Name: COS - 7の蛍光標識は、生細胞イメージングのためにSNAP - Tag融合タンパク質を発現する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶSNAP-Tag融合タンパク質を用いたCOS-7細胞の蛍光標識法。生細胞イメージングでタンパク質の局在と動態を可視化し、細胞生物学研究に有用な手法を提供します。

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カイヨーンソン イヴァンコレア アンドレアスブレヒト カトリンMüentener クリスのれん 羅日 明許 セオドアデイビス サルヴァトーレRussello 愛華張 インカゴーシュ エリッサMaunus ニコラスラバルト ジェームズマクファーランド ジョンバスウェル ブレンダデズモンド ジェームズエラード ドンコーム

メッキCHO - K1細胞： <ol><li> F - 12Kの完全の6ミリリットルの標準プロトコールに従ってトリプシン処理されているCHO - K1細胞を50 -100μLを加える。 </li><li>その後、上下に数回ピペッティングして混合細胞懸濁液、＃1.5ホウケイ酸カバーガラスチャンバー（NalgeneヌンクのIntと滅菌8室のLab - Tek社IIチェンカバーガラスの各ウェルにトリプシン処理細胞懸濁液のアリコートを300μl;商品＃155409;ロット：100808-8-0）。 </li><li> 37℃、5％CO 2で一晩試料をインキュベートする。 </li></ol> pSNAP - ADRB2とpSNAP - H2BとCHO - K1細胞のトランジェントトランスフェクション： <ol><li>細胞密度と健康を探すために前日に播種された細胞培養チャンバーを確認してください。 </li><li>マイクロチューブの適切な数のラベルを付けます。 </li><li>層流フードでは、トランスフェクション複合体混合物は、0.3μgのpSNAP - ADBR2コントロールプラスミドDNAまたはpSNAP - H2BのコントロールプラスミドDNA、TransPassのD2を1μlとTransPass V 1μlの0.3μgのいずれかを使用して、次のサンプルチャートに基づいて設定反応あたり。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td>プラスミド</td><td>反応の数</td><td>無血清培地の液</td><td> TransPass D2の液</td><td> TransPass Vの添加</td><td>プラスミドDNAの添加</td><td> TransPassのD2/reactionμlの</td><td> TransPass V /反応の液</td><td> DNA /反応のNG </td><td> DNAコンク。 （ng /μlに） </td><td>プラスミドDNA /反応μlの</td></tr><tr><td> SNAP - ADRb2 </td><td> 5 </td><td> 236.5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472.34 </td><td> 0.7 </td></tr><tr><td> H2B - SNAP </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515.89 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td>モック</td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td>トランスフェクトされていない</td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li>最初に、適切なプラスミドDNAを無血清F - 12K混ぜ、その後TransPass Vトランスフェクション試薬を追加し、TransPass D2フェクション試薬を加える。各試薬の添加後、穏やかに数回ピペッティングでよく部品を混ぜる。 </li><li> 30分間室温で反応します。 </li><li>インキュベーションの間、完全DMEM600μlので細胞を1回洗浄し、各サンプルに完全DMEM 450μlを加える。 </li><li>ゆっくりと滴下方式で、各サンプルにトランスフェクション複合体混合物の50μlを追加。 </li><li> ° C、5％CO 2 37℃で一晩サンプルをインキュベートする。 </li></ol>一過性pSNAP - ADRB2とpSNAP - H2BでトランスフェクトしたCHO - K1細胞のSNAP -セルのTMRのスターラベル： <ol><li>慎重に真空吸引することにより、各サンプルからトランスフェクション複合メディアを削除します。 F - 12Kの完全な600μlで細胞を2回洗浄し、F - 12Kの完全な600μlで各ウェルの培地を交換してください。 </li><li>完全なF - 12Kと51μlの0.6 mMのSNAP -セルTMR -スター基板の995μlを添加して色素のラベリングのメディアを混在させる。 SNAP -セルのTMR - Starの最終濃度は、3mmにする必要があります。基質添加後混合して数回上下にピペッティング。 </li><li>慎重にサンプルから増殖培地を除去し、各ウェルに色素ラベリングメディアの200μlを加える。 37サンプルをインキュベート° C、30分間、5％CO 2を 。 </li><li>完全なF - 12Kの10mlに、サンプルはインキュベートされているが、ヘキスト33342、三塩酸塩、三水和​​物（Invitrogen社Molecular Probes社水に10 mg / mlの溶液を、16.2 mM溶液）1μlを混合して試料の核染色用にHoechst 33342を溶液を調製。 </li><li>すべてのサンプルからメディアを取り出して、各サンプルの希釈ヘキスト溶液を600μlずつ加える。 37サンプルをインキュベート° C、5分間、5％CO 2を 。 </li><li> F - 12Kの完全な600μlのサンプルを3回洗浄する。 </li><li> 37サンプルをインキュベート° C、5％非法人の蛍光物質が細胞外に拡散するようにさらに30分間CO 2。 </li><li> 30分後、最後にもう一度は、SNAP -細胞サンプルにメディアを変更し、画像処理に進みます。 </li><li>ツァイス線分Axiovert 200M蛍光顕微鏡を用いて画像の細胞。 </li></ol>代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1ここです。SNAPタグ融合を表現しているライブCOS - 7細胞の標準的な蛍光顕微鏡を用いた蛍光イメージングのいくつか代表的な結果。この最初のイメージはSNAP -セルTMR -スターで標識pSNAP - H2Bを（ヒストン核）を発現するライブCOS - 7細胞を示しています。 pSNAP - H2BコンストラクトはpSNAP -タグ（m）のベクトルを用いて生成されました。細胞を30分間SNAP -セルのTMR -スターで標識し、核についてはヘキスト33342（青）で対比染色した。ピンクの蛍光は、ヒストンタンパク質が核を示す青色の蛍光に加えて存在する赤色蛍光のオーバーレイを示しています。 H2Bタンパク質の発現は、明確かつ容易に識別されます。 <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図2と図3。次の2つは画像が一時的にpSNAP -ADRβ2でトランスフェクトしたライブCOS - 7細胞を示す。 細胞は、SNAP -セルTMR -スター（赤）で標識し、ヘキスト33342（青）で対比染色した。 pSNAP -ADRβ2コンストラクトはpSNAP -タグ（m）のベクトルを用いて生成されました。細胞を30分間SNAP -セルのTMR -スターで標識し、核についてはヘキスト33342（青）で対比染色した。青色の蛍光が核を識別しながら、赤色の蛍光は、細胞表面の受容体タンパク質のADRB2の存在を示している。

