Name: 血管新生の研究のために最適化されたフィブリンゲルビーズアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 学ぶフィブリンゲルビーズアッセイを用いた血管新生のin vitro研究法。内皮細胞をビーズに被覆し、フィブリンゲルに埋め込んで線維芽細胞を重層することで、血管新生の芽生えや管腔形成、分岐、吻合をタイムラプス観察できます。この再現性の高い手法は血管生物学研究に有用です。

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はPREPARING CELLS <ol><li> FBS /ペン - 連鎖球菌（1:100）1〜2日ビーズの前にM199/10％でHUVECと線維芽細胞を持ち出す。 </li><li> EGM - 2（Clonetics社）繊維芽細胞のために埋め込む前にHUVECと一日のためにビーズの前日に培地を切り替えます。 </li><li> 〜400 HUVECあたりビーズの濃度が必要です。 </li><li>よく20,000線維芽細胞が必要です。 </li></ol> HUVECでビーズコーティング - DAY -1 <ol><li> HUVECをトリプシン処理。 </li><li>ビーズが沈殿することができます（遠心分離機しないでください！）。上清を吸引除去し、暖かいEGM - 2培地1mLで簡単にビーズを洗浄する。 </li><li> FACSチューブに暖かいEGM - 2培地を1.5mLのミックス2500ビーズのw / 1 × 10 6 HUVEC。インキュベーター内に垂直に置きます。 （これは〜10ウェルのために十分になります。必要に応じてスケールアップ） </li><li>管ごとに20分を振って、37℃で4時間インキュベートする。 （グッドコーティングが発芽するために重要です。） </li><li> 4時間後、EGM - 2の5mLのでT25フラスコにコーティングされたビーズを転送し、O / Nを残す</li></ol> 0日目 - フィブリンゲルコーティングされたビーズを埋め込み<ol><li> 2.0 mg / mLのフィブリノーゲン溶液を（レシピの項を参照）を準備。 </li><li>フィブリノーゲン溶液にアプロチニン0.15単位/ mLを追加。 </li><li> 15mlのコニカルチューブにコーティングされたビーズを移し、ビーズは沈殿ができます。 EGM - 2と1.5mlの遠心チューブに移す液1mLに再懸濁し、ビーズ。 </li><li>ゆっくりと上下にペッティングによってEGM - 2液1mLで3倍ビーズを洗浄する。 </li><li>カバースリップ上ビーズを数えて、〜500ビーズ/ mLの濃度でフィブリノーゲン溶液に再懸濁します。 </li><li>各ウェルにトロンビンの0.625単位/ mLを追加。 </li><li> 24ウェルプレートの各ウェルにフィブリノーゲン/ビーズ懸濁液0.5 mLを加え。 各ウェルのピペットチップを変更する！ </li><li>ピペットの先端で軽く〜4〜5回上下に移動してからトロンビンとフィブリノゲンを混ぜる。大きな泡を作るように注意してください。 </li><li>フードで5分間プレートを残し、その後血栓を生成するために10〜15分間37℃のインキュベーターに入れてください。 </li><li>血栓を待っている間に、線維芽細胞をトリプシン処理。 </li><li> EGM - 2あたりも滴を1 mLを追加。 </li><li>ウェルあたり20,000細胞の濃度でフィブリンゲルの上にシードの線維芽細胞。 </li></ol> 注意： 通常、フィブリンゲルを形成する際には、ゲルに小さな泡が表示されます。心配しないで、彼らは3-4日で消えます。 すなわち、2日目、4、6、など、一日おきにメディアを変更する.. 3〜4日までに、発芽を確認して開始する必要があります。

