酵母の菌タイプIIIエフェクターの発現により誘導される増殖阻害表現型の同定

このプロトコルを開始するには、目的の細菌エフェクターを発現させるためのベクターを選択します。酵母および酵母株において、このベクターを酵母細胞に形質転換します。次に、エフェクターの発現を誘導します。

誘導された細胞を溶解し、その後のウェスタンブロット解析によってエフェクターの発現を確認します。エフェクターの発現を確認した後、細胞を培養し、10倍段階希釈して抑制培地および誘導培地にスポットします。最終的に、2〜3日後に酵母の増殖を解析します。

こんにちは。テルアビブ大学植物科学科のGuido Cesa博士の研究室に所属しているDo Solomonです。本日は、酵母における細菌のIII型エフェクターの発現によって誘導される成長抑制表現型の同定手順についてご紹介します。当研究室では、グラム陰性病原細菌由来のIII型エフェクターの機能を研究するためにこの手順を用いており、エフェクターTICターゲットの同定に役立つツールとして活用しています。

それでは始めていきましょう。目的のIII型エフェクターの発現に適した酵母システムを構築する際は、いくつかの重要な要因を検討し、最適化する必要があります。まず第一に、エフェクターの発現を制御するプロモーターが挙げられます。

細菌のIII型エフェクターは酵母細胞に対して毒性を持つ可能性があるため、その発現を制御するために誘導性プロモーターを使用する必要があります。本実験では、GAL1プロモーターを使用します。2つ目の要因は、エフェクター遺伝子のコピー数です。

エフェクター遺伝子を2ミクロンプラスミドに組み込むことで、高発現レベルを達成できます。セントロマー含有プラスミドを使用すると中程度の発現が得られ、相同組換えによってエフェクター遺伝子を酵母ゲノムに組み込んだ場合は低発現となります。また、検討すべき3つ目の要因は、目的のエフェクターに対する抗体が利用できない場合に、タンパク質発現を確認するために使用するエピトープタグです。

一般的に使用されるタグには、信頼性の高い市販抗体が存在するMヘマグルチニン HAやflagなどがあります。エフェクタータンパク質の構造や活性への望ましくない悪影響を最小限に抑えるため、タグは1コピーのみ使用することを推奨します。最後に、発現に使用する酵母株は、発現ベクターの選択マーカーに対して感受性である必要があります。

形質転換用の酵母細胞を培養するため、新鮮なプレートから酵母コロニーをピックアップし、15 mLのポリプロピレンチューブに入れた3 mLのYPDに接種してボルテックスします。培養チューブをローラーに短時間設置し、30 °Cで定速回転させながら一晩インキュベートします。翌朝、ローラーから培養液を取り出し、室温で800 Gsで5分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を完全に除去し、1 mLのResus懸濁緩衝液に細胞を再懸濁させ、最大速度で約10秒間ボルテックスして混合します。形質転換させる各プラスミドおよび追加のコントロール形質転換用に、細胞懸濁液100 µLをマイクロ遠心チューブに移します。コントロール用チューブを除き、各チューブに一本鎖サーモン精子DNA 5 µLとプラスミドDNA 250～500 ngを添加します。

次に、各チューブに形質転換溶液を650 µLずつ注意深く加え、ボルテックスで攪拌します。チューブをローラーに載せ、30 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション完了後、各チューブにDMSOを70 µL加え、細胞の破壊を防ぐため、チューブを10〜15回反転させて混合します。

チューブをボルテックスしないでください。チューブを42 °Cに予熱したウォーターバスに入れ、15分間インキュベートします。15分後、チューブをウォーターバスから取り出し、直ちに氷上に2分間置きます。

チューブが冷却されたら、遠心分離によって細胞を回収し、ピペッターを用いて粘性の高い上清を注意深く取り除きます。各ペレットを150 µLの滅菌2回蒸留水で再懸濁し、適切な選択培地を用いたプレート上に細胞懸濁液を塗布します。プレートを2分間開放し、ラミナーフローフード内で乾燥させます。

その後、プレートを30 °Cのインキュベーターに2〜3日間置き、酵母細胞を培養します。タンパク質抽出液を調製するため、新鮮なプレート上の酵母コロニーを3 mLの適切な抑制培地に接種し、ボルテックスで混合します。翌日、培養チューブを30 °Cのローラーに短時間置きます。