<ol><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li>
<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP-tag+Technologies%3A+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function%5BTitle%5D)+AND+%22NEB+Expressions%22%5BJournal%5D)">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li>
</ol>

著者らは、この記事で使用する試薬や器具を生産するニューイングランドバイオラボで採用されています。

フルオロフォアの光安定が退色する前に捕捉されている必要がありますどのように迅速に蛍光を決定するような焦点、レーザー強度、機器の機能、レンズが使用される、などの観測結果に影響を与えるいくつかの変数があります。 タンパク質標識のこの方法は汎用性と、多くのアプリケーションに適しています。合成プローブとの融合タンパク質の特定のラベルのためのSNAP - tagとCLIPタグ技術が生きている細胞で、細胞溶解物の動的なプロセスのさまざまなを含むタンパク質の機能のさまざまな側面を、有効にしてください。 SNAP -、CLIP -、MCP -およびACP -タグ技術は、ライブと固定された細胞中のタンパク質のイメージング、およびin vitroでのタンパク質の研究にシンプルさと異常な汎用性を提供します。単一の遺伝子コンストラクトの作成は、蛍光色素、ビオチン、またはビーズを含む官能基、のさまざまな共有結合を形成することができるタグ付き融合タンパク質が得られます。目的のタンパク質をクローニングし、発現し一度だけして、融合はそのような生細胞内の同時タンパク質標識、タンパク質の局在や転座、パルス - チェイス実験、受容体の内在化の研究など、数多くのダウンストリームアプリケーションのための蛍光基質の様々で使用することができますする必要があります。 、選択的な細胞表面のラベリング、タンパク質はアッセイ、SDS - PAGEにおけるタンパク質の検出、フローサイトメトリー、高スループットのマイクロタイタープレートに結合アッセイ、バイオセンサーの相互作用の実験、およびFRETに基づく結合アッセイをプルダウン。

