用して、小さな&quot;パッド&quot;を形成するコラーゲンを広げ。コラーゲンは常温で設定してみましょう。 </li></ol>注：のNaHCO 3の正確な量は、コラーゲンのバッチごとに滴定する必要があります。 （11μl）、低起動し、その溶液はオレンジ色のわずかな日陰になるまで0.51μlの段階を追加。 &quot;右の&quot;量は、通常、コラーゲンのピンクを回すというのNaHCO 3の最小量よりも少ない1ULです。 NaHCO 3の量は直線的に拡大または縮小していません。 パート4：背側脊髄の外植片とコラーゲンマトリックスにおけるCOSの細胞凝集体とそれらの位置の解剖<ol><li>新鮮なシャープタングステン針と細かいピンセット（＃5または＃55）を使用して、脊髄を囲む中胚葉を削除します。 </li><li>タングステン針で床の板に平行に切断、慎重に脊髄の腹側五分の一を削除する。 </li><li>エッジはようにきれいに可能な限りカットしていることを確認し、背側脊髄外植片を二等分する。必要に応じて、エッジを再トリム。約に引っ張らガラスキャピラリーチューブを取り付けた口のピペットを使用して、別のコラーゲンのパッドにそれぞれ背側脊髄外植片を移す。直径0.5ミリメートル。 </li><li>背側脊髄外植片の外側縁とほぼ同じ幅の正方形にトランスフェクトしたCOS細胞の集合体をカット。 </li><li>口のピペットを使用して、背側脊髄外植片とコラーゲンのパッド上にこれらの四角形の1つを転送する。 </li><li>口のピペットで、口のピペットを使用して余分な液体をオフに吸引除去する。吸引以上しないでください。 </li><li>パッドの上に下塗りコラーゲンの4μlを適用する、と、タングステン針を用いて、直接組織に触れることなく、外植片を介してコラーゲンを移動する。外植片を周囲のコラーゲンでタングステン針を移動させることにより、東洋植ので、COS細胞の集合体は背側脊髄外植片の側縁部に隣接していること。 </li><li>コラーゲンが設定された後、外植片はコラーゲンで完全に覆われていることを保証するためにコラーゲンの4μlのアプリケーションを繰り返す。 </li><li>組織培養フードの中で30〜40時間のOpti - MEM + 1xP/S/Gと文化の0.5ミリリットルを追加します。 </li><li>氷の上にプレートを保つ、1xPBSで0.5ミリリットルを4％パラホルムアルデヒドで45分間外植片を修正。 </li><li> 1xPBSのブロッキング溶液+ 0.1％のTriton - X100 +1％HIGS（PBTN）の0.5ミリリットルで2回洗浄。 4のブロックは、℃で時間の少なくともカップルのために、一晩のインキュベーションは免疫組織化学によってプロセスして望ましいとあります。 </li></ol>パート5：免疫組織化学による交連軸索の可視化<ol><li> PBTNでブロッキング後、鉗子と48ウェルディッシュの場所で4ウェルプレートの外植片を切り取る。 </li><li>各ウェルに一次抗体の200μlのを追加し、4℃で一晩おきます℃、交連軸索を可視化するために、マウス抗Tag1に抗体の午前1時06ソリューションを使用してください。シグナル伝達分子がタグ付けされたエピトープされている場合、トランスフェクションが成功したかどうかを判断するために、また、テストされているシグナル伝達分子のどちらかに対する一次抗体、または関連するエピトープが含まれています。 </li><li> 4でPBTNの5 × 1時間℃で各サンプルを洗う</li><li>各ウェルに二次抗体の200μlのを追加し、4℃で一晩おきます℃、抗Tag1に抗体を一次抗体として使用された場合、FITCまたはCy3のいずれかに結合したヤギ抗マウスIgM二次抗体を使用してください。 FITCまたはCy3標識に結合され、光に敏感な二次抗体を使用している場合、この時点でからホイルで覆われた48ウェルディッシュを保つ。 </li><li>各サンプル5 4で× 1時間PBTNの各℃を洗う</li><li> 3よくうつ病のスライドに植を転送する、Vectashield媒体とカバーガラスに余分な液体、マウントを取り外します。 4℃または-20℃のいずれかで光金庫に保管</li></ol>パート6：植の代表画像成功した実験では、外植片とCOS集計は互いに隣接して保持され、コラーゲンのセットと離れ離れになるではない。軸索の最低限の繁茂があるでしょう。重要な軸索の増殖は、背側脊髄外植片は、長すぎるために培養されたことを示します。外植片からの成長はblebsは存在しません。組織は、培養液に直接接触する場合ブレブ形成が発生します。 軸索の向きを変更するシグナル伝達分子の能力は、共焦点顕微鏡を用いて評価する。軸索の再配向の程度は、COS細胞の集合体3に最も近い軸索の方向転換の平均角度を測定することによって定量することができます。図1に示すように、COS細胞はmycタグを発現BMP7（青）は、屋根板の外植片が交連軸索（図をはじくための方法に似て離れてBMP7のソース（図1B）からTag1に+交連軸索（緑）を再設定する1A）。コントロールベクターを発現COS細胞は交連軸索3,4の方向には影響を与えません。これらの外植片は、運動ニューロンと背側介在を飾る転写因子ISL1 / 2（赤）、に対する抗体で標識した。この結果は、BMPファミリーのメンバーは、屋根板chemorepellent 3の活性を仲介する最初の兆候だ。 <img src="/files/ftp_upload/1853/1853fig1tmb.jpg" border="0" /> 図1：してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1853/1853fig1.jpg">こちらをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。