ローラーから培養物を回収し、室温で800 Gsにて5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを再懸濁します。ボルテックスで混合した3 mLの滅菌DDWに加え、再度遠心分離し、上清を捨てて細胞を3 mLの滅菌DDWに再懸濁します。次に、細胞懸濁液200 µLを、適切な誘導培地3 mLが入った新しい15 mLチューブに移し、ボルテックスで混合します。

チューブをローラーに設置し、30 °Cで一晩インキュベートし、翌朝に回収します。培養液1 mLを、低密度培養の場合はそれ以上の量を、マイクロ遠心チューブに移します。室温で800 Gsにて5分間遠心分離して細胞を回収します。ここから先は、毒性のあるBeamer captoエタノール蒸気の吸引を避けるため、ドラフトチャンバー内で作業を行ってください。

ピペッターを用いて上清を慎重に取り除き、細胞ペレットを100 µLの氷冷した溶解液に再懸濁します。ボルテックスで激しく撹拌し、氷上で30分間インキュベートしてください。この30分間のインキュベーション中に、100 µLの溶解緩衝液をpH 9から10まで滴定するために必要な希塩酸の量を決定します。

これを行うには、10本の異なるチューブに100 µLの溶解バッファーを入れ、それぞれに異なる量の塩酸を加えます。適切な量の塩酸を溶解液に加えてボルテックスで混合した後、インキュベーション終了時にpH試験紙を用いて溶液のpHを確認します。次に、50 µLの3倍試料バッファーを溶解液に加えてボルテックスで混合し、針でマイクロ遠心チューブの蓋に穴を開け、ヒーティングブロックで5分間溶解液を沸騰させます。沸騰後、室温で2分間放置して溶液を冷却させます。

次に、溶出液をボルテックスミキサーで撹拌し、10秒間遠心分離します。これで、スポットアッセイ用の細胞を準備するための免疫血液分析に使用できる溶出液が完了しました。翌日、前述の手順に従い、各菌株を3 mL培養します。

ロイシン欠損合成完全培地を含むプレートを2枚準備します。一方のプレートの培地には2%glucoseを添加し、もう一方のプレートの培地には2%actoseと1%raffinoseを添加します。プレートを滅菌ラミナーフローフード内で室温で20分間乾燥させます。

細胞を回収し、各細胞ペレットを3 mLの滅菌DDWに再懸濁します。遠心分離ステップを繰り返し、細胞を再度3 mLの滅菌DDWに再懸濁します。各培養液の吸光度（OD）を測定し、滅菌マイクロチューブにOD 600が1となるよう1 mLの細胞懸濁液を調製します。

次に、900 µLの滅菌DDWを入れた3本の滅菌マイクロチューブを用いて、それぞれの細胞懸濁液から10倍段階希釈を3段階分調製します。乾燥させたプレートをグリッド上に配置し、各培養スポットに対し、4段階目の希釈液を10 µLずつ一列に分注します。スポット後、プレートをフード内で数分間開放したままにします。

スポットが乾燥したら、プレートに蓋をして30 °Cのインキュベーターに2〜3日間置きます。次に、増殖抑制を検出するための酵母スポットアッセイの結果を示します。ここでは、細菌のIII型エフェクターであるAVR Pto hop, Avr AA11、および AVR RE1の発現によって誘導された表現型を示しています。

トマトのPseudomonas Riner経路の因子を、抑制培地上の酵母株においてセントロメア含有プラスミドから発現させた。A-V-R-P-T-OおよびHOP AA11の発現用プラスミドを保持する酵母株は、空ベクターを含むコントロール株と同様の増殖を示した。AAV RE1を保持する酵母では、おそらくGAL1プロモーターのリークおよびAV RE1の高い細胞毒性により、わずかに増殖が低下した。誘導条件下では、AV E1またはHOP AA11のいずれかを発現させると、あらゆる希釈段階でコロニーが消失するという劇的な増殖抑制表現型が引き起こされた。対照的に、A-V-R-P-T-Oの発現は、増殖抑制効果を全く及ぼさなかった。

酵母において細菌のIII型エフェクターの発現によって引き起こされる増殖抑制表現型を同定する方法について説明しました。この手順を行う際は、発現ベクターと菌株の両方が結果に劇的な影響を与える可能性があるため、これらを慎重に選択することが重要です。さらに、手順のすべてのステップにおいて、形質導入した直後のコロニーを使用することを忘れないでください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。