<table><tbody><tr><td>CHO-K1細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>無血清F-12K培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II チェンバー付きカバーガラス（#1.5ホウケイ酸カバーガラスチェンバー）</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td>ロット番号: 100808-8-0</td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342 三塩酸塩 三水和物（水溶液 10 mg/ml、16.2 mM溶液）</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>470519</td></tr><tr><td>Zeiss Apotome Axiovert 200M 蛍光顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transpass V</td><td>New England Biolabs</td><td>M2561S</td><td>0030709</td></tr><tr><td>Transpass D2</td><td>New England Biolabs</td><td>M2554S</td><td>0060802</td></tr><tr><td>SNAP-Cell TMR Star</td><td>New England Biolabs</td><td>S9105S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>pSNAP-ADBR2 コントロールプラスミド</td><td>New England Biolabs</td><td>N9178S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>pSNAP-H2B コントロールプラスミド</td><td>New England Biolabs</td><td>N9179S</td><td>0010811</td></tr></tbody></table>

cos - 7の蛍光標識は、生細胞イメージングのためにsnap - tag融合タンパク質を発現する

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP - tagとCLIP -タグタンパク質のラベリングシステムは生細胞で目的のタンパク質に、蛍光色素を含む分子の特定の、共有結合を、有効にしてください。これらのシステムは、イメージング計測の範囲に最適化された蛍光基質の幅広い選択を提供する。一度クローン化と発現し、タグ付けされたタンパク質は、再度クローンを作成することなく、多くのダウンストリームアプリケーションのための基板の様々な使用することができます。このシステムを使用する2つの手順があります。SNAPタグ融合、及び選択肢のSNAP - tagを基板との融合のラベルとして、目的のタンパク質のクローニングおよび発現。 SNAP - tagは、人間のOに基づいて小さなタンパク質である<sup&gt; 6</supDNA修復タンパク質、（hAGT）&gt; - alkylguanine - DNA - alkyltransferase。 SNAPタグラベルは、ベンジルリンカーを介してグアニンに結合した染料またはピリミジン脱離基である。ラベリング反応で、基質の置換ベンジル基が共有結合SNAPタグに添付されます。 CLIP - tagはbenzylcytosineではなく、ベンジルグアニン誘導体と反応するように設計さSNAP - tagの修正版です。 SNAPタグと組み合わせて使用​​すると、CLIP - tagは、同じセル内で同時に2つのタンパク質の直交すると補完的なラベリングが可能になります。

SNAP - tagとCLIP -タグタンパク質のラベリングシステムは生細胞で目的のタンパク質に、蛍光色素を含む分子の特定の、共有結合を、有効にしてください。一度クローン化と発現し、タグ付けされたタンパク質は、再度クローンを作成することなく、多くのダウンストリームアプリケーションのための基板の様々な使用することができます。