<ol><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22The+development+of+the+rat+spinal+cord%22">The development of the rat spinal cord</a>. , (1984).</li>
<li>Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPlaczek%2C+M+%22Methods+in+molecular+biology%22">Methods in molecular biology</a>. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).</li>
<li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li>
<li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li>
<li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li>
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<li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li>
<li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li>
<li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li>
</ol>

このアッセイを行うに成功したかどうかを判断する重要な要因が最初に、組織があまりにも長時間ディスパーゼで処理されるべきではないされ、そのような治療は、組織が非常に粘着性と生存率の減少となることになります。二、コラーゲンは完全にプライムし、可能な限り氷上で保存する必要があります。それが設定を開始する場合は、処理することはますます困難になる、ピンクターンすなわち。三つは、タングステンの針は常に非常にシャープに保つ必要があります。

胚脊髄交連軸索アンテナの向きに拡散性のシグナル伝達分子の能力を検定する

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

脊椎動物の脊髄1の背側交連軸索は軸索ガイダンスシグナルを識別するための貴重なモデルシステムとなっている。ここで、我々は、in vitroアッセイ、交連軸索の方向2に外因性と内因性シグナルの効果を研究するために広く用いられている&quot;方向転換アッセイ&quot;、 で説明します。このアッセイは、ジェーンドッド、トーマスJessellとアンドリューラムズデンの研究室で多数の人々によって開発されました（詳細については、確認応答を参照）、このアッセイのバージョンがでchemorepellent BMPを含む、主要な軸索ガイダンス分子の再配向の活動を示すために使用された屋根板3,4と脊髄での床の板でNetrin1 5とソニックヘッジホッグ（Shh）6 chemoattractive活動。 脊髄の背側三分の二の2-3のセグメントを構成する外植片は、胎生（E）11ラットから切除し、三次元コラーゲンゲル7で培養される。 E11背側脊髄外植片は、糖タンパク質、Tag1に8の彼らの軸索の表現によって識別することができる新たに生まれた交連ニューロンが含まれています。文化30〜40時間かけて、交連軸索の軌跡は、 生体内で見られるのと同様のタイムコースでこれらの背側外植片にrecapitulatedている。この軸索軌道は、テストの組織または背側外植片の側縁の一つと接触して候補シグナル伝達分子を発現するCOS細胞の集合のどちらかを置くことによって挑戦することができます。追加された組織の近傍に延在する交連軸索は、内因性の屋根板と異所性の側面組織からの信号の両方の影響を受けて成長します。交連軸索は、これらの状況下でreorientedされる程度を定量化することができる。このアッセイを使用して、それは両方が交連軸索3,4と同様交連軌道9を指示するためにこの信号のための必要性を新しい方向に向けるために特定の信号の十分性を調べることが可能です。