<ol><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microcarrier-based+cocultivation+system+for+the+investigation+of+factors+and+cells+involved+in+angiogenesis+in+three-dimensional+fibrin+matrices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro.</a> Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).</li>
<li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).</li>
</ol>

in vitroでの血管新生アッセイにおける3次元（3D）は2Dの文化を使って達成できるよりも生体内で実際の環境にかなり近いですモデルを提供する成長コンセンサスがある。それは、優れた3Dシステムは再現性、及び血管新生の主要なステップのいくつかを模倣することができるはず明らかである。いくつかの以前の3Dアッセイが開発されているが、これらの多くは、いずれかを使用して、ハードを取得するために微小血管細胞を、または唯一のステージのいくつかを再現。このビデオでは、我々は説明し、血管​​研究で容易に入手し、最もよく使用されるECであるヒト臍帯静脈ECを利用したin vitroでの血管新生アッセイに最適化を実行。アッセイは、数日間にわたって、一貫して偏光ECに囲まれて透明な、特許細胞間ルーメンで長い船を再現。後でEC分岐と血管の融合（吻合）の段階でも観察されています。重要なことは、これらの培養でHUVECは発芽、遊走、整列、増殖、管腔形成、分岐と吻合を含め、in vivoまたはin vitroでのどちらか、微小血管ECで見られる形態学的変化のすべてを受ける。 HUVEC変化の遺伝子発現プロファイルは、並行して、より密接に微小血管ECのそれと一致する。結論として、我々はin vitroでの血...

<table><tbody><tr><td>Cytodex-3 ビーズ</td><td>試薬</td><td>Amersham</td><td>17-0485-01</td><td>10 g/ボトル。1. 乾燥ビーズ 0.5 g を 50 mL の PBS (pH = 7.4) で室温で 3 時間以上水和・膨潤させる。50 mL チューブを用い、ロッカー上に設置する。2. ビーズを沈殿させる（約 15 分）。上清を捨て、新しい PBS (50 mL) で数分間ビーズを洗浄する。3. PBS を捨て、以下の濃度の新しい PBS に置換する：25 mL -&amp;gt; 20 mg/mL =&amp;gt; 60,000 beads/mL または 50 mL -&amp;gt; 10 mg/mL =&amp;gt; 30,000 beads/mL。4. ビーズ懸濁液をシリコン処理ガラス瓶（Windshield Wiper または Sigmacote）に入れる。5. 115&amp;#x00B0;C で 15 分間オートクレーブ滅菌する。6. 4&amp;#x00B0;C で保存する。</td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1153</td><td>10 mg/ボトル。凍結乾燥アプロチニンを脱イオン水を用いて 4 U/mL に再構成する。滅菌フィルターを通す。1 mL ずつ分注する。-20 &amp;deg;C で保存する。</td></tr><tr><td>フィブリノゲン I 型</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8630</td><td>1 g。フィブリノゲンを DPBS に 2 mg/mL で溶解する。凝固可能タンパク質 % を確認し、適宜調整する。37 &amp;#x00B0;C のウォーターバスで加熱してフィブリノゲンを溶解させる。チューブを転倒させて混ぜる。ボルテックスは行わない。0.22 µm フィルターで滅菌ろ過する。</td></tr><tr><td>トロンビン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3399</td><td>22 mg = 1,000 units。滅菌水を用いて 50 U/mL に再構成する。0.5 mL ずつ分注する。-20 &amp;deg;C で保存する。</td></tr></tbody></table>