COS - 7の蛍光標識は、生細胞イメージングのためにSNAP - Tag融合タンパク質を発現する

SNAP-tagおよびCLIP-tagタンパク質標識システムにより、蛍光色素を含む分子を標的タンパク質へ特異的かつ共有結合的に付加することが可能になります。

SNAPタグおよびCLIPタグ。タンパク質標識システムにより、実質的にあらゆる分子を目的のタンパク質に特異的に共有結合させることが可能です。目的遺伝子をタグ発現部位のいずれかの側にベクターにクローニングすることで、クローン遺伝子の発現によりSNAPタグ融合タンパク質が得られます。SNAPタグ基質は、SNAPタグによって認識されるベンゾグアニンと、機能性基の2つの部分で構成されています。機能性基には、ビオチン、ビーズ、またはさまざまな色の蛍光基などが利用可能です。ラベル化反応において、置換ベンゾ基がSNAPタグに共有結合し、グアニンが放出されます。目的のタンパク質にFluora 4が結合している場合、ラベルが蛍光を発するため、生細胞または固定細胞内でタンパク質を可視化することができます。こんにちは。New England Bile LabsのChris Provostです。本日は、SNAPタグ融合タンパク質を発現させた生きたCOS-7細胞の蛍光イメージングの手順をご紹介します。当研究室ではこの手法を用いて、細胞内におけるタンパク質の局在を研究しています。それでは始めましょう。トランスフェクションに向けてCos-7細胞を準備するため、標準的なプロトコルに従ってトリプシン処理し、50～100 µLの細胞を6 mLの完全DMEM培地に加えます。ピペッティングを数回繰り返し、細胞懸濁液を混合します。次に、トリプシン処理した細胞懸濁液 300 µLを、滅菌済みのLab-Tech 8チャンバー2チャンバーカバーガラスの各ウェルに分注します。サンプルを37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートし、翌日に移行します。細胞培養チャンバーを確認し、細胞密度と状態をチェックします。トランスフェクション複合体混合物用に、必要数のマイクロ遠心チューブにラベルを貼ります。ラミナーフローフード内で操作を行います。各反応用のトランスフェクション複合体混合液を調製します。無血清培地に溶解した0.3 µgのsnap fusionプラスミドDNAと、1 µLずつのTPAs D twoおよびTPAs vトランスフェクション試薬を使用します。トランスフェクション試薬の効率を評価するために、コントロールプラスミドが利用可能です。また、各複合混合物の陰性対照として、モックトランスフェクション試料、または未切除試料を含めることを推奨します。まず、無血清DMEMを適切なプラスミドDNAと混合します。次に、TPA-D2トランスフェクション試薬を加え、続いてTPA-Vトランスフェクション試薬を加えます。各試薬を添加した後、ピペッティングでゆっくりと数回混ぜ合わせ、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション中に、600 µLの完全DMEMで細胞を1回洗浄し、各サンプルに450 µLの完全DMEMを加えます。インキュベーションが完了したら、50 µLのトランスフェクション複合体混合液を各サンプルにゆっくりと滴下します。サンプルを37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。翌日、トランスフェクションしたCos-7細胞をSnap-Cell TMR*基質で標識します。この手順を開始するために、Snap-Cell TMR*基質に50 µLのDMSOを加え、ピペッティングまたはボルテックスミキサーで1分間混合します。次に、各サンプルからトランスフェクション複合体含有培地を吸引除去し、完全DMEM 600 µLで細胞を2回洗浄します。次に、各ウェルの培地を600 µLの完全DMEMに交換します。サンプルをインキュベーターに戻します。完全DMEM 995 µLと0.6 mMの溶液5 µLを加えて、D標識培地を調製します。基質を添加した後、Snap cell TMR star基質をピペットで数回吸い上げ、混ぜ合わせます。Snap cell TMR STARの最終濃度は3 µMとしてください。サンプルから培地を慎重に取り除き、各ウェルに200 µLのDIAラベル化培地を加えます。サンプルを37 °C、5% CO2条件下で30分間インキュベートします。このインキュベーション中に、TMR基質のベンジル基がSnap-tagに共有結合し、クエン酸が放出されます。サンプルの核染色用のHX溶液を調製します。1 µLのHSED 3 33 42 Tri Hydrochloride TRIを10 mLの完全DMEMに混合します。インキュベーションが完了したら、すべてのサンプルからラベル化培地を除去し、希釈したhook溶液を各サンプルに600 µLずつ加えます。サンプルを37°C、5% 二酸化炭素条件下で5分間インキュベートします。5分後、各サンプルから希釈したフック溶液を除去し、600 µLの完全DMEMでサンプルを3回洗浄します。最後の洗浄後、各サンプルに600 µLの完全DMEMを添加します。細胞内ラベリングを行うために、未結合のFluorが細胞外へ拡散するよう、サンプルを37 °C、5% carbon dioxideでさらに30分間インキュベートします。30分後、スナップセルサンプルの培地を最後に一度、600 µLの完全DMEMに交換します。これで、Zeiss AOME vert 200 M蛍光顕微鏡を用いたイメージングが可能な状態になります。以下は、タグ融合タンパク質を発現させた生きたCOS-7細胞を標準的な蛍光顕微鏡で観察した際の、代表的な蛍光イメージング結果です。最初の画像は、Snap-Cell TMR*で標識されたPNAP-H2Bを発現する生きたCOS-7細胞を示しています。PNAP-H2B構築物は、PNAP-TAG-Mベクターを用いて作製されました。細胞をsnap cell TMR starで30分間標識し、核を対比染色するためにHoechst 33342を用いました。ピンク色の蛍光は、ヒストンタンパク質が存在する部位の赤色蛍光のオーバーレイを示しています。核を示す青色蛍光に加え、H2Bタンパク質の発現が明確かつ容易に確認できます。続く2枚の画像は、pnapを一過性に導入した生きたcost seven細胞を示しています。A DR beta two細胞をsnap cell、tmr、starでラベルし、HUX 3 33 42で対比染色しました。pnap A DR beta two構築物は、PNAP TAG Mベクターを用いて作製されました。細胞をsnap cell TMR starで30分間標識し、核の対比染色としてhooks 3 33 42を用いました。赤色蛍光は細胞表面受容体タンパク質A DR beta twoの存在を示し、青色蛍光は核を同定します。以上で、snap tag融合タンパク質を発現する生きたcough 7細胞の蛍光イメージングの手順を説明しました。この手順を行う際は、トランスフェクション複合体をゆっくりと滴下するように加え、使用しないときはSNAPタグ基質を-20 °Cの暗所で保存することが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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