このアッセイは、交連軸索の向きを変更、シグナル伝達分子、ここに骨形成タンパク質7（BMP7）の能力を評価する。胚の背側脊髄の外植片は、COS細胞の分泌候補増殖因子の集合体に隣接して培養する。外植片の中で成長しているReoriented交連軸索は、免疫組織化学により可視化。

脊椎動物の脊髄における背側交連軸索は、軸索誘導シグナルの特定において極めて有用なモデル系となってきました。本研究では、我々は…

ラット胚から背側脊髄の外植片を切り出し、3次元コラーゲンゲル内で培養し、候補となるシグナル分子を発現させた細胞を対置させます。背側脊髄外植片内で成長する軸索を再配向させるシグナル分子の能力を、免疫組織化学を用いて評価します。こんにちは。私は南カリフォルニア大学生物科学科のサマンサ・バトラー研究室のバージニア・ヘイゼンです。同じくバトラー研究室のキース・ファンです。そして、バトラー研究室のケン・ヤマイです。本日は、コラーゲンマトリックス内での背側脊髄インプラントおよびトランスフェクションしたコスト細胞の凝集体の培養手順をご紹介します。当研究室ではこの手順を用いて、候補となるリガンド分子が脊髄神経細胞を配向させる能力を評価しています。本実験では、骨形態形成タンパク質（BMP-7）が化学反発物質として機能するかどうかを検証します。それでは始めましょう。目的の分子である骨形成タンパク質（BMP7）の発現プラスミドを導入したco細胞から、comm choral軸索の走行を阻害するために使用するco細胞凝集塊を調製します。ディッシュから培地を吸引し、1 mLの1×PBSで細胞を洗浄します。PBSを除去し、0.5 mLの酵素フリー細胞解離培地を加えて15分間処理します。胎児牛血清を含む培地1 mLを添加して反応を停止させます。1000 µL ピペットチップを用いて、培養皿の表面に細胞が残らなくなるまで繰り返し回収します。細胞を15 mLコニカルチューブに移し、2分間遠心して細胞をペレット化します。2000 RPMで遠心した後、上清を除去し、ピペッティングして再懸濁させます。35 mm培養ディッシュの蓋の内側に、100 µLの培いを用い、細胞懸濁液を20 µLずつ複数箇所に滴下します。蓋を閉じてディッシュに被せ、インキュベーター内に数時間置き、細胞を凝集させます。背側脊髄インプラントを調製する場合は、採取直後の新鮮な状態で保持してください。氷上に置いたE 11ラット胚を用意する。L 15培地中で、研磨したタングステン針を用い、各胚の前肢芽の直下の体幹部から4〜6個の体節に相当する領域を切除する。プラスチックピペットを使用して、組織を4ウェルプレートの1ウェルに回収する。ディッシュを氷上に置きます。すべてのセグメントの解剖が完了したら、ピペットを用いて、L 15培地とジスクペーストを含む別のディッシュのウェルに断片を移します。組織を室温で5分以内にインキュベートします。細胞死を防ぐため、組織を消化しすぎないようにしてください。5%熱不活化ヤギ血清を含む新鮮なL 15培地 1 mLを、noディッシュの3番目のウェルに加えます。そして、組織片をこのウェルに転移します。ジススペースでのインキュベーション終了後、組織を氷上で1時間静置します。その後のマイクロ遠心チューブ内での解剖を容易にするため、10倍濃縮最小必須培地 40 µL をコラーゲン 360 µL に加えます。その後、ボルテックスで短時間混合し、ピコ遠心機でスピンダウンさせます。溶液は黄色になります。コラーゲンが凝固するのを防ぐため、可能な限り氷上で保持してください。コラーゲン溶液がわずかにオレンジ色になるまで、0.8 Mの炭酸水素ナトリウムを各コラーゲンのバッチに滴定します。添加するごとに溶液を混合してください。コラーゲン溶液がこの色になれば、氷上で保持している間は液状のままであり、室温に戻すと凝固する準備が整った状態になります。混合後に溶液がピンク色になった場合は、新しいコラーゲンのチューブを用いて最初からやり直してください。清潔な4ウェルプレートの各ウェルに、コラーゲンを20 µLずつ分注します。ピペットの先端を使用して、コラーゲンを広げて小さなパッド状にします。コラーゲンを室温で約10分間静置して固めます。解剖顕微鏡下で、新しく研いだタングステン針と精密ピンセットを用い、タングステン針で1つの胚の脊髄周囲の中胚葉を除去し、次に床板の存在によって識別可能な脊髄の腹側部分を除去します。