血管新生の研究のために最適化されたフィブリンゲルビーズアッセイ

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

血管新生は血管新生の刺激に応答して、新しい血管が既存の血管系から作成される、複雑なマルチステップのプロセスです。これらの手順は次のとおりです。基底膜の分解、細胞外マトリックスへの内皮細胞の増殖と移行（萌芽）（EC）、コードへのECのアラインメント、分岐、管腔形成、吻合、および新たな基底膜の形成を。 in vitroアッセイの多くは、このプロセスを研究するために開発が、ほとんど唯一の血管新生の特定の段階を模倣し、形態学的アッセイ内の血管が頻繁にin vivoで血管似ていないされています。 NehlsとDrenckhahnによる以前の仕事に基づいて、我々は、ヒト臍帯静脈ECと線維芽細胞を利用したin vitroでの血管新生アッセイに最適化されている。このモデルのすべての血管新生の主要な初期段階の反復するとは、重要なことは、血管が偏ECに囲まれた特許細胞間ルーメンを表示します。 ECはcytodexマイクロキャリア上に塗布し、フィブリンゲルに埋め込まれている。線維芽細胞は、それらがECはビーズの表面から発芽促進に必要な可溶性因子を提供するゲルの上に積層されている。数日後、数多くの血管が簡単に位相コントラストとタイムラプス顕微鏡で観察できる存在です。このビデオでは、これらの培養物をセットアップする重要なステップを示しています。

このビデオでは、血管新生の反復するいくつかの段階そのin vitroでの血管新生アッセイのプロトコルを示しています。タイムラプス発芽の画像、管腔形成、分岐と吻合 - 血管新生の主要な機能は - 示されています。

血管新生は複雑な多段階のプロセスであり、血管新生刺激に応答して、既存の血管系から新しい血管が形成されます。これらの...

こんにちは、Mar Katsuです。カリフォルニア大学アーバイン校の分子生物学・生化学科、Hughes研究室に所属しています。ここではフィブリンビーズアッセイを実施します。全工程の完了には2日かかります。1日目は、ビーズに陰茎またはヒト臍帯静脈内皮細胞をコーティングさせます。2日目は、これらのコーティング済みビーズをフィブリンゲルに埋め込み、その後、ゲルの上に線維芽細胞を層状に配置します。このアッセイを用いて、in vitro環境における血管新生の多くの段階を研究します。第1部の初日は、CY X three Beadsを使用します。そして2日目に、フィブリノゲン、トロンビン、アプロチニンcytxの3つの試薬を使用します。3番目のビーズはAmazon Biosciences社製で、内皮細胞がビーズに付着するように、特にコラーゲンコーティングが施されています。次の試薬はSigma社から入手したフィブリノゲンです。これはビーズアッセイにおいて、実際のゲルまたは凝固塊を形成します。トロンビンは凝固因子です。このタンパク質はフィブリノゲンをフィブリンに変換するため、本アッセイに添加します。アプロチニンは血清プロテアーゼ阻害剤です。プロテアーゼによるフィブリンゲルの分解を防ぐためにこれを使用します。ここで見えているのがVACです。これらはビートアッセイに使用する細胞です。これらの細胞は、継代3回目（passage 3）のものです。通常、継代2回目から3回目の細胞を使用します。このように、細胞が特徴的な石畳状（cobblestone）の形態を示していることがわかります。現時点で、これらの細胞はコンフルエント（100%）の状態にあると考えられます。このコンフルエンス状態で細胞を使用してください。これがB2アッセイの1日目の手順です。基本的には、このようにチューブを数回反転させ、ビーズを懸濁させます。この操作を20分ごとに4時間繰り返します。以上で手順はほぼ完了です。さて、本日はAbアッセイの2日目であり、これらのビーズには内皮細胞がコーティングされたところです。ここで示しているのは、基本的にコーティングされていないビーズと、コーティングされたビーズとの違いを強調したものです。左側は明らかにコーティングされていないビーズです。ビーズ表面の凹凸で判断できます。コーティングされたビーズは、ミニゴルフボールのような見た目になります。分布を確認してください。蜂はかなり均一に配置されています。コーティングされていない蜂が見当たらない状態である必要があります。あのような個体が1、2匹見られるかもしれませんが、大部分、おそらく99%はコーティングされているはずです。これらはインキュベーターで一晩培養したビーズです。ここから、ビーズを含む培地を50 mLコニカルチューブに移します。次に、PL

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血小板接着カスケードには、せん断流の存在下で、従来の（静的）ウェルプレートアッセイでは考慮されていない要因を行われます。この記事の生理的せん断流れの条件をエミュレートするマイクロ流体ウェルプレートフォーマットを利用した血小板凝集アッセイに関するレポート。...

マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

このビデオでは、血管新生の初期段階における内皮の発芽を研究するために、周皮細胞を組み込んだ改良型マイクロキャリアビーズベースのアッセイを実演しています。このアッセイは、血管新生の分子メカニズムと抗血管新生治療薬の効果を理解するためのin...

初期血管新生評価のためのビーズスプラウティングアッセイ:周皮細胞の存在下での内皮スプラウティングを研究するためのインビトロビーズベースモデル

時間経過顕微鏡と画像処理技術は、48時間の期間にわたって環境制御バイオリアクターにおける線維芽細胞媒介ゲル圧縮およびフィブリン線維再調整を観察し、分析するために使用された。...

線維芽細胞媒介フィブリンゲル圧縮の観察と定量

&gt;jove_content&lt;局所的な血管新生を刺激する臓器特異的微小環境の再現は、損傷した組織の正常な再生に不可欠です。本報告は、成体マウスにおいて、肺特異的微小環境が血管新生と肺胞再生をどのように調節するかを探るために、生きたマウスの肺表面にフィブリンゲルを移植する新しい方法を示すものである。...

肺特異的血管形成を研究するためにマウスの肺にフィブリンゲルの移植

がん細胞をコラーゲンゲルに包埋し、その後、無細胞フィブリンゲルに挟み込むことで、浸潤性と衛星腫瘍の形成をモニタリングできる3D培養システムを生成します。...

癌細胞の浸潤や衛星腫瘍形成を探検するための三次元培養アッセイ

新規体外ビーズ アッセイをこのプロトコルより適切に体内の血管を組み込むことによって血管新生を萌芽の過程をモデル化します。この変更により、血管内皮細胞と血管新生に重要な壁画と有性の細胞間相互作用をより忠実に再現するビーズ...

ペリサイトの発芽アッセイ内皮細胞ビーズを組み込む

ここでは、三次元のネイティブの組織特性と ex vivo 文化患者由来, 外科的切除, 線組織を用いて増殖糖尿病網膜症の病態を検討するためのプロトコルを提案する.Ex vivo...

増殖糖尿病網膜症における線合併症の体外培養モデル

この方法は、標準化されたマイクロ流体プラットフォームにおける40の浸透した3Dマイクロ容器としてiPSC由来内皮細胞の培養を記述する。このプラットフォームは、アナストモシスや、スケーラブルで高スループットな方法での血管新芽の安定化を含む、3Dでの勾配駆動血管新生芽芽の研究を可能にします。...

iPSC由来内皮細胞の浸透した3D血管新生発芽をインビトロで研究するための標準化およびスケーラブルなアッセイ

ここで紹介する方法は、in vivo...

血管新生研究のための改変 In Vivo マトリックスゲルプラグアッセイ

機械的に単離された間質血管画分(SVF)とフィブリンハイドロゲルの組み合わせは、組織工学や創傷治癒目的など、さまざまな適応症で生存脂肪由来の間質細胞の容易で効率的なキャリアを提供します。ここでは、トランスレーショナルリサーチおよび臨床応用のための機械的SVF(mSVF)-フィブリンハイドロゲルコンストラクトの調製について紹介します。...

機械的に単離されたStromal Vascular画分およびFibrinのヒドロゲルの組合せ:処理のプロトコール

フィブリノーゲン-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による Sipunculus nudus における活性フィブリノゲン分解剤の迅速な分離と表示

学ぶフィブリンゲルビーズアッセイを用いた血管新生のin vitro研究法。内皮細胞をビーズに被覆し、フィブリンゲルに埋め込んで線維芽細胞を重層することで、血管新生の芽生えや管腔形成、分岐、吻合をタイムラプス観察できます。この再現性の高い手法は血管生物学研究に有用です。

血管新生の研究のために最適化されたフィブリンゲルビーズアッセイ

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