腹側の最端にある底板は、背側の端にある蓋板よりもわずかに厚くなっています。この例では、脊髄の腹側を下にして置いています。底板と平行に注意深く組織を切断し、脊髄の腹側5分の1を廃棄してください。針を使用して、背側脊髄外植片を垂直に二等分します。切り口が可能な限りきれいになるようにし、必要に応じて再トリミングを行ってください。直径0.5mmのガラスキャピラリー管を装着した口ピペットを用いて、それぞれの外植片を別々のコラーゲンパッド上に転移させます。タングステン針を用いて、トランスフェクションしたco細胞の凝集塊を、背側脊髄の側縁とほぼ同じ幅の正方形に切り出します。口ピペットを使用して、切り出した正方形の一つをx explanを含むコラーゲンパッド上に転移させます。口ピペットを用いて、余分な液体を吸引して取り除きます。少量の液体がその後のコラーゲン塗布を容易にするため、吸引しすぎないように注意し、プライミング済みのコラーゲンを4 µLパッド上に塗布します。タングステン針を用いて、組織に直接触れないようにコラーゲンをインプラント上へと移動させます。コラーゲンの中で針を動かし、co細胞凝集塊が外縁に隣接するように各x explanの向きを調整します。コラーゲンを15〜20分間静置して凝固させます。次の胚に移る前に、組織培養フード内でさらに4 µLのコラーゲンを塗布し、x explanが完全にコラーゲンに包まれていることを確認します。0.5 mLの培地を加え、インキュベーター内で30〜40時間培養します。ドラフト内にて、0.5 mLのPBS調製4%パラホルムアルデヒド溶液を用いて外植体を45分間固定します。組織を氷上に保持したまま、0.5 mLのブロッキングおよび透過化溶液（PBTN）で2回洗浄します。x 外植片をブロッキング溶液中で 4 °C で、好ましくは一晩インキュベートします。ピンセットを用いて X 外植片を 4 ウェルプレートから切り出し、48 ウェルディッシュの各ウェルに 1 つずつ配置します。各ウェルに一次抗体を200 µLずつ加えます。comm choral軸索を可視化するにはマウスanti ttag抗体を使用し、細胞間のトランスフェクションが成功したかを確認するには、テスト対象の分子に対する抗体を含めてください。4 °Cで一晩インキュベートします。各サンプルをPBTNブロッキング溶液で、4°Cで1回1時間、計5回洗浄します。PBTNを除去し、各ウェルに二次抗体200 µLを加えます。退色を防ぐためアルミ箔で遮光し、4°Cで一晩インキュベートします。以前と同様に、サンプルをPBTNで5回洗浄します。各外植体を3ウェル凹型スライドに転送します。過剰な液体を除去し、Invecta Shield封入剤を滴下してカバーガラスで封します。顕微鏡で観察するまで、スライドを遮光フォルダまたはボックスに入れ、4°Cまたは-20°Cで保存します。ここで、培養、固定、染色を行い、共焦点顕微鏡で撮影したx外植片の代表的な画像を示します。パネルAは、白線で囲まれたroof plateのX外植片が、tag one陽性の脈絡神経軸索を自身から遠ざけるように方向転換させており、roof plateが軸索化学反発物質の供給源であることを示しています。パネルBは、M tactシグナル分子である骨形態形成タンパク質（BMP 7）を分泌するco細胞が、roof plateと同様に脈絡神経軸索を反発させることができることを示しています。発現プラスミドのみを分泌する細胞と共培養した軸索は、軸索の配向に影響を与えません。ここまで、脊髄のX explanを切り出し、配向させ、培養する方法、および細胞凝集塊を用いて候補となるシグナル分子に軸索再配向活性があるかどうかを判定する方法について説明しました。この手順を行う際は、コラーゲンを可能な限り氷上で保持し、explanをコラーゲンで完全に包み込み、培養液に直接触れないようにすることが重要です。最後に、軸索がx explanの腹側端まで伸展するのに必要な時間だけ培養してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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